Научная статья на тему 'Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденовирусных векторов различных серотипов'

Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденовирусных векторов различных серотипов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

  • … еще 1
CC BY
8
0
Читать
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Иммунология
Scopus
ВАК
CAS
RSCI
Ключевые слова
аденовирусы (Ad) / серотипы Ad / перенос генов / В-лимфоциты / трансдукция / GFP / стимуляция В-лимфоцитов / adenoviruses (Ad) / Ad serotypes / gene transfer / B lymphocytes / transduction / GFP / stimulation of B lymphocytes

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Сухова Мария Михайловна, Бязрова Мария Георгиевна, Банделюк Алина Сергеевна, Михайлов Артем Андреевич, Шмаров Максим Михайлович

Введение. В-клетки являются привлекательной мишенью для генной терапии. С помощью переноса генов в В-клетки можно лечить заболевания, связанные с генетически обусловленной дисфункцией В-клеток, а также лимфопролиферативные и аутоиммунные патологии. В последние годы для переноса генов все большую популярность приобретают векторы на основе аденовирусов (Ad). Этому способствуют такие свойства Ad, как высокая емкость в отношении трансгена, возможность нарабатывать вектор в высоких титрах, а также способность трансдуцировать терминально дифференцированные клетки. Цель исследования определить эффективность трансдукции В-клеточных линий человека, а также активированных первичных В-лимфоцитов аденовирусными векторами различных серотипов. Материал и методы. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови здоровых доноров (п = 11) с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина с дальнейшим обогащением фракции В-лимфоцитов методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. В-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью смеси лимфокинов, в состав которой входили ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованный CD40L. Через 24 ч стимулированные В-лимфоциты инфицировали рекомбинантными аденовирусными векторами, несущими репортерный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Были протестированы 3 серотипа: Ad5, sAd23 и Ad26, а также химерный Ad5-BeKrop, содержавший на С-конце своего фибера соответствующий домен серотипа Ad35 (Ad5/35). Через 48 ч после инфекции определяли долю трансдуцированных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции репортерного белка GFP. Трансдукцию определяли на четырех В-клеточных линиях: NALM-6, Ramos, IM-9 и RPMI-8226, а также на первичных В-лимфоцитах. Для сравнения с В-клетками использовали нелимфоидную линию HEK293. Результаты. Ad в низких и средних дозах оказывали на клетки умеренное токсическое воздействие, при этом жизнеспособность оставалась не ниже 70 %. Наиболее восприимчивыми к аденовирусной инфекции проявили себя клетки RPMI-8226, у которых после трансдукции > 90 % клеток экспрессировали GFP. По этому показателю они приближались к нелимфоидным клеткам HEK293. Наиболее устойчивыми к аденовирусной инфекции оказались клетки NALM-6 они в некоторой степени трансдуцировались векторами Ad26 и Ad35 (65 и 66 %), незначительно вектором sAd23 (18 %) и минимально вектором Ad5. Клетки Ramos и IM-9 по чувствительности к инфекции занимали промежуточное положение, при этом клетки Ramos трансдуцировались несколько более успешно, чем IM-9. При сравнении различных серотипов наиболее инфекционным оказался Ad26, который даже в минимальных дозах трансдуцировал > 90 % клеток Ramos, IM-9 и RPMI-8226. В отношении стимулированных первичных В-лимфоцитов наибольшей трансдуцирующей эффективностью обладал вектор Ad26. При дозе вируса 2000 БОЕ/клетку медианное значение доли ОҒР+-клеток составляло 35 % (межквартильный размах 30-40 %). Несколько меньшую активность проявлял Ad5/35 (медианное значение 16 %, межквартильный размах 13-20 %). Наконец Ad5 и sAd23 имели самую низкую трансдуцирующую активность, которая устойчиво превышала пороговый уровень только при самых высоких дозах вируса (от 1000 до 2000 БОЕ/клетку). Заключение. Серотипы Ad отличаются между собой по способности трансдуцировать В-клетки человека. Наиболее эффективную трансдукцию обеспечивает серотип Ad26. Несколько сниженной эффективностью обладает вектор Ad5, псевдотипированный фибером Ad35. Трансдукция первичных В-лимфоцитов проходит только после их активации.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Сухова Мария Михайловна, Бязрова Мария Георгиевна, Банделюк Алина Сергеевна, Михайлов Артем Андреевич, Шмаров Максим Михайлович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
Предварительный просмотрDOI: 10.33029/1816-2134-2024-45-4-435-445
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Transduction of human B lymphocytes using adenoviral vectors of various serotypes

Introduction. B cells are an attractive target for gene therapy. With the help of gene transfer to B cells, it is possible to treat diseases associated with genetically determined dysfunction of B cells, as well as lymphoproliferative and autoimmune pathologies. In recent years, adenovirus (Ad)-based vectors have become increasingly popular for gene transfer. This is facilitated by such properties of Ad as high transgene capacity, the ability to produce the vector in high titers, and the ability to transduce terminally differentiated cells. The aim of the study is to determine the efficiency of transduction of human B cell lines, as well as activated primary B lymphocytes after infection using adenoviral vectors of various serotypes. Material and methods. Mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of healthy donors (n = 11) by Ficoll-Verografin density gradient centrifugation with further enrichment of B lymphocytes using negative selection using magnetic microspheres. B cells were stimulated in vitro with a mixture of lymphokines, which included IL-2, IL-4, BAFF, IL-21 and multimerized CD40L. After 24 h, stimulated B lymphocytes were infected with recombinant adenoviral vectors carrying the green fluorescent protein (GFP) reporter gene. Three serotypes were tested: Ad5, sAd23 and Ad26, as well as a chimeric Ad5 vector containing the corresponding domain of the Ad35 serotype (Ad5/35) at the C-terminus of its fiber. At 48 h postinfection, the per center of transduced B cells and the average fluorescence intensity of the GFP reporter protein were determined. Adenoviral transduction was determined in four B cell lines: NALM-6, Ramos, IM-9, and RPMI-8226, and also in primary B lymphocytes. For comparison with B cells the non-lymphoid line HEK293 was used. Results. Adenoviruses in low and medium doses had a moderate toxic effect on cells, while the viability remained at least 70 %. The most susceptible to adenovirus infection were RPMI-8226 cells, in which, after transduction, more than 90 % of cells expressed GFP, and in this indicator they were close to non-lymphoid HEK293 cells. The cells most resistant to adenovirus infection were NALM-6, which were transduced to some extent with the Ad26 and Ad35 vectors (65 and 66 %), slightly with the sAd23 vector (18 %), and minimally with the Ad5 vector. Ramos and IM-9 cells were intermediate in sensitivity to infection, with Ramos being transduced somewhat more successfully than IM-9. When comparing different serotypes, Ad26 turned out to be the most infectious, which, even in minimal doses, transduced more than 90 % of Ramos, IM-9 and RPMI-8226 cells. For stimulated primary B lymphocytes, the Ad26 vector had the greatest transducing efficiency. At a virus dose of 2000 PFU per cell, the median proportion of GFP+ cells was 35 % (interquartile range 30-40 %). Ad5/35 showed slightly less activity (median value 16 %, interquartile range 13-20 %). Finally, Ad5 and sAd23 had the lowest transducing activity, which consistently exceeded the threshold level only at the highest doses of virus (1000 to 2000 PFU per cell). Conclusion. Ad serotypes differ in their ability to transduce human B cells. The most efficient transduction is provided by the Ad26 serotype. The Ad5 vector pseudotyped with Ad35 fiber has a slightly reduced effi ciency. Transduction of primary B lymphocytes occurs only after their activation.

