Транскрипционные и морфологические особенности предимплантационного эндометрия у женщин с привычным невынашиванием беременности Текст научной статьи по специальности «Клиническая медицина»

АКУШЕРСТВО

ТРАНСКРИПЦИОННЫЕ И МОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПРЕДИМПЛАНТАЦИОННОГО ЭНДОМЕТРИЯ У ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ

В.Е. Радзинский

Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов ул. Миклухо-Маклая, 8, Медицинский факультет, Москва, Россия, 117198

О.Н. Садекова, Д.А. Вознюк, Л.М. Самоходская, В.А. Ткачук

Кафедра биохимии и молекулярной медицины Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова Ломоносовский пр., 31-5, Москва, Россия, 119192

Т.Н. Рашидов

Клиника акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева ул. Еланского, 2, Москва, Россия, 119435

Е.М. Демидова

ООО «Высокие технологии медикал» ул. Петровка, 20/1, Москва, Россия, 127051

Л.А. Никитина

ООО «Университетская медицина» Ломоносовский пр-т, 31-5, Москва, Россия, 119192

Предимплантационное состояние эндометрия определяет наступление и дальнейшее развитие беременности. На основании изучения транскрипции факторов регуляции

ангиогенеза (УБОР, Р1ОБ, Лп§-1), фибринолиза (иРА) и ремоделирования внеклеточного матрикса (ММР-2) в эндометрии женщин с невынашиванием беременности в ранние сроки показано нарушение вышеуказанных процессов при данной патологии, более выраженное при дополнительном наличии у таких пациенток неполноценной секреторной трансформации эндометрия.

Ключевые слова: привычное невынашивание беременности, ангиогенез, недостаточность лютеиновой фазы.

Привычное невынашивание беременности (ПНБ) представляет собой полиэтиологический симптомокомплекс, в основе развития которого наиболее часто лежат инфекционные, эндокринные, иммунологические, анатомические и генетические факторы в различных сочетаниях.

По данным ВОЗ, частота данной патологии составляет 15-20% от общего числа беременностей, причем 75-80% выкидышей происходят на сроке до 12 нед. Почти у половины женщин выяснить причину ПНБ не удается. Трудности поиска причинного фактора можно объяснить, с одной стороны, полиэтиологичностью данного симптомокомплекса, а с другой - утратой значимости первичного этиологического фактора, поскольку основную роль в становлении симптомокомплекса ПНБ играют изменения в органах и системах макроорганизма, сформировавшиеся в результате воздействия первичного этиологического агента.

В последнее время интерес исследователей чаще обращается к изучению клеточно-молекулярных особенностей эндометрия у женщин с ПНБ. При этом основное внимание уделяется состоянию предимплантационного эндометрия, поскольку правильное прикрепление плодного яйца является залогом успешной беременности.

Эндометрий представляет собой многокомпонентную систему, структурной единицей которой является маточная железа с окружающими ее стромой и прилежащими сосудами. В ответ на воздействие яичниковых гормонов происходит процесс децидуализации эндометрия, включающий в себя изменения транскрипции большого числа генов, приводящие к быстрому нарастанию сосудистой проницаемости с развитием отека стромы в месте имплантации в строго определенный, короткий период репродуктивного цикла, называемый окном имплантации.

Во время имплантации происходит активное проникновение трофобла-ста в хорошо развитую сосудистую сеть эндометрия [1]. Необходимая для инвазии трофобласта перестройка экстрацеллюлярного матрикса (ЭЦМ) эн-дометриальной ткани регулируется матриксными металлопротеиназами (ММР), в частности ММР-2 и ММР-9 [3]. Причем в процессах ремоделирования базальной клеточной мембраны, являющихся неотъемлемой частью ангиогенных процессов, принимает участие именно ММР-2. Помимо ММР в

перестройке эндометриальной ткани принимают участие активаторы плаз-миногена. Связывание активатора плазминогена урокиназного типа (иРА) со своим растворимым рецептором (иРАЯ) приводит к активации плазминогена на поверхности клеток, что, в свою очередь, активирует ММР-2 и ММР-9, не влияя на активность других ММР.

