CC BY
33
ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ КЛЮЧЕВЫХ ГЕНОВ АНГИОГЕНЕЗА В ЭНДОМЕТРИИ ЖЕНЩИН С ПРИВЫЧНЫМ НЕВЫНАШИВАНИЕМ БЕРЕМЕННОСТИ И НЕДОСТАТОЧНОСТЬЮ ЛЮТЕИНОВОЙ ФАЗЫ
О.Н. Садекова1, Л.А. Никитина1, Д.А. Вознюк1, Т.Н. Рашидов2, Е.М. Демидова4, Л.М. Самоходская1, В.Е. Радзинский3
1 Лаборатория генных и клеточных технологий в медицине Факультет фундаментальной медицины Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова 2 Клиника акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева 3 Кафедра акушерства и гинекологии с курсом перинатологии Российский университет дружбы народов 4 ООО «Высокие технологии медикал» Ломоносовский проспект, 31, корп. 5, Москва, Россия, 119192
Привычное невынашивание беременности (ПНБ) является одной из актуальных проблем современного акушерства. По данным ВОЗ частота данной патологии составляет 15—20% от общего числа беременностей, причем 75—80% выкидышей происходят на сроке до 12 недель.
ПНБ является полиэтиологическим симптомокомплексом, в основе развития которого наиболее часто лежат инфекционные, эндокринные, иммунологические, анатомические и генетические факторы, причем, как правило, в сочетании. В последнее время интерес исследователей чаще обращается к изучению клеточно-молекулярных особенностей эндометрия у женщин с ПНБ, так как именно они определяют направленности течения гестационного процесса: физиологического или патологического.
Целью данного исследования стало изучение экспрессии факторов регуляции ангиогенеза, фибринолиза и ремоделирования внеклеточного матрикса в эндометрии женщин с привычным невынашиванием беременности в ранние сроки.
Материалы и методы. Основную группу составили 37 женщин (средний возраст 33 ± 4,2 года), имеющие в анамнезе 2 и более эпизодов невынашивания беременности на ранних сроках, у 15,4% из них была диагностирована неразвивающаяся беременность. Средние сроки потерь беременности составили 6,5 ± 1,0 нед.
В группу сравнения вошли 19 женщин (средний возраст 34 ± 5,2 года) с реализованной репродуктивной функцией, проходившие обследование в клинике акушерства и гинекологии по поводу вторичного бесплодия.
Средний возраст менархе (12,6 ± 1,0 и 13,1 ± 1,6) соответствовал популяци-онным значениям и не имел различий в обеих группах. Длительность менструального цикла (28,6 ± 2,9 и 29,5 ± 2,6) и продолжительность менструаций (4,5 ± 1,2 и 4,5 ± 0,5) также были сопоставимы у женщин 1-й и 2-й групп и соответствовали физиологическим параметрам. Частота гинекологических заболеваний существенно не различалась у женщин обеих групп.
Критерием исключения из группы исследования явилось наличие признаков воспалительных процессов в эндометрии, пороки развития матки.
Исследуемые пациентки проходили стандартное клиническое обследование в клинике акушерства и гинекологии им. В.Ф. Снегирева. У всех женщин проводили биопсию эндометрия за 5 дней до ожидаемой менструации (на 23-й день МЦ при продолжительности цикла 28 дней.). Наряду с традиционной гистологической оценкой проводилось микробиологическое исследование эндометрия (посев на микрофлору), исследование на хламидии, ВПГ и ЦМВ методом ПЦР-диагно-стики, культуральное исследование на микоплазму и уреаплазму. На основании полученных данных делали заключение о функциональном состоянии эндометрия, наличии признаков хронического эндометрита и др. Пациентки с положительным результатом в любом из проведенных микробиологических исследований исключались из исследования.
