CC BY
239
Обзоры
43
ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ В СОСУДИСТОЙ ХИРУРГИИ
Г.И. Попов, В.Н. Вавилов
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. академика И.П. Павлова, Санкт Петербург, Россия
Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого, Санкт Петербург, Россия
Tissue engineering in vascular surgery
G.I. Popov, V.N. Vavilov
The First I.P. Pavlov State Medical University, Saint-Petersburg, Russia
Peter the Great Saint-Petersburg Polytechnic University, Saint-Petersburg, Russia
Тканевая инженерия — это комплексная биомедицинская и технологическая система знаний, позволяющая конструировать и исследовать искусственные ткани и органы. Распространенность сосудистых заболеваний и необходимость создания новых материалов для проведения операций на сосудах привели к большому количеству исследований, конечной целью которых является создание искусственной артерии или вены. Настоящий обзор литературы посвящен известным методам создания искусственного сосуда, некоторые из которых уже сегодня нашли применение в клинике.
Ключевые слова: тканевая инженерия, кровеносные сосуды.
Введение
Сердечно-сосудистые заболевания являются основной причиной смертности и инвалидизации населения во всем мире. Более миллиона смертей в России в 2011 г. произошло вследствие одной из болезней системы кровообращения (БСК) [1].
В Соединенных Штатах Америки заболеваниями сердечно-сосудистой системы страдают 83,6 млн человек, а смертность от этих болезней составляет 54,6% от всех причин смерти. Таким образом, за сутки от БСК в США погибает более 2150 жителей или 1 человек каждые 40 с. Смертность при этой патологии выше, чем при онкологических и хронических легочных заболеваниях [2].
Значительную роль в лечении пациентов с БСК занимают оперативные вмешательства, нацеленные на замещение или шунтирование пораженных сосудов. Число таких операций огромно [2]. Если же прибавить больных, нуждающихся в гемодиализе из-за хронической почечной недостаточности [3], становится понятным, что потребность в «сосудистом» материале чрезвычайно высока.
В настоящее время в клинике используют аутогенные артерии, вены, консервированные алло-, ксенососуды или синтетические протезы. Но ни те, ни другие не удовлетворяют в полной мере требованиям современной сердечно-сосудистой хирургии, особенно, если дело касается реконструкции сосуда диаметром 4—6 мм и менее. Отсюда возникает необходимость создания тканеинженерного сосудистого трансплантата (ТИСТ), т.е. искусственного сосуда, полученного методами тканевой инженерии; сосуда, который имитировал бы структуру (трехслойное строение — интима, медия, адвентиция) и функцию естественной артерии или вены и был бы чувствителен к нейрогуморальному воздействию со стороны организма реципиента.
В настоящее время в тканевой инженерии сосудов активно разрабатываются, по крайней мере,
e-mail: [email protected]
Tissue engineering is a complex biomedical and technological system of knowledge allowing to make and investigate the artificial tissues and organs. Prevalence of vascular diseases and demand of bypass material in vascular surgery led to a lot of researches, with the ultimate aim to create an artificial artery or vein. This article is dedicated to review the main possible methods of artificial vessel manufacturing, some of which already have been used in a clinic.
Keywords: tissue-engineering, blood vessels.
четыре основных технологических подхода для создания искусственного сосуда: послойная тканевая инженерия, применение децеллюляризированных трансплантатов, создание искусственных сосудов из грануляционной ткани, а также на основе трубчатых полимерных матриц.
Вновь созданная «артерия» должна отвечать следующим характеристикам: быть устойчивой к инфекции, биосовместимой (не вызывать воспаление, быть не токсичной, не канцерогенной, не иммуногенной) и биостабильной; быть герметичной и тромборезистентной, но с адекватной пористостью для успешного приживления. Внутреннюю поверхность искусственного сосуда должен покрывать эндотелий. Сосуд должен иметь оптимальные биомеханические свойства: растяжимость, прочность на излом, разрыв (сила на разрыв > 1700 мм рт. ст.) и при фиксации швами (наложенные швы не должны прорезываться), выдерживать значительные перепады внутреннего давления, не формировать перегибы, находясь в организме реципиента, и сохранять передачу осевых и радиальных пульсаций. В идеальном варианте, созданная артерия должна обладать вазоактивными физиологическими свойствами, включая способность к сужению и дилатации в ответ на нервные или химические стимулы. Изготовление сосуда должно быть экономически целесообразным, быстрым и масштабируемым, а также с сохранением возможности вариировать параметры изделия (диаметр, длина и т.д.) для решения любых клинических задач [4].
Послойный метод создания сосудов
Этот метод был предложен в 1998 г. N. L'Heureux с соавт. [5]. Исследователи использовали фибробласты человека, выделенные из биоптатов кожи, эндотелиальные и гладкомышечные клетки, полученные из пупочной вены. Фибробласты и гладкомышечные клетки культивировали в условиях, стимулирующих
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
44
Обзоры
продукцию хорошо организованного внеклеточного матрикса. Через 30 сут. оба типа клеток образовывали «листки», которыми одним за другим оборачивали стержень из нержавеющей стали с тефлоновым покрытием, формируя многослойную трубку. Созданный материал, после наслаивания на него «листков» из гладкомышечных клеток для образования медии, помещали в специальный биореактор. В течение недели происходило соединение всех слоев. Для формирования адвентиции полученную конструкцию снаружи оборачивали «листками» из фибробластов. Этап созревания в биореакторе длился 8 нед., после чего материал снимали со стержня и внутренний слой населяли эндотелиальными клетками. В итоге получалась трубка, состоящая из адвентиции, медии, бесклеточной внутренней мембраны и эндотелиального слоя. Время создания такого ТИСТ составило 3 мес., сосуд имел прочность на разрыв 2000 мм рт. ст., что превышает данный показатель у большой подкожной вены (БПВ) (1680 мм рт. ст.).