Для обеспечения должного питания растущего эмбриона в пролифера-тивную фазу происходит активное развитие сосудистой сети эндометрия с участием таких ростовых факторов как сосудистый эндотелиальный фактор роста (УЕОБ), плацентарный фактор роста (РЮБ) и ангиопоэтин-1 (Ап§-1).

УЕОБ - основной специфический стимулятор пролиферации эндотелиаль-ных клеток и сосудистой проницаемости - поддерживает жизнеспособность незрелых сосудов. Наиболее значимое воздействие на ангиогенные процессы эндометрия оказывает УЕОБ, который продуцируется стромальными клетками в пролиферативную фазу. Активность УЕОБ коррелирует с активностью РЮБ. На стадии погружения бластоцисты в децидуальную оболочку УЕОБ определяется во всех эпителиальных клетках эндометрия, в то время как РЮБ обнаруживается только в отдельных участках возле места имплантации.

Другой группой ангиогенных факторов, присутствующих в эндометрии, являются ангиопоэтины, в частности Ап§-1, который увеличивает выживаемость пролиферирующих эндотелиальных клеток и способствует организации микрососудов. В раннюю и среднюю секреторные фазы, когда отмечаются наиболее активный рост и спирализация маточных артерий, Ап§-1 экспрессируется в железах верхнего слоя эндометрия, в просветном эпителии, гладкомышечных клетках стенки спиральных артерий и строме, окружающей кровеносные сосуды [4]. Учитывая вышесказанное, трудно усомниться в необходимости тщательного изучения предимплантационного эндометрия у женщин с ПНБ.

Целью данного исследования стало изучение транскрипции факторов регуляции ангиогенеза (УЕОБ, РЮБ, Ап§-1), фибринолиза (иРА) и ремоде-лирования внеклеточного матрикса (ММР-2) в эндометрии женщин с ПНБ в ранние сроки.

Материалы и методы. Основную группу составили 37 женщин (средний возраст 33 ± 4,2 года) с 2 и более эпизодами самопроизвольного прерывания беременности на ранних сроках (у 15,4% из них была диагностирована неразвивающаяся беременность). Средние сроки потерь беременности составили 6,5 ± 1,0 нед. В группу сравнения вошли 24 женщины (средний возраст 34 ± 5,2 года) с реализованной репродуктивной функцией, проходившие обследование в клинике акушерства и гинекологии по поводу вторичного бесплодия. Средний возраст менархе, длительность менструального цикла и продолжительность менструаций у исследуемых пациенток были сопоставимы и соответствовали физиологическим параметрам. Частота гинекологических заболеваний у женщин обеих групп существенно не различалась.

Критерием исключения из группы исследования явилось наличие признаков воспалительных процессов в эндометрии, пороки развития матки.

Забор материала. Исследуемые пациентки проходили стандартное клиническое обследование в клинике Акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева. У всех женщин проводили биопсию эндометрия за 5 дней до ожидаемой менструации (на 23-й день МЦ при продолжительности цикла 28 дней). Наряду с традиционной гистологической оценкой проводилось микробиологическое исследование эндометрия (посев на микрофлору), исследование на хламидии, ВПГ и ЦМВ методом ПЦР-диагностики, культуральное исследование на микоплазму и уреаплазму. На основании полученных данных делали заключение о функциональном состоянии эндометрия, наличии признаков хронического эндометрита и др. Пациентки с положительным результатом в любом из проведенных микробиологических исследований исключались из исследования.

Из образцов ткани выделялась тотальная РНК и проводилось построение цепи комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции. Изучение транскрипции выбранных генов (VEGF, PlGF, uPA, Ang-1, MMP-2) проводилось методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-time PCR) с использованием интеркалирующего красителя SYBR-green I (ЗАО «Синтол», Россия). Количественная оценка осуществлялась с использованием метода относительного количественного анализа (AACt). Статистическая обработка проводилась с использованием непараметрического критерия Mann-Whitney в статистическом пакете Statistica 6.0.