Текст научной работы на тему «Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденовирусных векторов различных серотипов»

Клеточная иммунология

© Коллектив авторов, 2024

Сухова М.М.1' 2, Бязрова М.Г.1' 3, Банделюк A.C.4, Михайлов A.A.1' 2, Шмаров М.М.4, Филатов A.B.1' 2

Трансдукция B-лимфоцитов человека с помощью аденовирусных векторов различных серотипов

1 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Государственный научный центр «Институт иммунологии» Федерального медико-биологического агентства, 115522, г. Москва, Российская Федерация

2 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», 119234, г. Москва, Российская Федерация

3 Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов им. П. Лумумбы» Министерства науки и высшего образования Российской Федерации, 117198, г. Москва, Российская Федерация

4 Федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения Российской Федерации, 123098, г. Москва, Российская Федерация

Резюме

Введение. B-клетки являются привлекательной мишенью для генной терапии. С помощью переноса генов в B-клетки можно лечить заболевания, связанные с генетически обусловленной дисфункцией B-клеток, а также лимфопролиферативные и аутоиммунные патологии. В последние годы для переноса генов все большую популярность приобретают векторы на основе аденовирусов (Ad). Этому способствуют такие свойства Ad, как высокая емкость в отношении трансгена, возможность нарабатывать вектор в высоких титрах, а также способность трансдуцировать терминально дифференцированные клетки.

Цель исследования - определить эффективность трансдукции B-клеточных линий человека, а также активированных первичных B-лимфоцитов аденовирусными векторами различных серотипов.

Материал и методы. Мононуклеарные клетки выделяли из периферической крови здоровых доноров (n = 11) с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколла-верографина с дальнейшим обогащением фракции B-лимфоцитов методом отрицательной селекции с использованием магнитных микросфер. B-лимфоциты стимулировали in vitro с помощью смеси лимфокинов, в состав которой входили ИЛ-2, ИЛ-4, BAFF, ИЛ-21 и мультимеризованный CD40L. Через 24 ч стимулированные В-лимфо-циты инфицировали рекомбинантными аденовирусными векторами, несущими репор-терный ген зеленого флуоресцирующего белка (GFP). Были протестированы 3 серотипа: Ad5, sAd23 и Ad26, а также химерный AdS-векгор, содержавший на С-конце своего фибера соответствующий домен серотипа Ad35 (Ad5/35). Через 48 ч после инфекции определяли долю трансдуцированных клеток и среднюю интенсивность флуоресценции репортерного белка GFP. Трансдукцию определяли на четырех B-клеточных линиях: NALM-6, Ramos, IM-9 и RPMI-8226, а также на первичных B-лимфоцитах. Для сравнения с B-клетками использовали нелимфоидную линию HEK293.

Результаты. Ad в низких и средних дозах оказывали на клетки умеренное токсическое воздействие, при этом жизнеспособность оставалась не ниже 70 %. Наиболее восприимчивыми к аденовирусной инфекции проявили себя клетки RPMI-8226, у которых после трансдукции > 90 % клеток экспрессировали GFP. По этому показателю они приближались к нелимфоидным клеткам HEK293.

Наиболее устойчивыми к аденовирусной инфекции оказались клетки NALM-6 - они в некоторой степени трансдуцировались векторами Ad26 и Ad35 (65 и 66 %), незначительно - вектором sAd23 (18 %) и минимально - вектором Ad5. Клетки Ramos и IM-9 по чувствительности к инфекции занимали промежуточное положение, при этом клетки Ramos трансдуцировались несколько более успешно, чем IM-9. При сравнении различных серотипов наиболее инфекционным оказался Ad26, который даже в минимальных дозах трансдуцировал > 90 % клеток Ramos, IM-9 и RPMI-8226.

В отношении стимулированных первичных B-лимфоцитов наибольшей трансдуци-рующей эффективностью обладал вектор Ad26. При дозе вируса 2000 БОЕ/клетку меди-

Для корреспонденции

Филатов Александр Васильевич -доктор биологических наук, профессор, заведующий лабораторией иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России, Москва, Российская Федерация E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

анное значение доли GFP+-KneroK составляло 35 % (межквартильный размах - 30-40 %). Несколько меньшую активность проявлял Ad5/35 (медианное значение 16 %, межквартильный размах 13-20 %). Наконец Ad5 и sAd23 имели самую низкую трансдуцирую-щую активность, которая устойчиво превышала пороговый уровень только при самых высоких дозах вируса (от 1000 до 2000 БОЕ/клетку).

Заключение. Серотипы Ad отличаются между собой по способности трансдуциро-вать B-клетки человека. Наиболее эффективную трансдукцию обеспечивает серотип Ad26. Несколько сниженной эффективностью обладает вектор Ad5, псевдотипирован-ный фибером Ad35. Трансдукция первичных B-лимфоцитов проходит только после их активации.

Ключевые слова: аденовирусы (Ad); серотипы Ad; перенос генов; B-лимфоциты; трансдукция; GFP; стимуляция В-лимфоцитов

Статья получена 06.06.2024. Принята в печать 05.07.2024.

Для цитирования: Сухова М.М., Бязрова М.Г., Банделюк A.C., Михайлов A.A., Шмаров М.М., Филатов A.B. Трансдукция B-лимфоцитов человека с помощью аденовирусных векторов различных серотипов. Иммунология. 2024; 45 (4): 435-445. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-435-445

Финансирование. Исследование выполнено за счет гранта Российского научного фонда № 23-15-00289, https://rscf.ru/project/23-15-00289/.

Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.

Вклад авторов. Сбор и обработка материала - Сухова М.М., Бязрова М.Г., Банделюк A.C., Михайлов A.A.; написание текста, редактирование - Шмаров М.М., Филатов A.B.; окончательный вариант и целостность текста - Шмаров М.М., Филатов A.B.

Sukhova M.M.1' 2, Byazrova M.G.1' 3, Bandelyuk A.S.4, Mikhailov A.A.1' 2, Shmarov M.M.4, Filatov A.V.1, 2

Transduction of human B lymphocytes using adenoviral vectors of various serotypes

1 National Research Center - Institute of Immunology of the Federal Medical-Biological Agency, 115522, Moscow, Russian Federation

2 M.V. Lomonosov Moscow State University, 119234, Moscow, Russian Federation

3 Peoples' Friendship University of Russia named after P. Lumumba, Ministry of Science and Higher Education of the Russian Federation, 117198, Moscow, Russian Federation

4 Federal Research Centre of Epidemiology and Microbiology named after Honorary Academician N.F. Gamaleya, Ministry of Health of the Russian Federation, 123098, Moscow, Russian Federation

Abstract

Introduction. B cells are an attractive target for gene therapy. With the help of gene transfer to B cells, it is possible to treat diseases associated with genetically determined dysfunction of B cells, as well as lymphoproliferative and autoimmune pathologies. In recent years, adenovirus (Ad)-based vectors have become increasingly popular for gene transfer. This is facilitated by such properties of Ad as high transgene capacity, the ability to produce the vector in high titers, and the ability to transduce terminally differentiated cells.