Первые эксперименты показали выполнимость использования таких графтов с точки зрения их биомеханических свойств, а невысокий уровень проходимости объясняли отсутствием эндотелиальной выстилки. В дальнейшем авторы доказали, что возможно создание человеческих ТИСТ с супрафизиологической прочностью без использования химической модификации, фиксации, синтетических каркасов или экзогенных биоматериалов [6, 7].
После ряда специальных работ в 2006 г. авторы сообщили о результатах клинического исследования искусственных сосудов, полученных данным методом [8]. У десяти пациентов с терминальной стадией почечной недостаточности, находящихся на гемодиализе, была проведена оценка аутогенных ТИСТ, созданных по методике послойной тканевой инженерии. Время, затраченное на получение графтов, составило от 6 до 9 мес. Оценивали механические свойства трансплантатов в первый безопасный период исследования (3 мес.) и их эффективность в качестве артериовенозного шунта при проведении гемодиализа.
Сосуды оказались эффективны в качестве артериовенозных шунтов, их проходимость оставалась на уровне 78% через 1 мес., 60% через 3 и 6 мес. после имплантации. Серьезные осложнения развились у трех пациентов: у одного тромбоз на 12 сут., у другого — образование аневризмы на 3 сут. В основе этих осложнений лежал острый иммунный ответ, верифицированный гистологическим исследованием. У третьего пациента произошло расслоение стенки графта, приведшее к его аневризматическому расширению [9, 10].
В аналогичной работе доказана возможность получения ТИСТ по этой же методике, но с использованием мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток [11].
Оценивая послойный метод получения ТИСТ в соответствии с требованиями к «идеальному искусственному сосуду», следует отметить, что на данный момент невозможно с уверенностью говорить о полной биосовместимости полученных графтов. У двух пациентов причиной выхода из строя АВ-шунта явился сильный иммунный ответ. Так как использовались только аутогенные клетки такой эффект мог быть связан с применением фетальной бычьей сыворотки в ходе культивирования и инкубации в биореакторе. В этой связи, использование только аутогенного ма-
териала, включая сыворотки, трехслойное строение полученного сосуда, столь схожее с естественным, наличие эндотелиальной выстилки и vasa vasorum могут стать залогом получения в дальнейшем полностью биосовместимого графта. Преимуществом такого изделия является то, что оно представляет собой биологически активную и самообновляющуюся структуру, которая под воздействием организма реципиента может подвергаться ремоделированию.
Однако развитие в некоторых случаях острого иммунного ответа, длительность процесса изготовления, сопоставимая со сроками функционирования графта, лимитируют дальнейшее внедрение метода в клиническую практику, хотя исследования в данном направлении активны [12, 13].
Децеллюляризированные сосудистые
трансплантаты
Названная методика предполагает использование в качестве матрикса децеллюляризированных алло-или ксеногенных сосудов, на которых культивируют клетки, необходимые для создания «полноценных» графтов.
Выделяют физические и химические способы де-целлюляризации. К первым относят замораживание, механическое раздавливание клеток, механическое перемешивание, разрушение клеток ультразвуком. Ко вторым — обработку сосуда ионными, неионными или цвиттерионными детергентами, гипотоническими и гипертоническими растворами, хелатирующими агентами и некоторыми ферментами (трипсин, эндо- или экзонуклеазы) [14].
С помощью различных вариантов химической децеллюляризации внутренней грудной артерии [15], БПВ [16] и артерии пуповины человека [17] удалось получить сосуд, обладающий необходимыми механическими свойствами, что было подтверждено в опытах in vitro. Следует особо выделить достоинства БПВ — достаточные длина и диаметр, тонкие стенки, которые легко децеллюляризируются и позволяют мигрировать аутогенным клеткам реципиента на всю глубину стенки, простота забора и предотвращение значительных иммуногенных осложнений, которые могут наблюдаются при использовании ксенографтов.
Существует мнение, что можно применять децел-люляризированные графты без предварительного заселения их клетками [18]. Ключевым моментом при удалении клеток в этом случае является сохранение белков внутренней поверхности сосуда, которые в условиях кровотока будут способствовать реэндотелизации.
Результаты клинических исследований ТИСТ, полученных с помощью этой методики, обнадеживают. E. Chemla с соавт. (2009) использовали децеллю-ляризированный бычий мочеточник у 29 пациентов в качестве АВ-шунта [19]. Уровень проходимости этих графтов через год после имплантации составил 57%, что немного меньше по сравнению с использованными в этом исследовании протезами из политетрафторэтилена (ПТФЭ) (68%) [19]. Об успешном применении децеллюляризированной подвздошной вены, покрытой эндотелиальными и гладкомышечными клетками, в качестве графта при мезопорталь-ном шунтировании у 10-летней девочки с окклюзией портальной вены сообщили M. Olausson с соавт. (2012) [20]. Важно отметить, что такой подход
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
Обзоры
45
в лечении детей не требует назначения на длительный срок иммунносуперссивной терапии.