Результаты. При сравнении уровней транскрипции мРНК в группах женщин с ПНБ и с реализованной репродуктивной функцией были выявлены достоверные различия в транскрипции мРНК VEGF, PlGF и ММР-2. Уровень транскрипции VEGF и ММР-2 в группе пациенток с ПНБ был достоверно ниже, чем в группе сравнения (2), (р = 0,0304 и 0,0230 соотв.), в то время как уровень транскрипции PlGF среди пациенток I группы (1) был достоверно выше, чем у женщин в группе сравнения (2) (р = 0,021) (рис. 1).

Рис. 1. Уровень транскрипции VEGF, РЮЕ и ММР-2 у женщин с ПНБ (1) и женщин с реализованной репродуктивной функцией (2)

В ходе исследования было проведено разделение женщин с ПНБ на

группы в соответствии с морфологической картиной эндометрия (нормальный эндометрий (п = 28) и эндометрий с неполноценной секреторной фазой (п = 9)). При этом в рамках группы образцов эндометрия с нормальными морфологическими характеристиками был выделен эндометрий ранней (п = 5), средней (п = 15) и поздней (п = 8) секреторной фазы.

Уровень транскрипции мРНК УЕОБ оказался достоверно выше в раннюю (2) и среднюю (3) секреторную фазы по сравнению с неполноценной фазой секреции (1), р < 0,05. В то же время уровень транскрипции мРНК РЮБ был достоверно ниже в раннюю (2) и позднюю (4) секреторную фазы по сравнению с неполноценной фазой секреции (1), р < 0,05 (рис. 2).

Рис. 2. Уровень транскрипции VEGF и РЮЕ в раннюю (2), среднюю (3) и позднюю (4) секреторные фазы по сравнению с неполноценной (1) секреторной фазой

Уровень транскрипции мРНК Ап§-1 и иРА был достоверно выше в среднюю (3) секреторную фазу по сравнению с неполноценной фазой секреции (1), (р < 0,05) (рис. 3), а уровень транскрипции мРНК ММР-2 был достоверно выше в раннюю секреторную фазу (2) по сравнению с неполноценной фазой секреции (1), р < 0,05 (рис. 4).

Рис. 3. Уровень транскрипции А^-1 и иРА в раннюю (2), среднюю (3) и позднюю (4) секреторные фазы по сравнению с неполноценной (1) секреторной фазой

Рис. 4. Уровень транскрипции ММР-2 в раннюю (2), среднюю (3) и позднюю (4) секреторные фазы по сравнению с неполноценной (1) секреторной фазой

Оценка корреляции в транскрипции тех или иных факторов выявила достоверную положительную корреляцию в парах VEGF-Ang-1 (р = 0,0069), VEGF - ММР-2 (р = 0,00005), Л^-1 - ММР-2 (р = 0,001).

Обсуждение результатов. Процессы ангиогенеза наиболее активно протекают в пролиферативную фазу цикла, тем самым способствуя восстановлению, росту и секреторной трансформации эндометрия. Однако в середине фазы секреции происходит повторное, хотя и менее выраженное, усиление процессов образования новых сосудов, необходимое для принятия и питания прибывшего плодного яйца. Нарушение ангиогенных процессов, протекающих в период средней секреторной фазы, т.е. в период окна имплантации, может приводить к неадекватной инвазии трофобласта, нарушению взаимодействия между матерью и плодом и, как следствие, к прерыванию беременности. Это объясняет тот факт, что основные различия в транскрипции тех или иных факторов в нашей работе были получены именно между эндометрием с неполноценной секреторной трансформацией и морфологически нормальным эндометрием средней или ранней секреторной фазы.

Одним из состояний, характеризующихся нарушением созревания эндометрия в этот период, является неполноценная секреторная или лютеино-вая фаза (НЛФ), при которой в эндометрии наблюдается недоразвитие железистого и, в большей степени, стромального компонентов, приводящее к нарушению продукции различных белков, ростовых факторов, гликогена и других веществ, необходимых для успешной имплантации плодного яйца. И хотя у женщин с ПНБ при морфологическом исследовании эндометрия далеко не всегда выявляется НЛФ (по данным разных авторов, частота встречаемости данной патологии составляет от 5 до 40%), наличие неполноценной трансформации эндометрия, по всей видимости, усугубляет неблагоприятный прогноз у таких пациенток.