The aim of the study is to determine the efficiency of transduction of human B cell lines, as well as activated primary B lymphocytes after infection using adenoviral vectors of various serotypes.

Material and methods. Mononuclear cells were isolated from the peripheral blood of healthy donors (n = 11) by Ficoll-Verografin density gradient centrifugation with further enrichment of B lymphocytes using negative selection using magnetic microspheres. B cells were stimulated in vitro with a mixture of lymphokines, which included IL-2, IL-4, BAFF, IL-21 and multimerized CD40L. After 24 h, stimulated B lymphocytes were infected with recombinant adenoviral vectors carrying the green fluorescent protein (GFP) reporter gene. Three serotypes were tested: Ad5, sAd23 and Ad26, as well as a chimeric Ad5 vector containing the corresponding domain of the Ad35 serotype (Ad5/35) at the C-terminus of its fiber. At 48 h postinfection, the per center of transduced B cells and the average fluorescence intensity of

For correspondence

Alexander V. Filatov -Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Laboratory, NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

the GFP reporter protein were determined. Adenoviral transduction was determined in four B cell lines: NALM-6, Ramos, IM-9, and RPMI-8226, and also in primary B lymphocytes. For comparison with B cells the non-lymphoid line HEK293 was used.

Results. Adenoviruses in low and medium doses had a moderate toxic effect on cells, while the viability remained at least 70 %. The most susceptible to adenovirus infection were RPMI-8226 cells, in which, after transduction, more than 90 % of cells expressed GFP, and in this indicator they were close to non-lymphoid HEK293 cells. The cells most resistant to adenovirus infection were NALM-6, which were transduced to some extent with the Ad26 and Ad35 vectors (65 and 66 %), slightly with the sAd23 vector (18 %), and minimally with the Ad5 vector. Ramos and IM-9 cells were intermediate in sensitivity to infection, with Ramos being transduced somewhat more successfully than IM-9. When comparing different serotypes, Ad26 turned out to be the most infectious, which, even in minimal doses, transduced more than 90 % of Ramos, IM-9 and RPMI-8226 cells. For stimulated primary B lymphocytes, the Ad26 vector had the greatest transducing efficiency. At a virus dose of 2000 PFU per cell, the median proportion of GFP+ cells was 35 % (interquartile range 30-40 %). Ad5/35 showed slightly less activity (median value 16 %, interquartile range 13-20 %). Finally, Ad5 and sAd23 had the lowest transducing activity, which consistently exceeded the threshold level only at the highest doses of virus (1000 to 2000 PFU per cell).

Conclusion. Ad serotypes differ in their ability to transduce human B cells. The most efficient transduction is provided by the Ad26 serotype. The Ad5 vector pseudotyped with Ad35 fiber has a slightly reduced effi ciency. Transduction of primary B lymphocytes occurs only after their activation.

Keywords: adenoviruses (Ad); Ad serotypes; gene transfer; B lymphocytes; transduction; GFP; stimulation of B lymphocytes

Received 06.06.2024. Accepted 05.07.2024.

For citation: Sukhova M.M., Byazrova M.G., Bandelyuk A.S., Mikhailov A.A., Shmarov M.M., Filatov A.V. Transduction of human B lymphocytes using adenoviral vectors of various serotypes. Immunologiya. 2024; 45 (4): 435-45. DOI: https://doi.org/10.33029/1816-2134-2024-45-4-435-445 (in Russian)

Funding. The study was supported by the grant of Russian Science Foundation (RSF) No. 23-15-00289, https://rscf. ru/project/23-15-00289/.

Conflict of interests. The authors declare no conflict of interests.

Authors' contribution. Collection and processing of material - Sukhova M.M., Byazrova M.G., Bandelyuk A.S., Mikhailov A.A.; text writing, editing - Shmarov M.M., Filatov A.V.; the final version of the text - Shmarov M.M., Filatov A.V.

Введение

В-клетки представляют собой важнейшее звено адаптивного иммунитета. Они являются продуцентами антител и некоторых цитокинов. Разнообразные врожденные или приобретенные дефекты могут приводить к серьезным нарушениям в работе как самих В-лим-фоцитов, так и всей системы иммунитета в целом. Эти обстоятельства делают В-клетки привлекательной мишенью для генной терапии. С помощью переноса генов в В-клетки можно будет лечить заболевания, связанные с генетически обусловленной дисфункцией В-клеток, а также лимфопролиферативные и аутоиммунные патологии [1].

Для доставки генов в В-лимфоциты применяется несколько платформ. Прежде всего это подходы, основанные на использовании ретровирусов [2], лентивиру-сов [3], а также аденоассоциированных вирусов [4].

В последние годы для генной терапии все большую популярность приобретают векторы на основе аденовирусов (Ad) [5]. Такие свойства, как высокая

емкость в отношении трансгена, возможность нарабатывать вектор в высоких титрах, а также способность трансдуцировать терминально дифференцированные клетки делает Ad-векгоры особо привлекательными для использования в терапевтических или профилактических целях [6].

В дополнение к этому рекомбинантные Ad-векгоры с успехом применяются для создания вакцин против различных патогенов человека [7]. В качестве примера можно упомянуть вакцины на основе Ad для вируса иммунодефицита человека типа 1 (ВИЧ-1) [8], Эбола [9] и некоторых других вирусов. На основе этой платформы были созданы вакцины против COVID-19. Среди них можно отметить Гам-КОВИД-Вак («Спутник V», ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) [10], Ad26.COV2.S (Jcovden, Janssen) [11], Ad5-nCoV (Convi-decia, CanSino) [12] и AZD1222 (Vaxzevria, AstraZeneca) [13]. Не исключено, что при аденовирусной вакцинации Ad-вирус наряду с другими типами клеток также может трансдуцировать В-лимфоциты.

Ad относятся к безоболочечным вирусам с двухце-почечной ДНК. Вирусный капсид состоит из 240 гомо-тримерных гексонов и 12 пентамерных пентонов, расположенных в вершинах икосаэдрического капсида. От основания каждого пентона отходят отростки - фиберы, которые определяют серотип и тропизм по отношению к вирусным рецепторам [14].

Ad являются платформой, безопасность которой была доказана в клинических исследованиях при системном и местном применении [15]. К настоящему времени известно > 100 серотипов Ad, из них > 50 встречаются у человека. Более детально изучено сравнительно небольшое число серотипов.

Аденовирусы обладают широким тканевым тропизмом и способны инфицировать клетки самого различного тканевого происхождения. В данной работе мы исследовали эффективность трансдукции нескольких B-клеточных линий человека, а также активированных первичных B-лимфоцитов под действием аденовирусных векторов различных серотипов. Полученные данные впоследствии могут использоваться при разработке методов направленной доставки трансгенов в В-лимфо-циты человека.