Децеллюляризация алло- или ксенососудов направлена на удаление клеточных антигенных компонентов в их стенке, но в процессе обработки могут пострадать элементы внеклеточного матрикса, что приведет к потере его целостности и дегенеративному разрушению конструкции трансплантата. К недостаткам децеллюляризированных биоматериалов также относят невозможность изменять содержание внеклеточного матрикса и его архитектонику, риск передачи вируса от животных, невозможность в полной мере моделировать размеры получаемых графтов.
ТИСТ из грануляционной ткани
Метод основан на работах С. Sparks (1969, 1972, 1973) [21—23], который предложил имплантировать под мышечную ткань специальные матрицы из перфорированной полой трубки со стальным полированным стержнем внутри, на который помещали протез из дакрона. Последний прорастал соединительной тканью и был использован для артериальных реконструкций. К сожалению, оказалось, что такие графты имеют очень низкий уровень проходимости [24, 25], и от этой методики отказались.
Однако эти работы стали основой для развития одного из направлений тканевой инженерии сосудов, в котором используют организм в качестве биореактора. В основе подхода лежит использование реакции организма на инородное тело. Помещенное в брюшную или плевральную полости, подкожно или в подмышечное пространство оно инкапсулируется за счет активной синтетической активности клеток фибробластического клеточного дифферона, включая миофибробласты, источником которых являются периваскулоциты и клетки костного мозга [26, 27]. Трубчатое инородное тело в брюшной или плевральной полости покрывает снаружи еще и сплошной слой мезотелиальных клеток. Последние образуются из перитонеальной или плевральной выстилки и обладают антитромбогенными свойствами, близкими к эндотелию [28]. Полученная конструкция в итоге напоминает вывернутую наизнанку стенку кровеносного сосуда.
В 1999 г. одними из первых J. Campbell с со-авт. имплантировали в брюшную полость крыс и кроликов силастиковые трубки различной длины и диаметра [29]. Через две недели они были покрыты капсулой, состоящей из описанных слоев. Капсулы были сняты со штифтов и вывернуты так, что наружный слой стал внутренним, а полученные трубки морфологически напоминали естественные сосуды: внутренняя оболочка представлена монослоем ме-зотелия, средняя выполнена миофибробластами, коллагеновыми и эластическими волокнами, наружная — коллагеновый матрикс. Полученные аутогенные графты, вшитые конец-в-конец в брюшную аорту крыс и каротидные артерии кроликов, в 70% оставались проходимыми в течение 4 мес. Толщина стенки аутопротеза после первого месяца пребывания в сосудистой позиции увеличилась с 0,18 мм (pretransplant) до 0,25 мм и в дальнейшем не менялась. Через 6 нед. созданные ТИСТ реагировали на хлорид калия, ацетилхолин и фенилэфрин сокращением или дилатацией. В среднем только 50% имплантированных силастиковых трубок оставались
свободно расположенными в брюшной полости, без образования спаек.
В следующей работе авторы помещали силасти-ковые трубки длиной до 250 мм и 1—7 мм в диаметре на 3 нед. в брюшную и плевральную полости собак [30]. Полученные капсулы снимали со стержней, но не выворачивали, и вшивали в бедренные артерии животных, в чьих перитонеальных или плевральных полостях они были префабрицированы. Проводили антиагрегантную терапию.
Всего в бедренные артерии собак было вшито 11 аутографтов: 6 без сетки, 1 с небиодеградируемой сеткой из пролена и 4 с биодеградируемой сеткой из Dexon. Укрепление графтов снаружи сетками из различных полимеров применялось с целью улучшения их механических свойств. Пять графтов без сетки и три с сеткой из Dexon оставались проходимыми в течение 3—6,5 мес. наблюдения (суммарная проходимость 72%). В итоге по данным гистологического и иммуногистохимического исследований было показано, что полученные ТИСТ имели строение, очень схожее с естественным сосудом — интима была представлена эндотелиоподобными клетками, в медии находились циркулярно расположенные гладкомышечные клетки. При изучении механических свойств было установлено, что полученные аутографты имели большую прочность, чем сонные или бедренные артерии оперированных животных.
Интересно, что ТИСТ были успешно выращены как в брюшной, так и в плевральной полостях. Это может быть использовано в будущем для коронарного шунтирования, так как аутопротез удобно создавать «на месте».
К настоящему времени показано получение ТИСТ, морфологически близких естественному сосуду и имеющих довольно высокий уровень проходимости, из грануляционной ткани в брюшной и плевральной полостях 5 видов животных (мышь, крыса, кролик, собака, овца). Аутогенность полученных графтов обеспечивает их биосовместимость. Возможность моделировать диаметр и длину стержней позволяет создавать аутографты с различными характеристиками. Процедуру получения изделий можно повторить несколько раз или, если необходимо, одновременно поместить в брюшную полость несколько стержней, и таким образом изготовить аутографт длиной до одного метра. Эти «артерии» могут стать матриксами для биологически активных веществ, включая геннотерапевтические конструкции (например, доставка за счет аденовирусного вектора антитромботического гена) [31]. Для производства таких ТИСТ не нужны специальные лаборатории со сложным оборудованием и не требуются клеточные технологии. «Выращивание» сосуда относительно дешево и занимает мало времени.