Из образцов эндометрия выделялась тотальная РНК, затем проводилось построение цепи комплементарной ДНК при помощи обратной транскрипции и методом полимеразной цепной реакции в реальном времени (Real-time PCR) с использованием интеркалирующего красителя SYBR-green I проводилось изучение экспрессии генов сосудисто-эндотелиального (VEGF) и плацентарного ростовых факторов (PlGF), матриксной металлопротеиназы-2 (ММР-2), ангиопоэтина-1 (Ang-1) и активатора плазминогена урокиназного типа (uPA). Количественную оценку проводили методом относительного количественного анализа (AAQ). Статистическая обработка проводилась с использованием непараметрического критерия Mann-Whitney в статистическом пакете Statistica 6.0.
При сравнении уровней экспрессии мРНК между группами женщин с невынашиванием и с реализованной репродуктивной функцией были выявлены достоверные различия в экспрессии мРНК VEGF, PlGF и ММР-2. Уровень экспрессии VEGF и ММР-2 в группе пациенток с НБ был достоверно ниже, чем в группе сравнения (р = 0,0304 и 0,0230 соответственно), в то время как уровень экспрессии PlGF среди пациенток основной группы был достоверно выше, чем у женщин в группе сравнения (р = 0,021). Уровни экспрессии мРНК Ang-1 у женщин основной группы были несколько ниже, чем в группе сравнения, однако эти результаты не были статистически достоверными. Различия между уровнем экспрессии мРНК uPA у пациенток обеих групп отсутствовали.
В ходе исследования было проведено разделение всех женщин с ПНБ на группы в соответствии с морфологической картиной эндометрия (нормальный эндометрий (n = 28) и эндометрий с неполноценной секреторной фазой (n = 9)). При этом основное внимание в ходе работы было уделено состоянию стромы эндометрия и ее компонентов. В рамках группы образцов эндометрия с нормальными морфологическими характеристиками был выделен эндометрий ранней (n = 5), средней (n = 17) и поздней (n = 6) секреторной фазы.
В результате проведенного исследования нами было выявлено, что уровень экспрессии мРНК VEGF оказался достоверно выше в раннюю и среднюю секреторную фазы по сравнению с неполноценной фазой секреции, р = 0,031. В то же время уровень экспрессии мРНК PlGF был достоверно ниже в раннюю и позднюю секреторную фазы по сравнению с неполноценной лютеиновой фазой, р = = 0,0017.
В эндометрии ранней секреторной фазы отмечался достоверно повышенный уровень экспрессии мРНК ММР-2 по сравнению с неполноценной фазой секреции, р = 0,0018, тогда как в среднюю секреторную фазу в отличие от неполноценной фазы секреции отмечалась повышенная экспрессия мРНК Ang-1 и uPA, р = 0,0217 и 0,012 соответственно.
Оценка корреляции в экспрессии тех или иных факторов выявила достоверную положительную корреляцию в парах VEGF-Ang-1 ф = 0,0069), VEGF — MMP-2 (р = 0,00005), Л^-1 — MMP-2 (р = 0,001).
Обсуждение результатов. Процессы ангиогенеза наиболее активно протекают в пролиферативную фазу цикла, тем самым способствуя восстановлению, росту и секреторной трансформации эндометрия [1]. Однако в середине фазы секреции происходит повторное, хотя и менее выраженное, усиление процессов образования новых сосудов, необходимое для принятия и питания прибывшего плодного яйца [2]. Нарушение ангиогенных процессов, протекающих в период средней секреторной фазы, т.е. в период окна имплантации, может приводить к неадекватной инвазии трофобласта, нарушению взаимодействия между матерью и плодом и, как следствие, к прерыванию беременности. Это объясняет тот факт, что основные различия в экспрессии тех или иных факторов были получены именно между неполноценной и средней или ранней секреторной фазами.
При сравнении экспрессии мРНК VEGF у женщин с НЛФ и у женщин с нормальными морфологическими характеристиками эндометрия в первом случае было обнаружено достоверное снижение его экспрессии.
Одной из морфологических характеристик эндометрия у женщин с ПНБ и НЛФ является недостаточная секреторная трансформация эндометрия, выражающаяся в наличии слабоизвитых маточных желез с малым количеством сосудов и недостаточной отечной реакцией, вызванной слабыми изменениями сосудистой проницаемости [3]. Поскольку VEGF отвечает за образование и поддержание жизнеспособности новых сосудов, а также увеличение сосудистой проницаемости [4], можно предположить, что сниженная экспрессия VEGF является одним из факторов, способствующих формированию НЛФ.