Материал и методы

Клетки. В работе использовали перевиваемые линии клеток человека: HEK293 (клетки эмбриональной почки, трансформированные областью E1 генома Ad5), NALM-6 (клетки острого лимфобластного лейкоза), Ramos (клетки лимфомы Беркитта), IM-9 (клетки множественной миеломы) и RPMI-8226 (клетки плаз-мацитомы). Клетки культивировали в среде DMEM/ F12 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина (все реагенты «ПанЭко», Россия). Мононуклеарные клетки периферической крови здоровых доноров выделяли центрифугированием в градиенте плотности фиколла-верографина («ПанЭко»).

Участники исследования. В исследовании приняли участие 11 здоровых добровольцев (8 женщин и 3 мужчины, средний возраст - 25 лет, в диапазоне от 21 года до 27 лет). Исследование было выполнено в соответствии с Хельсинкской декларацией Всемирной медицинской ассоциации «Этические принципы проведения научных медицинских исследований с участием человека в качестве испытуемого». Письменное информированное согласие было получено от каждого участника исследования перед выполнением каких-либо процедур исследования. Протокол исследования был рассмотрен и одобрен этическим комитетом ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России (№ 3-1, 11 марта 2020 г.).

Стимуляция лимфоцитов in vitro. B-лимфоциты обогащали из мононуклеарной фракции крови методом отрицательной иммуномагнитной сепарации с использованием набора Dynabeads Untouched human B cell kit (Thermo Fisher Scientifi c, Cat. No. 11351D, США). Выделенные B-лимфоциты культивировали в среде DMEM/F12 с добавлением 10 % фетальной бычьей сыворотки, 24 мкг/мл гентамицина, 1 мМ пирувата

натрия, 10 мМ HEPES (все реагенты «ПанЭко», Россия). К клеткам добавляли стимулирующую смесь лим-фокинов, которая состояла из 10 нг/мл ИЛ-21, 10 нг/мл ИЛ-4, 50 нг/мл ИЛ-2, 10 нг/мл BAFF (Peprotech, США) и 10 нг/мл mCD40L [16]. Клетки культивировали при 37 °C в 5 % CO2.

Наработка и очистка аденовирусов. В работе были использованы рекомбинантные Ad человека серотипов Ad5, Ad26 и аденовирус обезьян sAd23. Все Ad-векгоры содержали в своем составе репортерный ген GFP. Аде-новекгоры Ad5-GFP и sAd23-GFP получали путем трансфекции соответствующих плазмидных конструкций в клетки пакующей линии HEK293 с использованием реагента Metafectene Pro (Biontex, Германия), как описано ранее [17]. Получение химерного Ad5-BeK-тора, содержащего фибер аденовируса человека Ad35, описано ранее [18]. Ad-векгор на основе Ad человека 26-го серотипа Ad26-GFP был любезно предоставлен канд. биол. наук О.В. Зубковой и канд. биол. наук Т.А. Ожаровской (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России).

Рекомбинантные Ad накапливали в клетках HEK293 вплоть до развития цитопатического эффекта. Далее рекомбинантные Ad очищали и концентрировали ультрацентрифугированием лизатов зараженных клеток в градиенте плотности хлористого цезия. Концентрацию Ad в очищенном препарате определяли спекгрофо-тометрически, учитывая, что одна единица оптической плотности при 260 нм соответствует 1,12 х 1012 вирусных частиц в 1 мл. Титр препаратов Ad определяли методом бляшкообразования на клетках линии HEK293 и выражали в единицах БОЕ.

Вирусная трансдукция. Вирусные препараты разводили в культуральной среде и готовили 6 последовательных двукратных разведений. Разведенный вирус в объеме 50 мкл добавляли в лунки, содержавшие 500 000 клеток-мишеней в объеме 200 мкл. Конечная концентрация векторов варьировала от 1,875 до 2000 БОЕ. Через 48 ч флуоресценцию трансдуци-рованных клеток регистрировали с помощью проточного цитометра CytoFLEX S (Beckman Coulter, США). Популяцию живых клеток определяли по бипарамет-рическим цитограммам в координатах прямого (FCS) и бокового (SSC) светорассеяния. Доля клеток, положительных по флуоресценции GFP, отражала эффективность трансдукции. Экспрессию репортерного гена выражали в относительных единицах при измерении средней интенсивности флуоресценции (mean fluorescence intensity, MFI). Обработку цитофлуориметричес-ких данных проводили при помощи программы FlowJo (Becton Dickinson, США).

Статистическая обработка данных. Полученные данные обрабатывали с использованием программного обеспечения GraphPad Prism версия 8.4.3 (GraphPad, США). На графиках представлены медианы (столбцы), «усы» показывают 1,5-кратный межквартильный размах. Значимость различий между выборками оценивали с помощью критерия Вилкоксона.

э

NALM-6

7,5 15 30 60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/клетку

100

80-

^ 60-

+ "

Рч

£ 40200-

Ramos

7,5 15 30 60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/клетку

IM-9

RPMI-8226

100

80 60

+

P

g 40 20 0

7,5 15 30 60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/клетку

100 -| 8060-

+ Рч

g 40200-

7,5 15 30 60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/клетку

э

10080-

ä? 60-

+

Рч

S 40200-

HEK293

30

60

125 250 500 БОЕ/клетку

1000 2000

Ad5 sAd23 Ad26 Ad5/35

Рис. 1. Трансдукция клеточных линий с помощью различных серотипов Ad

Доля ОКР+-клеток при трансдукции лимфоидных клеточных линий (А) и нелимфоидной линии НЕК293 (Б) в зависимости от дозы вируса.

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Результаты

Трансдукция В-клеточных линий с помощью аденовирусов различных серотипов

В-клетки в своем развитии проходят несколько стадий дифференцировки. Восприимчивость к аденовирусной инфекции может зависеть от степени созревания В-клеток. Для того, чтобы оценить эту зависимость, мы изучили взаимосвязь между эффективностью трансдукции и дозой вируса для четырех В-клеточных линий, которые отличались друг от друга по степени дифференцировки. Использовали клеточные линии NALM-6, Ramos, IM-9 и RPMI-8226, которые были получены от пациентов с острым лимфобластным лейкозом, лимфомой Беркитта, множественной миело-мой и плазмацитомой соответственно. Эти клетки по своей дифференцировке примерно соответствуют стадиям пре-В-лимфоцитов, В-лимфоцитов из зародыше-

вых центров вторичных лимфоидных тканей (зрелые наивные В-клетки), а также ранних и более поздних плазмабластов соответственно. В качестве нелимфо-идных клеток мы использовали культуру НЕК293. Все типы клеток были протестированы на инфекцию аденовирусами четырех серотипов: Ad5, sAd23, Ad26 и Ad5/35. Эффективность трансдукции оценивали по доле ОБР-позитивных клеток и по средней интенсивности флуоресценции (МИ), которые измеряли через 48 ч после инфекции. Для количественной характеристики дозы вируса мы использовали величину БОЕ/клетку, которую предварительно определяли методом бляшкообразования на клетках линии НЕК293. Аденовирусы использовали в дозе от 15 до 2000 БОЕ/клетку.