Однако у метода есть и недостатки: инвазив-ность, возможность образования сращений в брюшной или плевральной полостях, ограниченность длины графта размерами зоны для префабрикации. Идут поиски оптимального полимера для штифта, не ясно, следует ли покрывать внутреннюю поверхность исследуемых графтов эндотелиальными клетками. И, может быть, самое главное состоит в том, что исследователи, уже в течение многих лет работающие с названной методикой создания ТИСТ, до сих пор не могут получить стабильный и надежный образец графта, который можно было бы предложить для клинических исследований.
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
46
Обзоры
Методика использования трубчатых
полимерных матриц
Другим вариантом получения ТИСТ является технология, при которой используют биодеградируемые полимерные матрицы. Создание сосуда в этом случае состоит из трех этапов.
Сначала необходимо получить полимерный каркас с определенными механическими, физическими и химическими свойствами. Далее подготавливают клетки, которые под влиянием биологических стимуляторов (факторы роста, цитокины, хемокины) и механических воздействий (пульсирующий поток, растяжение) в биореакторе пролиферируют и подвергаются дифференцировке на матриксе. На завершающем этапе, уже после введения полученного ТИСТ in vivo в качестве сосудистого графта, происходит ремоделирование, деградация полимера и интеграция «сосуда» с окружающими тканями и организмом реципиента. В конечном итоге, каркас заменяется внеклеточным матриксом, который синтезируют клетки, образуя новый сосуд. Безупречный матрикс должен создавать подходящую среду для развития тканей, благоприятствовать внедрению, росту и дифференцировке клеток, интеграции с тканями реципиента. Продукты распада матрицы должны быть нетоксичными и неиммуногенными, а скорость разрушения матрикса должна соответствовать скорости образования основных элементов сосудистой стенки.
Сегодня можно выделить три основных направления в поисках идеального матрикса: первое основано на применении нативных белков человека, второе — синтетических биополимеров, третье — на совместном применении того и другого.
Пионерами использования белков стали C. Weinberg и E. Bell , которые в 1986 г. получили искусственный сосуд без применения синтетических материалов [32]. Они изготовили трубку, средний слой которой состоял из гидрогеля коллагена и бычьих гладкомышечных клеток, наружный из фибробластов и коллагена, внутренняя поверхность была засеяна эндотелиальными клетками. Для укрепления «сосуда» авторы использовали сетку из полиэтилен-терефталата, что не улучшило механические свойства конструкции и не позволило применить ее в качестве сосудистого графта.
В работах T. Matsuda с соавт. (1995) были получены ТИСТ с использованием гидрогеля из коллагена, которые были вшиты в vena cava posterior кроликов и собак с удовлетворительными результатами, однако и в этих работах исследователям пришлось прибегнуть к применению синтетического материала дакрона [33]. D. Swartz с соавт. (2005) имплантировали графты, полученные на основе гидрогеля из фибрина, в наружную югулярную вену ягнят, в двух экспериментах развилась дилатация графтов [34]. В работе B. Tschoeke с соавт. (2009) описано получение графтов из фибринового гидрогеля, биодеградируемого полимера (полилактид), гладкомышечных клеток, фибробластов и эндотелиальных клеток овцы [35]. Прочность на разрыв составила в среднем 466 мм рт. ст., что в три раза меньше прочности естественной сонной артерии овцы. Графты были успешно вшиты в каротидные артерии этих животных, однако через 6 мес. ремоделирование графта не было завершено, так как в его структуре присутствовал полимер и концентрация коллагена
составила только 40% от его содержания в нативной артерии [36].
В ряде работ удалось получить ТИСТ с использованием гидрогеля из фибрина и гладкомышечных клеток крыс с внутренним диаметром 3 мм. После 6 нед. культивирования их прочность на разрыв составила 1122 мм рт. ст. [37]. В другом исследовании фибробласты кожи человека культивировали в биореакторе, имитирующем пульсирующий ток крови, и в результате были получены графты, прочность которых на разрыв составила 1600 мм рт. ст., что сопоставимо с прочностью вен человека, однако прочность удержания швов у данных графтов была недостаточной [38].
Методика использования гидрогелей различных нативных протеинов и их комбинаций привлекательна тем, что позволяет получить конструкцию из необходимых естественных компонентов сосудистой стенки без инородных синтетических материалов. Она дает возможность заселить носители клетками на этапе создания матрикса, что должно привести к интеграции клеток и их взаимодействию с внеклеточным матриксом, посредством чего можно влиять на дальнейшую дифференцировку клеток и ремоделирование всей конструкции. Однако, как уже сказано, получить изделия с адекватными механическими свойствами пока не удается.
Другим направлением в рамках описываемой методики является использование матриксов из биодеградирующих полимеров. В сравнении с естественными протеинами, создание синтетических полимеров проще и дешевле. Модифицируя структуру, состав и способ получения, можно изменять скорость деградации, биосовместимость, эластичность и другие параметры полимера. Для синтеза каркаса ТИСТ испытаны многие материалы и среди них такие, как полилактид (PLLA) [39], сополимер молочной и гликолевой кислот (D, L-lactic-co-glycolic acid) (PLGA) [40], полигидроксибутират (P4HB) [41], сополимер полигликолевой кислоты и полиги-дроксиалканоата (PHA) [42], полигалактин [43, 44], полидиоксанон [45].