Так, по результатам нашего исследования было выявлено, что в эндометрии женщин с ПНБ происходит снижение транскрипции генов VEFG и

ММР-2, увеличение транскрипции гена РЮБ и тенденции к снижению транскрипции генов Ап§-1 и иРА по сравнению с женщинами, чья репродуктивная функция была реализована. Однако в группе женщин, страдающих привычной потерей беременности, при наличии морфологически подтвержденной НЛФ отмечались более выраженные изменения транскрипции тех же факторов по сравнению с женщинами с ПНБ и нормальными морфологическими характеристиками эндометрия.

Среди женщин с ПНБ при сравнении транскрипции мРНК УЕОБ у пациенток с НЛФ и пациенток с нормальными морфологическими характеристиками эндометрия в первом случае было обнаружено достоверное снижение транскрипции гена УЕОБ.

Одной из морфологических характеристик эндометрия у женщин с ПНБ и НЛФ является недостаточная секреторная трансформация эндометрия, выражающаяся в наличии слабоизвитых маточных желез с малым количеством сосудов и недостаточной отечной реакцией, вызванной слабыми изменениями сосудистой проницаемости. Поскольку УЕОБ отвечает за образование и поддержание жизнеспособности новых сосудов, а также увеличение сосудистой проницаемости, можно предположить, что сниженная транскрипция УЕОБ является одним из факторов, способствующих неполноценной секреторной трансформации эндометрия [4]. В то же время транскрипция мРНК РЮБ у женщин с ПНБ и НЛФ была достоверно выше по сравнению с женщинами с ПНБ и нормальной секреторной фазой, что может быть объяснено обратной зависимостью транскрипции мРНК РЮБ и УЕОБ по данным ряда авторов.

Возможно у женщин с ПНБ на ранних сроках беременности снижение транскрипции УЕОБ, а также повышение транскрипции РЮБ отражает нарушение процессов ангиогенеза в секреторную фазу цикла, итогом которого является недостаточная подготовка эндометрия к принятию плодного яйца, последующего нарушения имплантации и, как следствие, прерывания беременности.

Выявленная нами тенденция к снижению транскрипции Ап§-1 при ПНБ, а также достоверное снижение транскрипции Ап§-1 у женщин с ПНБ и НЛФ в отличие от женщин с ПНБ и нормальными морфологическими характеристиками эндометрия может быть объяснена влиянием Ап§-1 на выживаемость пролиферирующих эндотелиальных клеток и усиление организации микрососудов [5]. Достоверная положительная корреляция транскрипции мРНК УЕОБ и ММР-2, а также Ап§-1 и ММР-2 отражает участие ММР-2 в процессах ремоделирования ЭЦМ, являющихся неотъемлемой частью ан-гиогенных процессов.

Различий в уровне транскрипции мРНК иРА, участвующей в процессах поддержания должного гемостатического баланса, среди женщин с ПНБ в целом по сравнению с контрольной группой выявлено не было. В то же время транскрипция иРА у женщин с ПНБ и НЛФ была достоверно ниже по сравнению со средней фазой секреции у женщин с ПНБ и нормальными

морфологическими характеристиками эндометрия. Полученные данные согласуются с данными литературы о том, что активность эндометриального uPA возрастает в секреторную фазу при приближении периода окна имплантации [2]. uPA активирует на поверхности клеток плазминоген, который растворяет отложения фибрина и путем деградации ЭЦМ способствует миграции клеток, лежащей в основе миграции и инвазии трофобласта. Очевидно, при ПНБ и НЛФ в отличие от ПНБ и морфологически нормальным эндометрием этот процесс оказывается затруднен, что приводит к нарушению имплантации и как следствие - прерыванию беременности.