Судя по данным светорассеяния, аденовирусы в низких и средних дозах оказывали на клетки умеренное токсическое воздействие, при этом жизнеспособность

Ad5

sAd23

Ad26

Ad5/35

NALM-6

Ramos

IM-9

RPMI-8226

80

80

80

80

0-

80

HEK293

% от максимума

10°

104

100

104

100

104

100

TFn ........ '

104

GFP

Рис. 2. Экспрессия ОБР на В-клеточных линиях и нелимфоидных клетках НЕК293, трансдуцированных с помощьюЛё-ОБР различных серотипов

Здесь и на рис. 4: цифрами указаны доля ОИР+-клеток и средняя интенсивность флуоресценции (МИ!) в относительных единицах.

оставалась не ниже 70 %. При высоких дозах 1000 и 2000 БОЕ/клетку жизнеспособность заметно снижалась. Наиболее чувствительными оказались клетки 1М-9, для которых при инфекции вектором sAd23 и Лё26 в дозе 2000 БОЕ/клетку жизнеспособность не превышала 40 и 10 % соответственно.

Наиболее восприимчивыми к инфекции проявили себя клетки КРМ1-8226. После трансдукции > 90 %

этих клеток экспрессировали ОБР. По этому показателю они приближались к нелимфоидным клеткам НЕК293 (рис. 1). При трансдукции с помощью векторов Лё26 и Лё35 в дозах от 250 до 2000 БОЕ/клетку уровень флуоресценции ОБР выходил за пределы детекции на цито-метре. Даже низкие дозы вирусов (от 15 до 250 БОЕ/ клетку) обеспечивали очень высокие уровни флуоресценции клеток ИРМ1-8226 (рис. 2).

0

0

0

0

Р-

ü С

60 -,

40 -

20 -

Ad5

р-

с

60 п

40 -

20 -

60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/В-клетку

Ad26

60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/В-клетку

60 -,

40-

Р-

ü С

20-

sAd23

60 п

40-

Р-

ü С

20-

60 125 250 500 1000 2000 БОЕ/В-клетку

Ad5/35

ж i Í

lili

15 30 60 125 250 500 БОЕ/В-клетку

Рис. 3. Доля ОБР+-клеток при трансдукции первичных активированных В-лимфоцитов с помощью различных серотипов Ad Каждая точка представляет образец В-клеток, полученный от добровольца.

0

0

0

0

Наиболее резистентными к аденовирусной инфекции являлись клетки NALM-6: в некоторой степени они трансдуцировались векторами Ad26 и Ad35 (65 и 66 %), незначительно - вектором sAd23 (18 %) и минимально -вектором Ad5. Клетки Ramos и IM-9 по чувствительности к инфекции занимали промежуточное положение, при этом клетки Ramos трансдуцировались несколько более успешно, чем IM-9. При сравнении различных серотипов наиболее инфекционным оказался Ad26, который даже в минимальных дозах трансдуцировал > 90 % клеток Ramos, IM-9 и RPMI-8226. Для NALM-6 в диапазоне от 15 до 2000 БОЕ/клетку наблюдалось прямо пропорциональное увеличение ОБР+-клеток. Ad35 по способности инфицировать клеточные культуры несколько уступал Ad26. При увеличении дозы Ad26 и Ad35 доля ОБР+-клеток, как правило, стремилась к 100 %. В отличие от этого, при инфекции вируса Ad5 в клетки Ramos и IM-9 доля ОБР+-клеток выходила на плато на уровне 70 и 40 % соответственно.

Трансдукция первичных В-лимфоцитов с помощью аденовирусных векторов различных серотипов

Ранее было показано, что Ad5 плохо инфицирует покоящиеся В-лимфоциты [19]. Учитывая это, в качестве клеток-мишеней мы использовали стимулированные В-лимфоциты. В-клетки выделяли из периферичес-

кой крови и в течение суток стимулировали в системе СБ40Ь/ПЛ-21. В этих условиях В-лимфоциты активируются, начинают пролиферировать и по поверхностному фенотипу приближаются к плазмабластам [16]. Аденовирусы добавляли непосредственно в культуру стимулированных В-клеток. Через 48 ч с помощью проточной цитометрии регистрировали ОБР-флуоресценцию.

Цитотоксическое действие Ad на активированные В-клетки оказалось более выраженным, чем в отношении В-клеточных линий. Жизнеспособность В-клеток для всех серотипов регистрировалась на уровне от 20 до 30 %.

На рис. 3 представлена зависимость доли ОБР+-клеток от дозы аденовирусов. В эксперименте были использованы В-клетки от 11 доноров. Наибольшей трансдуцирующей способностью обладал вектор Ad26. При дозе вируса 2000 БОЕ/клетку медианное значение доли ОБР+-клеток составляло 35 % (межквартильный размах - 30-40 %). Несколько меньшую активность проявлял Ad5/35 (медианное значение 16 %, межквартильный размах 13-20 %). Ad5 и sAd23 имели самую низкую трансдуцирующую активность, которая устойчиво превышала пороговый уровень только при самых высоких дозах вируса (от 1000 до 2000 БОЕ/клетку). Для векторов Ad5, Ad26 и Ad5/35 трансдуцированные клетки по экспрессии ОБР отчетливо отделялись от нетрансду-

Ad5

sAd23

Ad26

Ad5/35

80

В-клетки

% от максимума

100

104

100

10

п\ fflwt]

,4

10

iniii .......i пин iiiiiiii iiiiiiii и mu

0 104 100

10°

104

GFP

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Рис. 4. Экспрессия GFP на первичных активированных В-лимфоцитах, трансдуцированных с помощью Ad-GFP различных серотипов

цированных клеток (рис. 4). Для sAd23 интенсивность флуоресценции GFP+-KneTOK была невысокой, их популяция просматривалась как плечо на пике отрицательных клеток.

Следует отметить, что трансдукция В-лимфоцитов проходила не так эффективно, как В-клеточных линий. Это проявлялось в более низкой доле трансдуцированных клеток, а также в меньшей интенсивности флуоресценции репортерного белка. Последнее отчасти можно объяснить меньшими размерами первичных В-лимфо-цитов по сравнению с трансформированными В-клет-ками. Для всех тестированных серотипов даже при максимальных дозах вируса мы не смогли выйти на уровень плато по доле GFP+-KneTOK.

При тестировании трансдукции В-лимфоцитов под действием вектора Ad26 мы обнаружили значительную вариабельность этого параметра. Для того, чтобы выяснить, насколько эта вариабельность может отражать индивидуальные особенности конкретных доноров, для клеток двух доноров были проведены дополнительные эксперименты (n = 4); они показали отсутствие статистически значимых различий между восприимчивостью к Ad26 В-клеток этих доноров (p = 0,8438).

Обсуждение

Аденовирусные векторы отличаются высокой эффективностью трансдукции и широким спектром потенциальных клеток-мишеней. В литературе имеются отдельные упоминания о трансдукции В-лимфоцитов под действием Ad, однако эти сведения носят фрагментарный характер. Нами проведено расширенное исследование трансдукции В-лимфоцитов с помощью Ad четырех серотипов.

Теоретическая кривая зависимости доли трансдуцированных клеток от дозы вируса имеет сигмоидальную форму. При увеличении дозы вируса должно наблюдаться все более возрастающее увеличение доли трансдуцированных клеток, затем при концентрации, которую принято обозначать как TE50 (Transduction efficacy), кривая проходит точку перегиба и далее выходит на плато [20].