Полигликолевая кислота — самый распространенный синтетический полимер среди всех изученных. Используя его, а также перфузионный биореактор, бычьи или свиные гладкомышечные клетки, L. Niklason с соавт. (1999) получили первые ТИСТ, которые были успешно имплантированы в артериальное русло животных [46]. Во многом результаты и выводы именно этой успешной работы предопределили развитие обсуждаемой методики. Для получения удовлетворительных механических свойств графта на носителе из полигликолевой кислоты в перфузионном биореакторе гладкомышечные клетки культивировались в течение 8 нед., что оказалось достаточным для синтеза ими внеклеточного матрикса. Срок культивирования эндотелиальных клеток на внутренней поверхности графта составил еще 3 дня. Полученные ТИСТ обладали необходимыми биомеханическими свойствами, реагировали на гуморальные раздражители.
Эти сосуды были вшиты в подкожную артерию (n = 4) юкатанских миниатюрных свиней. Механические свойства графтов позволяли выполнить сосудистые анастомозы, значительного кровотечения из них не наблюдалось. При гистологическом исследовании в стенке аутографтов отмечали процесс ремоделирования. Проходимыми через 4 нед. оста-
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
Обзоры
47
лись два сосуда: один был получен с использованием ксенногенного клеточного материала, второй, в отличие от тромбированных, был изготовлен в биореакторе, имитирующем пульсирующий ток крови.
Основным препятствием в создании ТИСТ в этом случае, по мнению авторов, оказалась ограниченность пролиферативных возможностей взрослых соматических клеток. Для решения этой проблемы был проведен ряд специальных исследований, итогом которых стало использование ретровирусного вектора с геном теломеразы обратной транскриптазы для трансфицирования человеческих гладкомышечных и эндотелиальных клеток, что увеличило продолжительность их жизни и привело к образованию ТИСТ с лучшими механическими свойствами [47, 48].
Последующий поиск необходимого клеточного материала привел исследователей к использованию ММСК. Их неоспоримыми преимуществами являются простота получения, доступность, возможность детерминации дифференцировки в различные виды специализированных клеток. Первые работы в этом направлении подтвердили принципиальную возможность использования ММСК [49-51].
Z. Yong с соавт. (2008, 2011) разработали протокол применения костномозговых MМСК в качестве источника гладкомышечных клеток [52, 53]. Однако использование ММСК в соответствии с протоколом не приводило к необходимой степени их дифферен-цировки и синтезу внеклеточного матрикса, что отражалось на механических свойствах получаемых ТИСТ.
Далее L. Niklason с соавт. (2011) пытались решить проблему выбора клеточного материала, используя аллогенные гладкомышечные клетки стенки аорты [54]. После этапа культивирования клеток на матриксе из полигликолевой кислоты полученную конструкцию децеллюляризировали, изделие становилось неиммуногенным и содержало лишь внеклеточный матрикс. Полученный ТИСТ диаметром 6 мм можно было длительно хранить в специальных условиях (фосфатно-солевой буфер, phosphate-buffered saline (PBS), при 4°C) и в нужный момент использовать в качестве сосудистого кондуита. Итак, в случае использования таких ТИСТ диаметром от 3 до 6 мм период ожидания операции составляет менее месяца, за это время необходимо провести получение и культивирование эндотелиальных клеток, способных снизить риск тромбоза. Изготовленные описанным способом ТИСТ длиною 12 см без эндотелиальных клеток были вшиты в качестве артериовенозного шунта бабуинам. Через 1—6 мес. из восьми ТИСТ остались проходимыми семь (88%), один подвергся тромбозу через 3 мес. эксперимента. Изъятые сосуды обладали теми же механическими свойствами, что и исходные, без признаков кальцификации, дилатации или стенозирования. В течение 6 мес. графты были трижды удачно пунктированы. Такие же, но еще и эндотелизированные ТИСТ собаки (n = 5), длиною 3—5 см, были вшиты в качестве шунта в сонные артерии, сроки наблюдения от 1 нед. до 12 мес.; и три ТИСТ длиною 7—10 см — в качестве шунтов передней межжелудочковой ветви левой коронарной артерии, сроки наблюдения 1 мес. Проходимость первых составила 75%, вторых — 100%. Гистологическое исследование эксплантатов не выявило признаков дилатации, стенозирования или гиперплазии неоинтимы. Компания Humacyte заявляет, что такие ТИСТ без эндотелиальных клеток подходят для широкого
клинического применения, так как доступны непосредственно перед операцией, а в опытах продемонстрировали хорошую проходимость [54].
Особое место занимает еще один вариант получения ТИСТ на основе полимерных матриц без использования клеточного материала ex vivo. Первые попытки в этом направлении не были удачными, так как наблюдалась высокая частота образования аневризм [55], тем не менее дальнейшие исследования показали его перспективность [56—58].
Общепризнанным лидером в области создания и клинического применения ТИСТ является группа исследователей во главе с японским исследователем
Т. Shinoka. Основываясь на результатах своих экспериментов [59—64], авторы в 2000 г. выполнили первое в мире клиническое исследование искусственного сосуда [65]. Они успешно реконструировали легочную артерию у 4-летней девочки с использованием ТИСТ из L-полилактида и Е-капролактона (50:50), на котором в течение 10 дней культивировались «аутогенные клетки, полученные из периферической вены». Послеоперационный период протекал без осложнений, ангиография и рентгенография грудной клетки через 7 мес. не выявили признаков окклюзии или аневризматической дилатации ТИСТ. После этого еще трем пациентам было выполнено подобное вмешательство.