Экспрессия мРНК PlGF у женщин с НЛФ была достоверна выше по сравнению с женщинами с нормальной секреторной фазой, что может быть объяснено обратной зависимостью экспрессии мРНК PlGF и VEGF по данным ряда авторов [5, 6, 7].
Возможно у женщин с ПН на ранних сроках беременности снижение экспрессии VEGF, а также повышение экспрессии мРНК PlGF может отражать нарушение процессов ангиогенеза в секреторную фазу цикла, итогом которого является недостаточная подготовка эндометрия к принятию плодного яйца, последующего нарушения имплантации и, как следствие, прерывания беременности.
Выявленная нами тенденция к снижению экспрессии Ang-1 у женщин с ПНБ, а также достоверное снижение экспрессии Ang-1 при ПНБ и НЛФ по сравнению с нормальными морфологическими характеристиками эндометрия может быть объяснена влиянием Ang-1 на выживаемость пролиферирующих эндотелиальных клеток и усилением организации микрососудов [8]. Достоверная положительная корреляция экспрессии мРНК VEGF и ММР-2, и Ang-1 и ММР-2 отражает участие
ММР-2 в процессах ремоделирования ЭЦМ, являющихся неотъемлемой частью ангиогенных процессов [9].
В ряде работ [10, 11] отмечается, что экспрессия и активность ММР-2 в период окна имплантации (т.е. в среднюю секреторную фазу) повышаются у женщин с нарушениями фертильности. Наши результаты не согласуются с этими данными: отмечена пониженная экспрессия мРНК ММР-2 у женщин с ПНБ и НЛФ по сравнению с контрольными группами. Мы предполагаем, что такое снижение экспрессии может быть связано с нарушением процессов ангиогенеза, что также подтверждается наличием корреляционной зависимости между экспрессией VEGF и MMP-2.
Различий в уровне экспрессии мРНК uPA, участвующей в процессах поддержания должного гемостатического баланса, среди женщин с ПНБ в целом по сравнению с контрольной группой выявлено не было. В то же время экспрессия uPA у женщин с ПНБ и НЛФ была достоверно ниже по сравнению со средней фазой секреции у женщин с ПНБ и нормальными морфологическими характеристиками эндометрия. Полученные данные согласуются с данными литературы о том, что активность эндометриального uPA возрастает в секреторную фазу при приближении периода окна имплантации [12]. uPA активирует на поверхности клеток плазминоген, который растворяет отложения фибрина и путем деградации ЭЦМ способствует миграции клеток, лежащей в основе миграции и инвазии тро-фобласта [13, 14]. Очевидно, при ПНБ этот процесс оказывается затруднен, что приводит к нарушению имплантации и, как следствие, прерыванию беременности.
Таким образом, нами было показано, что в эндометрии женщин с ПНБ происходит снижение экспрессии генов VEFG и MMP-2, увеличение экспрессии гена PlGF и тенденции к снижению экспрессии генов Ang-1 и uPA. Неполноценная секреторная фаза эндометрия у этих женщин характеризовалась достоверным снижением экспрессии генов VEGF, Ang-1 и uPA, повышенной экс-прессий гена PlGF и тенденцией к снижению экспрессии мРНК MMP-2.
Можно предположить, что именно рост и образование новых сосудов, невозможные без адекватной перестройки элементов стромы эндометрия, являются наиболее значимыми и наиболее уязвимыми процессами, принимающими участие в подготовке эндометрия к принятию плодного яйца. В то же время процессы, участвующие в регуляции гемостатического баланса, становятся более значимыми уже после имплантации, во время развития сосудов плода и формирования плаценты, о чем свидетельствует большое количество работ, посвященных роли коа-гуляционных нарушений в развитии плацентарной недостаточности.