Величина TE50 - важная характеристика эффективности трансдукции, для ее определения желательно получить дозозависимую кривую в возможно более полном виде. Несмотря на то, что определение трансдукции мы проводили в широком диапазоне вирусных доз, который простирался более чем на два порядка, сигмоидальную кривую в полном виде мы наблюдали только при инфекции клеток Ramos с помощью Ad5 и Ad5/35. В остальных случаях в исследованную область концентраций попадала или только возрастающая часть кривой (инфекция клеток NALM-6 вирусом Ad26), или только область плато (инфекция клеток RPMI-8226 вирусами Ad26 и Ad5/35). Измерениям трансдукции при высоких дозах препятствовала высокая токсичность аденовирусов при концентрациях выше 2000 БОЕ/клетку.

Следует отметить, что в некоторых случаях доля трансдуцированных клеток достигала уровня плато, который был заметно ниже 100 %. Ранее уже отмечалось, что в некоторых случаях трансдукция клеток-мишеней под действием вирусных векторов наблюдается только в части клеточной популяции [21]. Этот эффект может сохраняться даже при высоком титре инфекционных векторных частиц. Подобное поведение мы наблюдали при инфекции клеток IM-9 с помощью векторов Ad5 и Ad5/35. Причины этого явления не вполне ясны. Возможные объяснения связаны с распределением клеток-мишеней по фазам клеточного цикла, а также с высокой неоднородностью экспрессии вирусных рецепторов в клеточной популяции. Это приводит к тому, что количество рецепторов, необходимое для инфекции, экспрессируется только на части популяции.

Одним из основных аденовирусных рецепторов является молекула CAR (Coxsackievirus-adenovirus receptor), которая участвует в связывании Ad5, sAd23 и Ad26. При инфекции Ad5 также могут быть вовлечены другие молекулы, в частности такие адгезионные молекулы, как VCAM-I и интегрины. Вирусные фиберы взаимодействуют с CAR и обеспечивают прикрепление к клетке Ad5. Последующая интернализация вируса происходит с участием молекул aV-интегрина [19].

0

CAR-рецепторы слабо экспрессируются на лимфо-идных клетках [22]. Возможно, это является причиной того, что Ad5 плохо трансдуцировал В-клеточные линии и активированные В-клетки. В отличие от этого, Ad26 демонстрировал высокий уровень трансдукции В-кле-ток. Из этого можно сделать вывод, что для инфекции вектором Ad26 CAR-рецепторы не являются лимитирующим фактором. Действительно Ad26 также эффективно использует другие типы рецепторов, например CD46 (Membrane cofactor protein), который хорошо представлен на лимфоидных клетках [6]. Эту молекулу также использует Ad35, что хорошо соответствует полученным нами результатам по высокой трансдукции с помощью этого серотипа.

Следует отметить, что Ad-векгоры по сравнению с векторами на основе аденоассоциированых вирусов более токсичны. Отчасти эта токсичность может быть связана с неполнотой очистки вирусных частиц.

Дополнительные возможности для генной терапии с помощью аденовирусов открываются при использовании модифицированных векторов. Например, в недав-

ней работе было показано, что аденовирус человека С5, фиберы которого были модифицированы мотивом RGD, способен эффективно инфицировать В-клетки in vivo [23]. Все это создает хорошую основу для разработки новых методов терапии В-клеток с помощью аденовирусных векторов.

Заключение

Серотипы Ad отличаются между собой по способности трансдуцировать В-клетки человека. Наиболее эффективную трансдукцию обеспечивает серотип Ad26. Несколько сниженной эффективностью обладает вектор Ad5, псевдотипированный фибером Ad35. Трансдукция первичных В-лимфоцитов проходит только после их активации.

Благодарности. Благодарим канд. биол. наук О.В. Зубкову и канд. биол. наук Т.А. Ожаровскую (ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России) за предоставленный препарат аденовируса человека 26-го серотипа Ad26-GFP.

■ Литература

1. Tseha S.T. Role of adenoviruses in cancer therapy. Front. Oncol. 2022; 12: 772659. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2022.772659

2. Kwakkenbos M.J., Van Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable long-term cultures of self-renewing B cells and their applications. Immunol. Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12395

3. Caeser R., Di Re M., Krupka J.A., Gao J., Lara-Chica M., Dias J.M.L., Cooke S.L., Fenner R., Usheva Z., Runge H.F.P., Beer P.A., Eldaly H., Pak H.K., Park C.S., Vassiliou G.S., Huntly B.J.P., Mupo A. Genetic modification of primary human B cells to model high-grade lymphoma. Nat. Commun. 2019; 10: 4543. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41467-019-12494-x

4. Бязрова М.Г., Михайлов A.A., Сухова M.M., Бардина М.В., Шмидт A.A., Прилииов А.Г., Филатов A.B. Трансдукция В-лимфоцитов человека с помощью аденоассоциированных вирусов различных серотипов. Иммунология. 2023; 44 (4): 443-54. DOI: https://www.doi. org//10.33029/0206-495 2-2023-44-4-443-454

5. Седова Е.С., Первойкина К.А., Щербинин Д.Н., Шмаров М.М. Генетические конструкции, выполняющие функции адъювантов, в составе вакцин на основе аденовирусных векторов. Иммунология. 2022; 43 (1): 5-17. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-5-17

6. Sharma A., Li X., Bangari D.S., Mittal S.K. Adenovirus receptors and their implications in gene delivery. Virus Research. 2009; 143: 184-94. DOI: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2009.02.010

7. Custers J., Kim D., Leyssen M., Gurwith M., Tomaka F., Robertson J., Heijnen E., Condit R., Shukarev G., Heerwegh D., van Heesbeen R., Schuitemaker H., Douoguih M., Evans E., Smith E.R., Chen R.T. Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. 2021; 39: 3081-101. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2020.09.018

8. Baden L.R., Walsh S.R., Seaman M.S., Tucker R.P., Krause K.H., Patel A. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J. Infect. Dis. 2013; 207: 240-7. DOI: https://doi.org/10.1093/infdis/jis670

9. Gilbert S.C. Adenovirus-vectored Ebola vaccines. Expert review of vaccines. 2015; 14: 1347-57. DOI: https://doi.org/10.1586/14760584.201 5.1077122

10. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatu-lin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokar-

skaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V. A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397: 671-81. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8

11. Bos R., Rutten L., Van Der Lubbe J.E.M., Bakkers M.J.G., Hardenberg G., Wegmann F. Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020; 5: 91. DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-020-00243-x

12. Zhu F.-C., Li Y.-H., Guan X.-H., Hou L.-H., Wang W.-J., Li J.-X. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020; 395: 1845-54. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31208-3

13. Voysey M., Clemens S.A.C., Madhi S.A., Weckx L.Y., Fole-gatti P.M., Aley P.K. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. Lancet. 2021; 397: 99-111. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)32661-1

14. Havenga M.J., Lemckert A.A., Ophorst O.J., Van Meijer M., Germeraad W.T., Grimbergen J., Grimbergen J., van Den Doel M.A., Vogels R., van Deutekom J., Janson A.A., de Bruijn J.D., Uytdehaag F., Quax P.H., Logtenberg T., Mehtali M., Bout A. Exploiting the natural diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease. J. Virol. 2002; 76 (9): 4612-20. DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.76.9.4612-4620.2002