В дальнейшем, начиная с 2001 г., данный матрикс, совмещенный с фракцией аутогенных ММСК костного мозга, использовали в клинической практике у 44 больных: у 25 больных в качестве экстракардиального тотального кавопульмонарного шунта, у 19 — при операциях по устранению врожденных пороков сердца.
Полученные результаты клинического исследования, опубликованные группой H. Narutoshi (2010), вселяют надежду [66]. При среднем сроке наблюдения 5,8 лет ни разу не было обнаружено признаков дилатации, разрыва, инфицирования и кальцификации графтов. Применение этих ТИСТ, судя по всему, очень перспективно, так как решает проблему повторных вмешательств в детской хирургии по поводу врожденных пороков сердца и сосудов; используемые же в настоящее время синтетические протезы не обладают способностью к ремоделированию и росту.
Заключение
Тканевая инженерия сосудов — очевидный прорыв в сегодняшней медицине с несомненной перспективой в будущем. Большое число методов и подходов в данной области показывает, что идеального решения проблемы еще не найдено. Использование оригинальных технических подходов, применение стволовых и малодифференцированных клеток, достижений молекулярной биологии и генетики расширяет возможности не только дальнейшего развития четырех методов, описанных в обзоре, но и появления принципиально новых способов создания «идеальных» сосудов.
Работы по созданию аутогенных ТИСТ находятся в ряду не менее важных исследований по «выращиванию» других органов и тканей. Как следует из приведенного «обзора», в области инженерии сосудов сделано уже очень много. Определенно сложились основные тренды, видны слабые и сильные стороны каждого из них, представляются понятными их перспективы. Сейчас самыми привлекательными
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
48
Обзоры
кажутся «послойная тканевая инженерия» и методика, основанная на использовании биорезорбируе-мых матриксов. В обоих случаях получены первые вызывающие восхищение клинические результаты. Мультидисциплинарные трансляционные исследования необходимы для дальнейшего прогресса этой захватывающей области медицины. Но какой путь создания идеальных сосудов окажется лучшим, предсказать трудно. В нашей стране исследований
ЛИТЕРАТУРА:
1. Бокерия Л.А., Гудкова Р.Г. Успехи и нерешенные вопросы сердечно-сосудистой хирургии в России. В: Бюллетень НЦССХ им. А.Н. Бакулева РАМН. Материалы XYIII Всероссийского Съезда сердечно-сосудистых хирургов; 2012 25-28 ноября; Москва, Россия; 2012. 13 (6): p. 7.
2. Alan S., Mozaffarian D., Roger V.L. et al. Heart disease and stroke statistics — association 2013 update: a report from the American heart association. Circulation 2013; 127: e6-e245.
3. Бикбов Б.Т. Томилина Н.А. Состояние заместительной терапии больных с хронической почечной недостаточностью в Российской Федерации в 1998-2009 гг. (Отчет по данным Российского регистра заместительной почечной терапии). Нефрология и диализ 2011; 13(3): 150-264.
4. Thomas A.C., Campbell G.R., Campbell J.H. Advances in vascular tissue engineering. Cardiovascular Pathology 2003; 12: 271-6.
5. L'Heureux N., Paquet N., Labbe R. et al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 1998; 12: 47-9.
6. Konig G., McAllister T.N., L'Heureux N. et al. Mechanical properties of completely autologous human tissue engineered blood vessels compared to human saphenous vein and mammary artery. Biomaterials 2009; 30: 1542-50.
7. L'Heureux N., Paquet S., Labbe R. et al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 1998; 12(1): 47-9.
8. L'Heureux N., Dusserre N., Konig G. et al. Human tissue-engineered blood vessels for adult arterial revascularization. J. Nat. Med. 2006; 12(3): 361-5.
9. McAllister T.N., Maruszewski M., Garrido S. A. et al. Effectiveness of haemodialysis access with an autologous tissue-engineered vascular graft: a multicentre cohort study. Lancet 2009; 373: 1440-6.
10. L'Heureux N., Dusserre N., Marini A. et al. Technology Insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts—from research to clinical practice. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2007; 4: 389-6.
11. Zhao J., Liu L., Wei J. et al. A novel strategy to engineer small-diameter vascular grafts from marrow-derived mesenchymal stem cells. Artif. Organs 2012; 36 (I): 93-101.
12. Larsen C.C., Kligman F., Tang C. et al. A biomimetic peptide fluorosurfactant polymer for endothelialization of ePTFE with limited platelet adhesion. Biomaterials 2007; 28(24): 3537-48.
13. Peck M.K., Dusserre N., Zagalski K. et al. New biological solutions for hemodialysis access. J. Vasc. Acc. 2011; 12(3): 185-92.
14. Gilberta T.W., Sellaro T.L., Badylak S.F. Decellularization of tissues and organs. Biomaterials 2006; 27: 3675-8.
15. Ахмедов Ш.Д. Использование бесклеточного коллагенового матрикса в качестве платформы для изготовления кровеносных сосудов в сердечно-сосудистой хирургии. Ангиология и сосудистая хирургия 2012; 18(II): 7-12.
