ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО ПРЕПАРАТА ЛИЗОМУСТИНА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

при создании образов на сцене, в зрительном лазерно опасной зоны при строгом соблюдении

зале, то есть при использовании рассеянного правил техники безопасности.

лазерного излучения, возможно за пределами Поступила 25.02.10

УДК 615.015.35:615.277.3

Г.И. Сидорин, М.А. Битти, Л.В. Луковникова, Л.И. Дьякова, Н.И. Сходкина,

О.С. Черкащенко

ТОКСИКОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРОТИВООПУХОЛЕВОГО

ПРЕПАРАТА ЛИЗОМУСТИНА

ФГУН Северо-Западный научный центр гигиены и общественного здоровья, г. Санкт- Петербург

Представлены материалы по экспериментальному исследованию токсичности и опасности с целью обоснования гигиенического регламента для воздуха рабочей зоны противоопухолевого лекарственного препарата лизомустина: данные о параметрах острой токсичности, результатах оценки раздражающего, резорбтивного, сенсибилизирующего действия; мутагенном и кумулятивном эффекте, влиянии на репродуктивную функцию.

Ключевые слова: лизомустин, параметры токсичности и опасности.

G.I. Sidorin, MA. Bitty, L.V. Lukovnikova, L.I. Dyakova, N.I. Skhodkina, O.S. Tcherkashenko. Toxicologic characteristics of anti-tumor medication lisomustine. The authors presented materials on experimental studies of toxicity and jeopardy to justify hygienic regulation of workplace air for antitumor medication lisomustine: data on acute toxicity, results of irritative, resorptive and sensitizing effects evaluation, mutagenous and cumulative effects, influence on reproduction.

Key words: lisomustine, toxicity and jeopardy parameters.

Лекарственные средства входят в большую группу синтетических и природных «биологически активных веществ». Они имеют специфически направленное действие, широкий возрастной диапазон применения. Попадая в окружающую среду на разных этапах производства и использования, эти вещества в той или иной степени могут оказывать вредное действие на рабочих предприятий и население [10].

Лизомустин — оригинальный лекарственный противоопухолевый препарат, относящийся к соединениям алкилирующего действия, из группы нитрозоалкилмочевин (НАМ), обладающий высокой противоопухолевой активностью. В его молекуле хлорэтилнитрозомочевина соединена с редкой аминокислотой — гомоцитрул-лином, позволяющей относительно безвредно для организма транспортировать лекарство через цитоплазматические мембраны к опухолевым клеткам. Лизомустин представляет собой смесь двух изомеров положения нитрозогруппы: 9-(2-хлорэтил) -7-нитрозо-Ь- гомоцитруллина и 9-(2-хлорэтил) -9- нитрозо -Ь- гомоцитруллина.

Основной механизм противоопухолевого действия алкилнитрозомочевин (лизомустина в том

числе) связан, главным образом, с алкилирова-нием оснований ДНК, появлением апуриновых сайтов, одно- и двутяжевых разрывов, а также ковалентных сшивок между основаниями ДНК. Эти дефекты в молекуле ДНК изменяют стабильность ее вторичной структуры, затрудняют процессы репликации и транскрипции в опухолевой клетке. Изучение фармакокинетики и биохимических механизмов действия выявило существенные отличия препарата лизомустин по сравнению с известными нитрозоалкилмочеви-нами, применяемыми в клинической практике. В экспериментах in vitro показано, что при обработке ДНК в течение 2—6 ч в нейтральной среде при 37 °С изомеры лизомустина действуют на вторичную структуру ДНК разнонаправленно:

1-й дестабилизирует ее в результате алкилиро-вания оснований продуктами своего распада, а

2-й стабилизирует ДНК благодаря межтяжевым сшивкам, образуемым хлорэтильным катионом, возникающим при его распаде. При этом действие изомеров в смеси близко к аддитивному при обработке ДНК в течение 4 ч; при большей продолжительности аддитивность нарушается, что, по мнению авторов, объясняется взаимодей-

ствием между собой продуктов распада изомеров. При этом прослеживается связь противоопухолевой активности с количественной величиной деградационного и сшивающего эффектов. При изучении лизомустина в эксперименте in vivo и in vitro показано, что препарат в однократной терапевтической дозе через 46 — 96 ч после введения ингибирует синтез ДНК в опухолевых клетках на 80 % [6].