15. Trivedi P.D., Byrne B.J., Corti M. Evolving horizons: adenovirus vectors' timeless influence on cancer, gene therapy and vaccines. Viruses. 2023; 15: 2378. DOI: https://doi.org/10.3390/v15122378

16. Бязрова М.Г., Порошина A.C., Сухова М.М., Фролов Е.А., Шилкина А.Б., Латышева Е.А., Латышева Т.В., Филатов A.B. Продукция цитокинов наивными В-лимфоцитами и B-клетками памяти при стимуляции in vitro. Иммунология. 2023; 44 (5): 575-85. DOI: https:// doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-5-575-585

17. Багаев A.B., Пичугин A.B., Лебедева Е.С., Лысенко A.A., Шмаров М.М., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Атауллаханов Р.И., Хаитов P.M., Гинцбург А.Л. Влияние TLR-агонистов на экспрессию в антиген-презентирующих клетках целевого белка-антигена, закодированного в аденовирусном векторе. Иммунология. 2015; 36 (4): 188-95. eLIBRARY ID: 24324492

18. Рогожин В.Н., Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., Шмаров М.М., Ходунова Е.Е., Гальцева И.В., Белоусова Р.В., Народицкий Б.С., Гинцбург А. Л. Эффективный способ доставки гена интерлейкина-2 в гемопоэтические клетки человека с использованием рекомбинант-ного аденовируса с модифицированным фибером. Acta Naturae. 2011; 3 (3): 103-10. eLIBRARY ID: 17704753.

19. Nilsson M., Ljungberg J., Richter J., Kiefer T., Magnusson M., Lieber A., Widegren B., Karlsson S., Fan X. Development of an adenoviral vector system with adenovirus serotype 35 tropism; efficient transient gene transfer into primary malignant hematopoietic cells. J. Gene Med. 2004; 6 (6): 631-41. DOI: https://doi.org/10.1002/jgm.543

20. Liang Z., Liu B., Zhao X, Liu C., Kong X. A method to mathematically determine transduction efficiency of lentivirus in HeLa cells. Gene Ther. Mol. Biol. 2013; 15: 138-46.

21. Arai T., Takada M., Ui M., Iba H. Dose-dependent transduction of vesicular stomatitis virus G protein-pseudotyped retrovirus vector into human solid tumor cell lines and murine fibroblasts. Virology. 1999; 260: 109-15. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.1999.9773

22. Rebel V.I., Hartnett S., Denham J., Chan M., Finberg R., Sieff C.A. Maturation and lineage-specific expression of the coxsackie and adenovirus receptor in hematopoietic cells. Stem. Cells. 2000; 18: 176-82. DOI: https://doi.org/10.1634/stemcells.18-3-176

23. Rice-Boucher P.J., Mendonja S.A., Alvarez A.B., Sturtz A.J., Lorincz R., Dmitriev I.P., Kashentseva E.A., Lu Z.H., Romano R., Selby M., Pingale K., Curiel D.T. Adenoviral vectors infect B lymphocytes in vivo. Mol. Ther. 2023; 31: 2600-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j. ymthe.2023.07.004

■ References

1. Tseha S.T. Role of adenoviruses in cancer therapy. Front Oncol. 2022; 12: 772659. DOI: https://doi.org/10.3389/fonc.2022.772659

2. Kwakkenbos M.J., Van Helden P.M., Beaumont T., Spits H. Stable long-term cultures of self-renewing B cells and their applications. Immunol Rev. 2016; 270: 65-77. DOI: https://doi.org/10.1111/imr.12395

3. Caeser R., Di Re M., Krupka J.A., Gao J., Lara-Chica M., Dias J.M.L., Cooke S.L., Fenner R., Usheva Z., Runge H.F.P., Beer P.A., Eldaly H., Pak H.K., Park C.S., Vassiliou G.S., Huntly B.J.P., Mupo A. Genetic modification of primary human B cells to model high-grade lymphoma. Nat Commun. 2019; 10: 4543. DOI: https://doi.org/10.1038/ s41467-019-12494-x

4. Byazrova M.G., Mikhailov A.A., Sukhova M.M., Bardina M.V., Shmidt A.A., Prilipov A.G., Filatov A.V. Transduction of human B-lympho-cytes using adeno-associated viruses of various serotypes. Immunologiya. 2023; 43 (4): 443-54. DOI: https://www.doi.org/Z10.33029/0206-4952-2023-44-4-443-454 (in Russian)

5. Sedova E.S., Pervoykina K.A., Shcherbinin D.N., Shmarov M.M. Genetic constructs as adjuvants in vaccines based on adenoviral vectors. Immunologiya. 2022; 43 (1): 5-17. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2021-42-6-5-17 (in Russian)

6. Sharma A., Li X., Bangari D.S., Mittal S.K. Adenovirus receptors and their implications in gene delivery. Virus Research. 2009; 143: 184-94. DOI: https://doi.org/10.1016/j.virusres.2009.02.010

7. Custers J., Kim D., Leyssen M., Gurwith M., Tomaka F., Robertson J., Heijnen E., Condit R., Shukarev G., Heerwegh D., van Heesbeen R., Schuitemaker H., Douoguih M., Evans E., Smith E.R., Chen R.T. Vaccines based on replication incompetent Ad26 viral vectors: Standardized template with key considerations for a risk/benefit assessment. Vaccine. 2021; 39: 3081-101. DOI: https://doi.org/10.1016/j.vaccine.2020.09.018

8. Baden L.R., Walsh S.R., Seaman M.S., Tucker R.P., Krause K.H., Patel A. First-in-human evaluation of the safety and immunogenicity of a recombinant adenovirus serotype 26 HIV-1 Env vaccine (IPCAVD 001). J Infect Dis. 2013; 207: 240-7. DOI: https://doi.org/10.1093/infdis/jis670

9. Gilbert S.C. Adenovirus-vectored Ebola vaccines. Expert review of vaccines. 2015; 14: 1347-57. DOI: https://doi.org/10.1586/14760584.201 5.1077122

10. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheblyakov D.V., Tukhvatu-lin A.I., Zubkova O.V., Dzharullaeva A.S., Kovyrshina A.V., Lubenets N.L., Grousova D.M., Erokhova A.S., Botikov A.G., Izhaeva F.M., Popova O., Ozharovskaya T.A., Esmagambetov I.B., Favorskaya I.A., Zrelkin D.I., Voronina D.V., Shcherbinin D.N., Semikhin A.S., Simakova Y.V., Tokar-skaya E.A., Egorova D.A., Shmarov M.M., Nikitenko N.A., Gushchin V.A., Smolyarchuk E.A., Zyryanov S.K., Borisevich S.V., Naroditsky B.S., Gintsburg A.L. Safety and efficacy of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet. 2021; 397: 671-81. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(21)00234-8

11. Bos R., Rutten L., Van Der Lubbe J.E.M., Bakkers M.J.G., Hardenberg G., Wegmann F. Ad26 vector-based COVID-19 vaccine encoding a prefusion-stabilized SARS-CoV-2 Spike immunogen induces potent humoral and cellular immune responses. NPJ Vaccines. 2020; 5: 91. DOI: https://doi.org/10.1038/s41541-020-00243-x