ЛИТЕРАТУРА
[1] Smith S.K. Angiogenesis and reproduction / S.K. Smith // BJOG: An International Journal of Obstetrics and Gynaecology. — 2001. — Vol. 108 (8). — P. 777—783.
[2] Nayak N.R. Vascular proliferation and vascular endothelial growth factor expression in the rhesus macaque endometrium / N.R. Nayak, R.M. Brenner // J Clin Endocrinol Metab — 2002. — Vol. 87. — P. 1845—1855.
[3] Сидельникова Н.М. Неполноценная лютеиновая фаза (НЛФ) — тактика ведения пациенток с привычной потерей беременности / Н.М. Сидельникова // Гинекология. — 2002. — № 4. — С. 15—18.
[4] Expression and regulation of vascular endothelial growth factor in a first trimester trophoblast cell line / I.B. Chung [et al] // Placenta. — 2000 May. — Vol. 21(4). — P. 320—4.
[5] Influence of hypoxia on vascular endothelial growth factor and chorionic gonadotrophin production in the trophoblast-derived cell lines: JEG, JAr and BeWo / C.M. Taylor [et al] // Placenta. — 1997 Jul-Aug. — Vol. 18(5—6). — P. 451—8.
[6] Hypoxia down-regulates placenta growth factor, whereas fetal growth restriction up-regulates placenta growth factor expression: molecular evidence for «placental hyperoxia» in intrauterine growth restriction / A. Khaliq [et al] // Lab. Invest. — 1999 Feb. — Vol. 79(2). — P. 151—70.
[7] Vascular endothelial growth factor and placental growth factor release in cultured trophoblast cells under different oxygen tensions / G.E. Lash [et al] // Growth Factors. — 2002 Dec. — Vol. 20(4). — P. 189—96.
[8] Angiopoietin-1 and its receptor Tie-2 participate in the regulation of capillary-like tubule formation and survival of endothelial cells / A.J. Hayes [et al] // Microvasc. Res. — 1999 Nov. — Vol. 58(3). — P. 224—37.
[9] Liotta L.A. Cancer metastasis and angiogenesis: an imbalance of positive and negative regulation / L.A. Liotta, P.S. Steeg, W.G. Stetler-Stevenson // Cell. — 1991. — Vol. 64. — P. 327—336.
[10] Genes for extracellular matrix-degrading metalloproteinases and their inhibitor, TIMP, are expressed during early mammalian development / C.A. Brenner [et al] // Genes & Dev. — 1989. — Vol. 3. — P. 848—859.
[11] Woessner J.F. Total, latent and active collagenase during the course of post-partum involution of the rat uterus / J.F. Woessner // Biochem. J. — 1979. — Vol. 180. — P. 95—102.
[12] Involvement of molecules related to angiogenesis, proteolysis and apoptosis in implantation in rhesus monkey and mouse / Y.X. Liu [et al] // Contraception. — 2005 Apr. — Vol. 71(4). — P. 249—62.
[13] The urokinase receptor, protein structure and role in plasminogen activation and cancer invasion / K. Danu [et al]// Fibrinolysis. — 1994. — Vol. 8. — P. 189—203.
[14] Andreasen P.A. The plasminogen activation system in tumour growth, invasion and metastasis / P.A. Andreasen, R. Egelund, H.H. Petersen // CMLS, Cell Life Sci. — 2000. — Vol. 57. — P. 25—40.
FEATURES OF THE EXPRESSION OF ANGIOGENESIS GENES IN ENDOMETRY WOMEN WITH HABITUAL NONCARRYING OF PREGNANCY AND INSUFFICIENCY OF LUTEIN PHASE
O.N. Sadekova, L.A. Nikitina, D.A. Voznyuk, T.N. Rashidov, E.M. Demidova, L.M. Samohodskaya, V.E. Radzinsky
Moscow State University
Lomonosovsky avenue, 31-5, Moscow, Russia, 119192
Studying of an expression of factors of regulation angiogenese, fibrinolise and extracellular ма1м in эндометрии women with habitual noncarrying of pregnancy in early terms became an objective of this research.