Соединения группы производных N-нитрозо-N-алкилмочевины являются цикло- и фазонеспе-цифическими цитостатиками, ингибирующими синтез ДНК, РНК и протеинов, большинство из которых в эксперименте на всех испытуемых животных, а также по результатам эпидемиологических и клинических исследований, обладает мутагенным, эмбриотоксическим, тератогенным и канцерогенным действием [3]. Особый интерес к этим соединениям обусловлен их высокой липофильностью, что способствует проникновению препарата через гематоэнце-фалический барьер [2]. По величинам средних смертельных доз (DL50) при введении в желудок и брюшную полость производные ^нитрозо^-алкилмочевины (N- нитрозо -N- алкилкарбамида) относятся к 2 — 3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007—76).

По данным литературы, механизм токсического действия алкилнитрозомочевин также, как и противоопухолевого, связан с алкилированием оснований ДНК. При этом, действуя как универсальные ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот, эти цитостатики могут вызывать гибель клеток любых типов, не только опухолевых, но и нормальных, особенно быстро пролиферирую-щих. Поступление данных препаратов в организм оказывает токсическое действие на гемопоэз, лимфоидную и другие ткани, вызывая тромбо-цитопению, лейкопению и в меньшей степени анемию, которые являются дозо-зависимыми, отдаленными, кумулятивными, обратимыми и прогнозируемыми [9]. При повторном воздействии в токсикологических экспериментах, а также по данным клинических наблюдений, при применении цитостатиков отмечаются серьезные нарушения различных систем и функций организма. Некоторые представители класса ^нитрозо^-алкилмочевины, в частности ара-ноза (№-2^-Арабинопиранозил^ -метил-N -нитрозокарбамид), обладают местным раздражающим и кожно-резорбтивным действием. При длительном воздействии в условиях производства возрастает вероятность возникновения у работающих отдаленных последствий в виде развития злокачественных опухолей, необрати-

мых дегенеративных изменений половых желез, развития эмбритоксического и тератогенного эффектов. Изучение фармакокинетики и биохимических механизмов действия лизомусти-на выявило его существенные отличия от известных нитрозоалкилмочевин, применяемых в клинической практике. Экспериментальное и клиническое изучение показало, что препарат проявляет высокую эффективность в отношении злокачественной меланомы и рака легкого, хорошо переносится, обладает антиметастатическим действием при сравнительно низкой токсичности, что позволяет применять лизомустин для лечения тяжелых больных, больных пожилого возраста, а также в амбулаторных условиях [7]. Зарубежные хлорэтильные аналоги препарата оказывают более жесткое воздействие на организм.

В научной литературе практически отсутствуют сведения о токсичности и опасности лизому-стина, поэтому целью нашего исследования было изучение вредного действия этого препарата и решение вопроса об установлении его гигиенического регламента для воздуха рабочей зоны.

М а т е р и а л ы и м е т о д и к и. Ли-зомустин по агрегатному состоянию — порошок белого цвета с желтоватым оттенком, без запаха, с диаметром частиц 0,1—0,7 мм, плотностью 0,3—0,4 г/см3, рН 4,8—5,8 (водный 1 % раствор), плохо растворяется в воде (до 1,4 %), практически не растворяется в жирах, эфире, хлороформе; растворяется в 0,^ соляной кислоте (1 : 15); не окисляется, не гидролизуется, не полимеризуется. Минимальная суточная терапевтическая доза лизомустина составляет 0,5 г; высшая суточная доза — 1,0 г. Курс лечения — 14 дней.