16. Schaner P.J., Martin N.D., Tulenko T.N. et al. Decellularized vein as a potential scaffold for vascular tissue engineering. J. Vasc. Surg. 2004; 40(1): 146-53.
17. Насрединов А.С., Лаврешин А.В., Анисимов С.В. и др. Децеллюляризированные артерии пуповины человека как основа тканеинженерных кровеносных сосудов малого калибра. Клеточная трансплантология и тканевая инженерия 2013; YIII(1): 66-71.
18. Dahl S.L., Kypson A.P., Lawson J.H. et al. Readily available tissue-engineered vascular grafts. Sci. Transl. Med. 2011; 3(68): 68-
9.
19. Chemla E.S., Morsy M. Randomized clinical trial comparing decellularized bovine ureter with expanded polytetrafluoroethylene for vascular access. Brit. J. Surg. 2009; 96: 34-5.
20. Olausson M., Patil P.B., Kuna V.K. et al. Transplantation of an allogenic vein bioengineered with autologous stem cells: a proof-of-concept study. Lancet 2012; 380: 230-7.
21. Sparks C.H. Autogenous grafts made to order. Ann. Thorac. Surg. 1969; 8: 104-13.
22. Sparks C.H. Silicone mandril method of femoropopliteal artery bypass. Clinical experience and surgical techniques. Am. J. Surg. 1972; 124: 244-5.
23. Sparks C.H. Silicone mandril method for growing reinforced autogenous femoro-popliteal artery grafts in situ. Ann. Surg. 1973; 177: 293-7.
по тканевой инженерии сосудов почти нет. Очевидно, что это очень сложное и затратное дело. Мы надеемся, что настоящий «обзор» привлечет российских исследователей в эту область науки.
Благодарности
Работа выполнена при финансовой поддержке гранта РНФ №14-33-00003.
24. Guidoin R., Thevenet A., Noel H.P. et al. The Sparks-Mandril arterial prosthesis: an ingenious concept, a total failure. What can we learn from it? J. Malad. Vascul. 1984; 9: 277-83.
25. Kretschmer G., Polterauer P., Wagner O. et al. Sparks grafts as arterial substitutes in the femoro-popliteal region with a postoperative follow-up of up to 54 months. Helvet. Chirurg. Act. 1981; 48: 243-7.
26. Campbell J.H., Efendy J.L., Han C.L. et al. Haemopoietic origin of myofibroblasts formed in the peritoneal cavity in response to a foreign body. J. Vasc. Res. 2000; 37: 364-7.
27. Campbell G.R., Ryan G.B. Origin of myofibroblasts in the avascular capsule around free-floating intraperitoneal blood clots. Pathology 1983; 15: 253-64.
28. Verhagen H.J., Heijnen-Snyder G.J., Pronk A. et al.
Thrombomodulin activity on mesothelial cells: perspectives for
mesothelial cells as an alternative for endothelial cells for cell seeding on vascular grafts. Brit. J. Haematol. 1996; 95: 542-7.
29. Campbell J.H., Efendy J.L., Campbell G.R. Novel vascular graft grown within recipient's own peritoneal cavity. Circ. Res. 1999; 85: 1173-8.
30. Chue W.L., Campbell G.R., Caplice N. et al. The dog peritoneal and pleural cavities as bioreactors to grow autologous artificial blood vessels. J. Vasc. Surg. 2004; 39(4): 859-67.
31. George S.J., Lloyd C.T., Angelini G.D. et al. Inhibition of late vein graft neointima formation in human and porcine models by adenovirus-mediated overexpression of tissue inhibitor of metalloproteinase-3. Circulation 2000; 101: 296-8.
32. Weinberg C.B., Bell E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science 1986; 231: 397-3.
33. Matsuda T., Miwa H. A hybrid vascular model biomimicking the hierarchic struc-ture of arterial wall: neointimal stability and neoarterial regeneration process under arte-rial circulation. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1995; 110: 988-97.
34. Swartz D.D., Russell J.A., Andreadis S.T. Engineering of fibrin-based functional and implantable small-diameter blood vessels. Am. J. Physiol. Heart Circ. Physiol. 2005; 288(3): H1451-60.
35. Tschoeke B., Flanagan T.C., Koch S. et al. Tissue-engineered small-caliber vascular graft based on a novel biodegradable composite fibrin-polylactide scaffold. Tiss. Engin. Part A 2009; 15: 1909-18.
36. Koch S., Flanagan T.C., Sachweh J.S. et al. Fibrin-polylactide-based tissue-engineered vascular graft in the arterial circulation. Biomaterials 2010; 31: 4731-9.
37. Isenberg B.C., Williams C., Tranquillo R.T. Small-diameter artificial arteries en-gineered in vitro. Circ. Res. 2006; 98: 25-35.
38. Syedain Z.H., Meier L.A., Bjork J.W. et al. Implantable arterial grafts from human fibroblasts and fibrin using a multi-graft pulsed flow-stretch bioreactor with noninvasive strength monitoring. Biomaterials 2011; 32: 714-22.
39. Hu J., Sun X., Ma H. et al. Porous nanofibrous PLLA scaffolds for vascular tissue engineering. Biomaterials 2010; 31(31): 7971-7.
