CC BY
252
О б з о р ы
23
ТКАНЕВАЯ ИНЖЕНЕРИЯ КРОВЕНОСНЫХ СОСУДОВ: СПОСОБЫ СОВМЕЩЕНИЯ КЛЕТОК И НОСИТЕЛЯ
А.С. Насрединов, А.В. Лаврешин
Федеральный медицинский исследовательский центр им. В.А. Алмазова МЗ России, Санкт-Петербург, Россия
Tissue engineering of vascular vessels: the methods of cells and scaffold combining
A.S. Nasredinov, A.V. Lavreshin
Federal Almazov Medical Research Center, Saint-Petersburg, Russia
Одним из ключевых моментов создания тканеинженерных конструкций является заселение клеток на биодеградируемый носитель. В попытке добиться быстрого, эффективного и надежного результата совмещения клеток и носителя исследователи в области тканевой инженерии кровеносных сосудов стали использовать преимущества полой трубчатой структуры матрикса в сочетании с действием различных физических сил: разницы давлений, центробежных, электростатических, магнитных сил и их комбинаций. В данном обзоре описаны основные тренды и проблемы в разработке носителей, основные клеточные типы, использующиеся для совмещения с носителями с целью создания графтов сосудов, а также различные способы совмещения носителей и клеток, их достоинства и недостатки.
Ключевые слова: заселение клеток, тканевая инженерия, кровеносные сосуды.
Аутогенные нативные сосуды остаются золотым стандартом при использовании в качестве шунтов в реконструктивной сердечно-сосудистой хирургии, однако их применение часто ограничено вследствие их патологических изменений или недостаточного количества. В таких случаях успешно используются синтетические протезы из таких недеградируемых полимеров как экспандированный политетрафторэтилен (эПТФЭ, Тефлон, GoreTex) и полиэтиленте-рефталат (Дакрон, Лавсан) с диаметром более 6 мм. Однако при меньшем диаметре результаты операций остаются неудовлетворительными вследствие развития гиперплазии интимы в области анастомозов и тромбоза шунта [1—3].
Прошло более 3 десятков лет с тех пор, как M. Herring et al. (1978) впервые описали одноэтапную технику заселения сосудистых протезов эндотелиальными клетками [4]. Эндотелиоциты соскребали скальпелем с внутреннего просвета участка подкожной вены и переносили на внутреннюю поверхность сосудистого протеза из дакрона диаметром 6 мм. Однако уже тогда было очевидно, что для улучшения отдаленных результатов реконструктивных операций необходимы функционально активные клетки, обладающие антитромбогенными свойствами [5].
В последующем были исследованы различные способы получения «эндотелизированных» протезов на основе синтетических недеградируемых материалов, но по-настоящему успешных методик разработано не было. Например, было показано, что через 24 ч после имплантации протеза 95% эндотелиальных клеток, совмещенных с ПТФЭ протезом, смывались потоком крови [6].
В последние годы получила развитие тканевая инженерия кровеносных сосудов, на которую возлагают большие надежды в качестве альтернативы использующимся синтетическим протезам [7, 8].
е-mail: vsurg@yandex.ru
Cell seeding is one of the most important stages in tissue engineering. Attempting to achieve fast, efficient and reliable result researchers in vascular tissue engineering use advantages of the tubular geometry of the grafts with conjunction of physical forces, such as pressure difference, centrifugal, electrostatic, magnetic forces and their combinations. This review describes the main trends and challenges in scaffold developing, main cellular types used for vascular tissue engineering and various methods for cell seeding, their advantages and drawbacks.
Key words: cell seeding, tissue engineering,
vascular grafts.
Тканевая инженерия сосудов в своем классическом виде основана на заселении клетками реципиента пористого биодеградируемого носителя в форме трубки нужной длины и диаметра из различных природных и синтетических полимерных материалов, который играет роль временной основы для клеток, пока те под действием внешних факторов не сформируют собственный внеклеточный матрикс [9, 10]. Образование собственного внеклеточного матрикса происходит в результате активации клеток под действием сигналов, передаваемых имплантированным носителем, который подвергается биохимическим и физическим воздействиям. «Искусственный» сосуд in vivo испытывает внешние воздействия, такие как давление, напряжение сдвига, растяжение; кроме того, в новый сосуд проникают макрофаги, которые высвобождают ангиогенные вещества, и все это постепенно приводит к формированию зрелого сосуда [9—11]. Так, известно, что аутовенозный шунт после имплантации приобретает многие свойства артерии: в нем увеличивается количество и размеры гладкомышечных клеток (ГМК) среднего слоя, за счет чего утолщается вся стенка шунта [12].
Таким образом, основу тканевой инженерии сосудов составляют четыре основных компонента:
1) носитель, подходящий для совмещения с кле-тами;
2) клетки, которые могут быть эффективно совмещены с носителем;
3) способ совмещения носителя и клеток;
4) гуморальные и механические влияния окружающей среды, межклеточные взаимодействия.
Все эти факторы оказывают значительное влияние на создание высокорганизованной сосудистой стенки.