Экспериментальные исследования проводи -лись на половозрелых беспородных мышах с исходным весом 18—20 г и белых беспородных крысах весом 180— 200 г. Все животные поступали из питомника РАМН «Рапполово» и содержались на стандартном рационе. Полученные экспериментальные данные подвергались статистической обработке с применением параметрической (критерий Стьюдента—Фи-шера) и непараметрической (метод Вилкоксо-на—Манна—Уитни) статистики; параметры острой токсичности рассчитывались при помощи метода пробит-анализа в модификации В.Б. Прозоровского.

Средние смертельные дозы ^Ь50) лизому-стина определяли на мышах и крысах при введении в брюшную полость. Этот путь введения обосновывался тем, что параметры токсичности при данном поступлении близки к параметрам

токсичности при поступлении через легкие. Перед введением препарат растворяли в 0,1Ы НС1. Мышам в брюшную полость препарат вводили в объеме 0,09 мл/10 г массы тела; крысам — 0,2 мл/100 г массы тела. Контрольные животные одновременно с подопытными в аналогичных объемах получали растворитель (0,1Ы раствор

НС1).

Раздражающее и кожно-резорбтивное действие исследовали путем однократной аппликации 25 % мази лизомустина на вазелиновой основе на 2/3 хвоста мышей с экспозицией 2 ч. По окончании экспозиции вещество смывали теплой водой с мылом. Действие препарата на кожу подопытных животных оценивали визуально по сравнению с исходным состоянием кожных покровов сразу после воздействия и далее ежедневно в течение 14 дней. Оценка раздражающего действия на слизистые оболочки проводилась при внесении в конъюнктивальный мешок глаза крыс лизомустина в вазелиновом масле (1 : 3) с последующей регистрацией видимых и скрытых повреждений роговицы в течение 3 сут. Скрытые повреждения роговицы выявляли с помощью 1 % раствора флюоресцеина в 2 % растворе ЫаИС03.

Исследование аллергенных свойств проводили в соответствии с МУ 1.1.578—96 методом выявления гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) на мышах весом 18—20 г, путем введения препарата в полном адъюванте Фрейн-да (ПАФ).

С целью прогнозирования потенциальной опасности лизомустина для репродуктивной функции на уровне расчетного ОБУВ = 1 мг/ м3 с учетом объема легочной вентиляции была определена эквивалентная этой концентрации доза для ежедневного парентерального введения — 0,026 мг/животное. Исследования проводились на белых беспородных крысах-самках весом 180—200 г, имеющих нормальный эстральный цикл, изученный до начала эксперимента в течение двух недель. Препарат вводили в брюшную полость подопытных животных ежедневно в течение 30 дней до спаривания. Контрольная группа в том же объеме и пути введения получала дистиллированную воду. После спаривания наблюдение за беременными животными продолжалось в течение 20 дней. На 20-й день беременности наркотизированных подопытных и контрольных животных забивали путем декапи-тации и после вскрытия определяли количество желтых тел беременности, плацент и плодов, рассчитывали до-, постимплантационную и общую внутриутробную гибель, измеряли и взвешивали

плоды и плаценты, рассчитывали показатели эмбриотоксического эффекта [12].

Мутагенное действие лизомустина изучали с помощью микроядерного теста in vivo [4]. Опыт проводился на белых беспородных мышах обоего пола. Выбор уровня доз основывался на величине максимально переносимой дозы и составил 200 мг/кг. Для подтверждения результатов эксперимента тест был проведен дважды, вторая доза составила 100 мг/кг. Через 30 ч после однократного внутрибрюшинного введения лизо-мустина в указанных дозах подопытных животных декапитировали и вымывали костный мозг из бедренных костей в эмбриональную телячью сыворотку. Аналогичным образом поступали и с контрольной группой животных, не получавшей препарата. После центрифугирования полученной смеси делали мазок из осадка, окрашивали препарат и производили исследование полихро-матофильных (ПХЭ) и нормохромных (НХЭ) эритроцитов на наличие микроядер.