40. Mooney D.J., Mazzoni C.L., Breuer C. et al. Stabilized polyglycol-ic acid fibre-based tubes for tissue engineering. Biomaterials 1996; 17: 115-24.
41. Opitz F., Schenke-Layland K., Cohnert T.U. et al. Tissue engineering of aortic tissue: dire consequence of suboptimal elastic fiber synthesis in vivo. Cardiovasc. Res. 2004; 63: 719-30
42. Shum-Tim D., Stock U., Hrkach J. et al. Tissue engineering of autologous aorta using a new biodegradable polymer. Ann. Thorac. Surg. 1999; 68: 2298-304
43. Zilla P., Deutsch M., Meinhart J. Endothelial cell transplantation. Seminars Vasc. Surg. 1999; 12: 52-63.
44. Bellon J.M., Garcia-Honduvilla N., Escudero C. et al. Mesothelial versus endothelial cell seeding: evaluation of cell adherence to a fibroblastic matrix using 111In oxine. Euro. J. Vasc. Endovasc. Surg. 1997; 13: 142-8.
45. Fox D., Vorp D.A., Greisler H.P. Bioresorbable grafts: a counterintuitive approach. In: Zilla P., Greisler H.P., editors. Tissue engineering of vascular prosthetic grafts. Austin, TX, USA: R. G. Landes; 1999. p. 489-503.
46. Niklason L.E., Gao J., Abbott W.M. et al. Functional arteries grown in vitro. Science 1999; 284: 489-93M.
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
Обзоры
49
47. McKee J.A., Banik S.S., Boyer M.J. et al. Human arteries engineered in vitro. EMBO Reports 2003; 4: 633-8
48. Poh M., Boyer M., Solan A. et al. Blood vessels engineered from human cells. Lancet 2005; 365: 2122-4.
49. Kaushal S., Amiel G.E., Guleserian K.J. et al. Functional small-diameter neovessels created using endothelial progenitor cells expanded ex vivo. Nat. Med. 2001; 7: 1035-40.
50. Kadner A., Heorstrup S.P., Zund G. et al. A new source for cardiovascular tissue engineering: Human bone marrow stromal cells. Euro. J. Cardio-Thorac. Surg. 2002; 21: 1055-60.
51. Hoerstrup S.P., Kadner A., Melnitchouk S. et al. Tissue engineering of functional trileaflet heart valves from human marrow stromal cells. Circulation 2002; 106: I143-50.
52. Gong Z., Niklason L.E. Small-diameter human vessel wall engineered from bone marrow-derived mesenchymal stem cells (hMSCs). FASEB J. 2008; 22: 1635-48.
53. Gong Z., Niklason L.E. Use of human mesenchymal stem cells as alternative source of smooth muscle cells in vessel engineering. Meth. Mol. Biol. 2011; 698: 279-94.
54. Shannon L. M. Dahl, Kypson Alan P. et al. Readily Available Tissue-Engineered Vascular Grafts. Sci. Transl. Med. 2011; 3(68): 68ra9.
55. Fox D., Vorp D.A., Greisler H.P. Bioresorbable grafts: s counterintuitive approach. In: Zilla, P., Greisler H.P., editors. Tissue engineering of vascular prosthetic grafts. Austin, TX, USA: R. G. Landes; 1999. p. 489-503.
56. Torikai K., Ichikawa H., Hirakawa K. et al. A self-renewing, tissue-engineered vascular graft for arterial reconstruction. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 136: 37-45.
57. Zavan B., Vindigni V., Lepidi S. et al. Neoarteries grown in vivo using a tissue-engineered hyaluronan-based scaffold. FASEB J. 2008; 22: 2853-61.
58. Yokota T., Ichikawa H., Matsumiya G. et al. In situ tissue regeneration using a novel tissue-engineered, small-caliber vascular graft without cell seeding. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2008; 136: 900-7.
59. Shinoka T., Shum-Tim D., Ma P.X. et al. Creation of viable pulmonary artery autografts through tissue engineering. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1998; 115: 536-45; discussion 545-6.
60. Shinoka T., Breuer C.K., Tanel R.E. et al. Tissue engineering heart valves: valve leaflet replacement study in a lamb model. Ann. Thorac. Surg. 1995; 60: S513-6.
61. Shinoka T., Ma P.X., Shum-Tim D. et al. Tissue-engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circulation 1996; 94(9 Supp l): II 164-8.
62. Shinoka T., Shum-Tim D., Ma P.X. et al. Tissue-engineered heart valve leaflets: does cell origin affect outcome? Circulation 1997; 96(9 Supp l): II 102-7.
63. Watanabe M., Shin'oka T., Tohyama S. et al. Tissue-engineered vascular autograft: inferior vena cava replacement in a dog model. Tiss. Engin. 2001; 7: 429-39.
64. Breuer C.K., Shin'oka T., Tanel R.E. et al. Tissue engineering lamb heart valve leaflets. Biotech. Bioengin. 1996; 50: 562-7.
65. Shin'oka T., Imai Y., Ikada Y. Transplantation of a tissue-engineered pulmonary artery. New Engl. J. Med. 2001; 344: 532-3.
66. Narutoshi H., Naito Y., Breuer C., Shinoka T. et al. Late-term results of tissue-engineered vascular grafts in humans. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2010; 139: 431-6.
Поступила: 23.11.2014
Гены & Клетки Том IX, № 4, 2014