Таким образом, в эндометрии женщин с ПНБ в отличие от женщин с реализованной репродуктивной функцией происходит снижение транскрипции генов VEFG и MMP-2, увеличение транскрипции гена PlGF и отмечается тенденция к снижению транскрипции генов Ang-1 и uPA. Основываясь на полученных данных, можно утверждать, что именно рост и образование новых сосудов, невозможные без адекватной перестройки элементов стромы эндометрия, являются наиболее значимыми и наиболее уязвимыми процессами, принимающими участие в подготовке эндометрия к принятию плодного яйца. В то же время процессы, участвующие в регуляции гемостатическо-го баланса, становятся более значимыми уже после имплантации, во время развития сосудов плода и формирования плаценты, о чем свидетельствует большое количество работ, посвященных роли коагуляционных нарушений в развитии плацентарной недостаточности.

Учитывая тот факт, что у женщин с ПНБ наличие неполноценной секреторной фазы эндометрия характеризуется достоверным снижением транскрипции генов VEGF, Ang-1 и uPA, повышенной экспрессий гена PlGF и тенденцией к снижению транскрипции мРНК MMP-2, в отличие от женщин с ПНБ и морфологическими полноценным эндометрием, можно сделать вывод о наличии более выраженных нарушений ангиогенеза у женщин с ПНБ и НЛФ, а значит рассматривать неполноценную секреторную трансформацию эндометрия как дополнительный прогностически неблагоприятный критерий в отношении наступления и исхода беременности у таких пациенток.

ЛИТЕРАТУРА

[1] Rodgers W.H., Matrisian L.M., Giudice L.C. et al. Patterns of matrix metalloproteinase expression in cycling endometrium imply differential functions and regulation by steroid hormones // J. Clin. Invest. - 1994. - V. 94. - P. 946-953.

[2] Liu Y.X., Gao F., Wei P. et al. Involvement of molecules related to angiogenesis, proteolysis and apoptosis in implantation in rhesus monkey and mouse // Contraception. -2005, Apr. - V. 71 (4). - P. 249-262.

[3] Skrzypczak J.P. Wirstlein M.M. Could the defects in the endometrial extracellular matrix during the implantation be a cause for impaired fertility? // Am. J. Reprod Immunol. -2007. - Vol. 57 (1). - P. 40-48.

[4] Girling J.E., Rogers P.A. Regulation of endometrial vascular remodelling: role of the vascular endothelial growth factor family and the angiopoietin-TIE signalling system // Reproduction. - 2009. - Vol. 138 (6). - P. 883-893.

[5] Nayak N.R., Kuo C.J., Desai T.A. et al. Expression, localization and hormonal control of angiopoietin-1 in the rhesus macaque endometrium: potential role in spiral artery growth // Mol. Hum. Reprod. - 2005. - Vol. 11. - P. 791-799.

TRANSCRIPTIONAL AND MORPHOLOGICAL CHANGES OF PRE-IMPLANTAITION ENDOMETRIUM IN WOMEN WITH RECURRENT PREGNANCY LOSS

V.E. Radzinsky

Department of Obstetrics and Gynecology with the course of Perinathology Peoples' Friendship University of Russia Mikluho-Maklaya Str., 8, Medical Faculty, Moscow, Russia, 117198

O.N. Sadekova, D.A. Voznyuk, L.A. Samokhodskaya, V.A. Tkachuk

Department of biochemistry and molecular medicine Moscow State University named after M.V. Lomonosov Lomonosovsky Av., 31-5, Moscow, Russia, 119192

T.N. Rashidov

Clinic of Obstetrics and Gynecology named after V.F. Snegirev Elanskogo Str., 2, Moscow, Russia, 119435

E.M. Demidova

LLC «Hi-tech Medical» clinic Petrovka Str., 20/1, Moscow, Russia, 127051

L.A. Nikitina

LLC «University medicine» Lomonosovskiyi Av., 31-5, Moscow, Russia, 119192

Pre-implantation state of endometrium is one of the key factors of successful pregnancy onset and its maintenance. Based on our observations we revealed significant disturbances in transcriptional level of factors, regulating angiogenesis (VEGF, PlGF, Ang-1), fibrinolysis (uPA) and extracellular matrix remodeling (MMP-2) in endometrium of women with recurrent pregnancy loss. At the same time combination of these changes with luteal insufficiency were associated with the highest risk of pregnancy loss.

Key words: recurrent pregnancy loss, angiogenesis, luteal insufficiency.