Определение кумулятивных свойств лизому-стина проводили наиболее распространенным в токсикологической практике методом Lim et al. Исследуемое вещество вводили с помощью металлического зонда в желудок белых крыс ежедневно в нарастающих дозах, начиная с 0,1 DL по следующей схеме:

День I ОО I (N чО 7 0 2 I 4 2 I ОО 2 I

введения СП о 21 5 2

Ежедневно

вводимая

доза в 0,10 0,15 0,22 0,34 0,50 0,75 1,12

долях от

DL50

Критерием оценки кумуляции служила гибель подопытных животных и характер изменения в гемолизате эритроцитов активности глютати-онпероксидазы по методу А.Н. Гавриловой и Н.Ф. Хмары и восстановленного глютатиона, определяемого методом С.Ь .Е11шап в модификации С.И. Глушкова [5]. Кровь у подопытных животных отбирали на 4-, 8-, 21-е сутки при уровнях суммарных доз 0,08 г/кг, 0,2 г/кг и 1,4 г/кг соответственно. Расчет восстановленного глутатиона и глутатионпероксидазы производили на 1 грамм гемоглобина (в гемолизате эритроцитов), который определяли гемиглобинцианидным методом. Полученные результаты сравнивали с исходными величинами.

Р е з у л ь т а ты. Клиника острого отравления через 15—20 мин после введения лизо-мустина в брюшную полость характеризовалась

появлением клонико-тонических судорог, отеком передних и задних конечностей, парезом задних конечностей, адинамией. На 2-е сутки после введения отмечались диарея, тремор головы, сужение глазной щели. Гибель наступала на 2—7-е сутки. У отдельных выживших животных через

2 недели сохранялись остаточные явления отравления в виде нарушения координации («шаткая походка»). Параметры острой токсичности представлены в табл. 1.

Таким образом, по параметрам острой токсичности при введении в брюшную полость лизому-стин относится к 4 классу токсичности (по К.К. Сидорову, 1973); при введении в желудок — к

3 классу опасности (ГОСТ 12.1.007 — 76).

Результаты исследования показали, что лизо-мустин не обладает раздражающим действием на кожу и слизистые, не проникает через неповрежденные кожные покровы в концентрациях, опасных для функционального состояния организма животных; не оказывает сенсибилизирующего действия и не вызывает нарушений репродуктивной функции ни по одному из исследованных показателей на уровне исследуемой дозы.

Результаты исследования мутагенного действия лизомустина представлены в табл. 2, из которой видно, что препарат оказывает мутагенный эффект.

Для изучения кумулятивного действия ли-зомустина был выбран метод Лима и соавт., так как он позволяет достаточно объективно

выявить дозо-время-эффективную зависимость вредного действия препарата как промышленного яда, с одной стороны, и его вредное побочное действие при применении в качестве лекарственного средства, с другой. В качестве объекта исследования были использованы эритроциты, поскольку их энергетическая потребность, в том числе в восстановителях (пентозофосфатный путь), обеспечивается исключительно за счет гликолиза [8, 11]. Система производства восстановителей, как основная защита эритроцита при возрастании окислительной нагрузки, обладает пороговым поведением. До некоторого значения скорости система по степени восстановленности глютатиона находится, практически, в физиологическом состоянии и может существовать в этом состоянии повышенной окислительной нагрузки длительное время. Дальнейшее увеличение скорости окисления приводит к «срыву», уровень восстановленного глютатиона падает почти до нуля с последующим разрушением эритроцита [1].

Наши исследования показали, что в начале при возрастающей нагрузке лизомустином содержание восстановленного глютатиона также возрастало, однако при дальнейшем поступлении препарата наступало резкое его падение с последующей гибелью животных (рис. 1).