12. Zhu F.-C., Li Y.-H., Guan X.-H., Hou L.-H., Wang W.-J., Li J.-X. Safety, tolerability, and immunogenicity of a recombinant adenovirus type-5 vectored COVID-19 vaccine: a dose-escalation, open-label, non-

randomised, first-in-human trial. Lancet. 2020; 395: 1845-54. DOI: https:// doi.org/10.1016/S0140-6736(20)31208-3

13. Voysey M., Clemens S.A.C., Madhi S.A., Weckx L.Y., Fole-gatti P.M., Aley P.K. Safety and efficacy of the ChAdOx1 nCoV-19 vaccine (AZD1222) against SARS-CoV-2: an interim analysis of four randomised controlled trials in Brazil, South Africa, and the UK. Lancet. 2021; 397: 99-111. DOI: https://doi.org/10.1016/S0140-6736(20)32661-1

14. Havenga M.J., Lemckert A.A., Ophorst O.J., Van Meijer M., Germeraad W.T., Grimbergen J., Grimbergen J., van Den Doel M.A., Vogels R., van Deutekom J., Janson A.A., de Bruijn J.D., Uytdehaag F., Quax P.H., Logtenberg T., Mehtali M., Bout A. Exploiting the natural diversity in adenovirus tropism for therapy and prevention of disease. J Virol. 2002; 76 (9): 4612-20. DOI: https://doi.org/10.1128/jvi.76.9.4612-4620.2002

15. Trivedi P.D., Byrne B.J., Corti M. Evolving horizons: adenovirus vectors' timeless influence on cancer, gene therapy and vaccines. Viruses. 2023; 15: 2378. DOI: https://doi.org/10.3390/v15122378

16. Byazrova M.G., Poroshina A.S., Sukhova M.M., Frolov E.A., Shilkina A.B., Latysheva E.A., Latysheva T. V., Filatov A.V. Production of cytokines by in vitro stimulated naive B lymphocytes and memory B cells. Immunologiya. 2023; 44 (5): 575-85. DOI: https://doi.org/10.33029/0206-4952-2023-44-5-575-585 (in Russian)

17. Bagaev A.V., Pichugin A.V., Lebedeva E.S., Lysenko A.A., Shmarov M.M., Logunov D.Yu., Naroditsky B.S., Ataullakhanov R.I., Khai-tov R.M., Gintsburg A.L. Influence of TLR-agonists on expression by antigen-presenting cells of the target protein antigen encoded in adenoviral vector. Immunologiya. 2015; 36 (4): 188-95. eLIBRARY ID: 24324492. (in Russian)

18. Rogozhin V.N., Logunov D.Y., Shchebliakov D.V., Shmarov M.M., Khodunova E.E., Galtseva I.V., et al. An Efficient Method for the Delivery of the Interleukin-2 Gene to Human Hematopoietic Cells using the Fiber-Modified Recombinant Adenovirus. Acta Naturae. 2011; 3 (3): 103-10. eLIBRARY ID: 17704753.

19. Nilsson M., Ljungberg J., Richter J., Kiefer T., Magnusson M., Lieber A., Widegren B., Karlsson S., Fan X. Development of an adenoviral vector system with adenovirus serotype 35 tropism; efficient transient gene transfer into primary malignant hematopoietic cells. J Gene Med. 2004; 6 (6): 631-41. DOI: https://doi.org/10.1002/jgm.543

20. Liang Z., Liu B., Zhao X, Liu C., Kong X. A method to mathematically determine transduction efficiency of lentivirus in HeLa cells. Gene Ther Mol Biol. 2013; 15: 138-46.

21. Arai T., Takada M., Ui M., Iba H. Dose-dependent transduction of vesicular stomatitis virus G protein-pseudotyped retrovirus vector into human solid tumor cell lines and murine fibroblasts. Virology. 1999; 260: 109-15. DOI: https://doi.org/10.1006/viro.1999.9773

22. Rebel V.I., Hartnett S., Denham J., Chan M., Finberg R., Sieff C.A. Maturation and lineage-specific expression of the coxsackie and adenovirus receptor in hematopoietic cells. Stem Cells. 2000; 18: 176-82. DOI: https://doi.org/10.1634/stemcells.18-3-176

23. Rice-Boucher P.J., Mendonja S.A., Alvarez A.B., Sturtz A.J., Lorincz R., Dmitriev I.P., Kashentseva E.A., Lu Z.H., Romano R., Selby M., Pingale K., Curiel D.T. Adenoviral vectors infect B lymphocytes in vivo. Mol Ther. 2023; 31: 2600-11. DOI: https://doi.org/10.1016/j. ymthe.2023.07.004

Сведения об авторах

Сухова Мария Михайловна - мл. науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; аспирант каф. иммунологии биол. факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: mary.sukhova13@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4572-1878

Бязрова Мария Георгиевна - науч. сотр. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; ассистент каф. иммунологии ФГАОУ ВО «РУДН им. П. Лумумбы» Минобрнауки России, Москва, Российская Федерация E-mail: mbyazrova@list.ru https://orcid.org/0000-0002-9858-7596

Банделюк Алина Сергеевна - мл. науч. сотр. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: alinabond88@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-8453-797X

Михайлов Артем Андреевич - лаборант лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; студент каф. иммунологии биол. факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация

E-mail: artem.mihaylov.2001@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-8356-8077

Шмаров Максим Михайлович - д-р биол. наук, зав. лаб. молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИЦЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздрава России, Москва, Российская Федерация

E-mail: ribozym@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-5268-1296

Филатов Александр Васильевич - д-р биол. наук, проф., зав. лаб. иммунохимии ФГБУ «ГНЦ Институт иммунологии» ФМБА России; проф. каф. иммунологии биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова, Москва, Российская Федерация E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

Authors' information

Maria M. Sukhova - Technician of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomono-sov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: mary.sukhova13@gmail.com https://orcid.org/0000-0002-4572-1878

Maria G. Byazrova - Researcher of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; PhD Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V Lo-monosov MSU; Assistant of Immunology Chair, RUDN named after P. Lumumba of the MSHE of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: mbyazrova@list.ru https://orcid.org/0000-0002-9858-7596

Alina S. Bandelyuk - Junior Researcher of the Molecular Biotechnology Lab., N.F. Gamaleya NRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: alinabond88@mail.ru https://orcid.org/0000-0001-8453-797X

Artem A. Mikhailov - Technician of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Student of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V Lomono-sov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: artem.mihaylov.2001@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-8356-8077

Maksim M. Shmarov - Dr.Sci., PhD, Head of the Molecular Biotechnology Lab., N.F. Gamaleya NRCEM, MOH of Russia, Moscow, Russian Federation E-mail: ribozym@mail.ru https://orcid.org/0000-0002-5268-1296

Alexander V. Filatov - Dr.Sci., PhD, Prof., Head of the Immunochemistry Lab., NRC Institute of Immunology, FMBA of Russia; Prof. of Immunology Chair, Biology Faculty, M.V. Lomonosov MSU, Moscow, Russian Federation E-mail: avfilat@yandex.ru https://orcid.org/0000-0002-6460-9427

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.