Коэффициент кумуляции лизомустина по показателю гибели животных равен 6, что соответствует 4 классу слабо кумулирующих соединений. При этом следует отметить, что восстанови-

Т а б л и ц а 1

Параметры острой токсичности лизомустина

Вид животных Путь введения Доза, мг/кг

DL16 DL50 DL84

Крысы В брюшную полость 165 209 (183,3 — 238,3) 254

В желудок 653 (расчет.*)

Мыши В брюшную полость 220 268 (237,2 — 302,8) 322

Примечание: * DL50 в/б = 0,32 DL50 в/ж (С.Д. Заугольников и соавт., 1978).

Т а б л и ц а 2

Результаты исследования мутагенного действия лизомустина методом микроядерного теста на мышах

Пол животных Группы животных Доза 100 мг/кг Доза 200 мг/кг

ПХЭ/НХЭ Содержание ПХЭ с микроядрами (ед./500 ПХЭ) ПХЭ/НХЭ Содержание ПХЭ с микроядрами (ед./500 ПХЭ)

Самцы Контроль 0,93 ± 0,08 0,7 1,00 ± 0,06 0,9

Опыт 0,83 ± 0,09 3,5* 0,84 ± 0,05 9,0*

Самки Контроль 1,29 ± 0,14 0,9 0,91 ± 0,13 0,9

Опыт 0,83 ± 0,07* 3,4* 0,74 ± 0,09 5,6*

* Результат статистически достоверен по сравнению с контролем, р < 0,05.

тельный потенциал глютатиона, обеспечиваемый потоком энергии пентозофосфатного пути, достаточно высок, так как гибель животных наступала после введения 6 DL50.

Падение массы, как интегрального показателя, указывает на истощение компенсаторных механизмов организма, связанных с нарушением образования энергопродукции. На это косвенно указывает на снижение содержания гемоглобина. Результаты, полученные нами in vivo при нагрузке токсикантом, согласуются с теоретическими и экспериментальными данными о динамике восстановленного глютатиона, полученными на эритроцитах в экспериментах in vitro (11). Что касается глютатионпероксидазы, то ее активность достоверно возрастала, начиная с первых доз введения, что также свидетельствует о высокой потенциальной возможности защитных механизмов глютатиона (рис. 2). При этом общее состояние организма значительно ухудшалось, судя по достоверному падению массы тела животных, носящего практически линейный характер в зависимости от вводимых доз на всем протяжении эксперимента (рис. 3).

В ы в о д ы. 1. Лизомустин относится к производным N-нитрозо-N-алкилкарбамида — высокоактивным лекарственным средствам (с потенциальной возможностью проявления отдаленного эффекта: признанных канцерогенами — 1—2А группы в соответствии с

мкМ/гНЬ

0,7

у = 0,570e-1-14* R2 = 0,884

0 0,5 1 1,5

Суммарная доза (г/кг)

восстановленный глутатион;

* р< 0,05

линия тренда;

Рис.1. Изменение содержания восстановленного глутати-она в гемолизате эритроцитов белых крыс при введении лизомустина в брюшную полость в нарастающих дозах

новой классификацией МАИР). 2. По параметрам острой токсичности лизомустин относится к 4 классу токсичности и 3 классу опасности, обладает мутагенным действием. 3. Лизомустин, вводимый ежедневно в течение 30 дней в дозе 0,026 мг/животное, не вызывал нарушений репродуктивной функции у экспериментальных животных. 4. При

Рис.2. Изменение активности глутатионпероксидазы в гемолизате эритроцитов белых крыс при введении лизо-мустина в брюшную полость в нарастающих дозах

масса тела;

линия тренда

Рис. 3. Изменение массы тела белых крыс при введении лизомустина в брюшную полость в нарастающих дозах

производстве лизомустина данное вещество должно отсутствовать в воздухе рабочей зоны и на кожных покровах при определении наиболее чувствительными методами (нижний предел измерения 0,001 мг/м3) по аналогии с Ы'-2-Ь-Арабинопиранозил-Ы-метил-N-нитрозокарбамидом (ГН 2.2.5.1313 — 03; п. 191).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Атауллаханов Ф.И., Вивицкий В.М., Жаботин-ский А.Н. и др. // Известия АН СССР. Сер. биологическая. 1982. № 3. С. 406—418.

2. Багирова В.Л., Рышкова Н.Е., Оборотова Н.А. // Ведомости НЦ ЭГКПС. 1999. № 1. С. 15—19.

3. Вредные химические вещества. Азотсодержащие органические соединения: Справ. изд. / / Т.П. Арбузова, Л.А. Базарова, Э.Л. Балабанова и др.; Под ред. Б.А. Курляндского и др. Л.: Химия, 1992. С. 345—353.

4. Гигиенические критерии состояния окружающей среды 51: Руководство по краткосрочным тестам для выявления мутагенных и канцерогенных химических веществ.

Женева: ВОЗ,1989. С. 108—123.

5. Глушков С.И., Кашуро В.А., Карпищенко А.И. и др. // Нефрология. 2006. № 2. С. 81—85.

6. Давыдов М.И., Барышников А.Ю. Экспериментальная онкология на рубеже веков. М.: Изд. группа

РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН, 2003. С. 147—159.

7. Купчан Д.З., Мазнюк Н.В. // Химиотерапия противоопухолевых заболеваний / Н.И. Переводчикова.

М., 2000. С. 45—84.

8. Ленинджер А. Биохимия. М.: Мир, 1974.

9. Перетовчина Н.М., Герасимова Г.К., Белоусова А.К., Барышников А.Ю. // Экспериментальная онкология на рубеже веков / Под ред. М.И. Давыдова, А.Ю. Барышникова. М., 2003. С. 147—160.

10. Рожнов Г.И., Голубева М.И., Шашкина Л.Ф., Пройнова В А. / / Материалы пленума «Угрозы здоровью человека: современные гигиенические проблемы и пути их

решения». М., 2002. С. 208—211.

11. Рябов С.И. Основы физиологии и патологии эри-тропоэза. Л.: Медицина, 1971.

12. Ускоренная оценка потенциальной опасности химических веществ для репродуктивной функции при комплексном поступлении в организм животных: Пособие для врачей-токсикологов. С.-Пб., 2000.

Поступила 25.02.10

УДК 616.24-008.4:621.57

А.Б. Гудков1, О.Н. Попова1, А.Н. Никанов2

АДАПТИВНЫЕ РЕАКЦИИ ВНЕШНЕГО ДЫХАНИЯ У РАБОТАЮЩИХ В УСЛОВИЯХ ЕВРОПЕЙСКОГО СЕВЕРА

1Северный государственный медицинский университет, г. Архангельск; 2НИЛ ФГУН Северо-Западный научный центр гигиены и общественного здоровья, г. Кировск, Мурманская обл.

В натурных климатических условиях Европейского Севера исследованы изменения в системе внешнего дыхания при вентиляции воздуха отрицательной температуры у молодых мужчин и женщин трудоспособного возраста. Выявлено, что дыхание холодным воздухом вызывает существенные изменения статических легочных объемов и емкостей, что проявляется уменьшением величины жизненной емкости легких (ЖЕЛ), резервных объемов выдоха (РО ) и вдоха (РО ), возрастанием дыхательного объема (ДО) и снижением уровня дыхания. У женщин изменения более выражены, чем у мужчин.

Ключевые слова: внешнее дыхание, дыхание холодным воздухом, молодые лица трудоспособного возраста.

A.B. Goudkov, O.N. Popova, A.N. Nikanov. Adaptive reactions of external respiration in workers of European North. Studies covered changes in external respiration system of young able-bodied males and females exposed to ambient air of negative temperature in natural climate of European North. Findings are that breathing cold air causes significant changes in static respiratory volumes and capacities, so vital lung capacity, inspiratory reserve volume and expiratory reserve volume were decreased, respiratory capacity was increased, respiratory level was decreased. Changes in the females appeared to be more than those in the males.

Key words: external respiration, breathing cold air, young able-bodied individuals.