Считается, что именно совмещение клеток с носителем является ключевым моментом создания
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
24
О б з о р ы
тканеинженерных кровеносных сосудов (ТИКС) [13—16]. В нескольких исследованиях было доказано, что независимо от типа основы будущего сосуда наличие клеток улучшает его проходимость [17—19]. В настоящее время нет единого стандартизированного подхода к способу заселения клетками трехмерного матрикса. За последние три десятилетия было предложено множество способов, но большинство из них слишком длительны, связаны с нежелательным воздействием на клетки и применимы только в эксперименте [20, 21]. Для возможности получения необходимого для удовлетворения клинических потребностей количества сосудистых заменителей малого диаметра (менее 6 мм), которые считаются утопией, «Священным Граалем» тканевой инженерии сосудов [22, 23], необходимо разработать надежный, недорогой и эффективный способ совмещения клеток и носителя [24]. При этом, следует иметь в виду, что нельзя рассматривать способы заселения носителей клетками, не обсуждая при этом сами носители и клетки. В настоящей работе представлен обзор исследований, посвященных использованию клеток в тканевой инженерии сосудов малого калибра и различным способам заселения ими матрикса сосудов.
Основные тренды и проблемы в разработке
носителей
Биодеградируемый полимерный носитель выполняет роль временной трехмерной основы для клеток, пока они не сформируют свой собственный внеклеточный матрикс. Это очень важная часть будущего сосуда, которая выполняет несколько функций. Во-первых, она позволяет расположить клеточный компонент в трехмерном пространстве. Во-вторых, он задает механические свойства сосуда, такие как прочность и форма [9, 10].
Для создания ТИКС можно использовать носители как из синтетических биосовместимых и биодеградируемых полимеров [25—27], так и из естественных материалов [28—31], к которым относятся децеллюляризованные артерии [32—34].
Носители на основе синтетических
материалов
Носители из синтетических биодеградируемых материалов могут быть синтезированы в любом количестве, различных форм и размеров. Кроме того, они обладают высокой прочностью, могут быть про-стерилизованы и храниться в стандартных условиях достаточно долгое время без потери своих свойств [10, 22, 28, 35—38]. Наиболее часто используемый полимер для создания сосудистых матриксов — полигликолевая кислота (ПГК). Носители из ПГК теряют свою прочность в течение 4 нед. и полностью резорбируются к 4—6 мес. [9, 25, 35].
Одна из проблем трансплантатов, созданных на основе синтетических биодеградируемых полимеров, заключается в скорости биодеградации, которая должна точно соответствовать скорости образования собственного внеклеточного матрикса сосуда [9, 22]. Необходимо учитывать, что скорость продукции компонентов внеклеточного матрикса клетками вариабельна, особенно в зависимости от возраста пациентов. Если разрушение носителя произойдет быстрее, чем сформируется нормальная стенка
сосуда, то это создаст риск разрыва трансплантата и кровотечения.
Скорость биодеградации можно варьировать, образуя комбинации ПГК с другими полимерами, например, с полигидроксиалканоатами [39—41], полимолочной кислотой (ПМК) [42, 43], поли(е-капролактоном) [7, 42] и полиэтиленгликолем [44]. Полученный материал, из которого изготавливают носители, определяет и механические свойства каркаса, и регулирует фенотип клеток, с ним совмещенных [36].
Стоит отметить, что, несмотря на то, что сама ПГК обладает хорошей биосовместимостью, продукты ее распада могут вызвать воспалительный ответ [45, 46]. Носители из ПГК подвергаются гидролизу с образованием воды и углекислого газа [9, 25, 35].
T. Higgins et al. (2005) обнаружили, что углекислота, образующаяся в результате деградации ПКГ, может привести к дедифференцировке и снижению пролиферативной активности гладкомышечных клеток [38].
Степень пористости, как и размер пор синтетического носителя, очень важны, и этот вопрос обсуждается в литературе. Большинством исследователей оптимальным размером пор носителя считается 100—150 мкм [47—49]. Размер пор определяет не только способ совмещения носителя с клетками и его эффективность, но также влияет на поведение клеток после заселения [36, 48, 49]. Чем крупнее поры носителя, тем проще, быстрее и равномернее можно произвести заселение его клетками [9, 50]. Также это способствует более легкому совмещению клеток с носителем, лучшей диффузии питательных веществ после имплантации и последующей неоваскуляризации. Для того, чтобы крупнопористые графты могли выдержать давление кровотока и не «протекать» после трансплантации, проводится предварительное инкубирование in vitro, как правило, в специальном биореакторе, чтобы клетки могли сформировать свой собственный внеклеточный матрикс [51]. Методика желирования клеточной суспензии после совмещения с носителем не используется.
Таким образом, главное преимущество носителей из синтетических биодеградируемых материалов заключается в удобстве и воспроизводимости их создания с заданными параметрами, такими как диаметр, толщина стенки, скорость деградации, пористость и размер пор. Это, в совокупности с биосовместимостью материалов, обеспечивающей рост клеток на них и отсутствие реакции со стороны реципиента, а также их достаточной механической прочностью, обеспечило их широкое применение в разработке ТИКС. Примерами успешного использования ТИКС на основе носителей из синтетических материалов как в эксперименте, так и в клинике могут служить работы L. Niklason et al. (1999) [37], D. Shum-Tim et al. (1999) [39] и T. Shin'oka et al. (2005) [7].
Носители на основе натуральных (естественных)
материалов
Носители на основе коллагена
Очевидны преимущества применения естественных полимеров для создания основы будущего сосуда, из которых наиболее широко используется коллаген [52]. Первыми, кто сообщил о создании сосуда in vitro, были C. Weinberg и E. Bell в 1986 г. [53]. Многослойная структура графтов напомина-
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
О б з о р ы
25
ла структуру артерии. Для создания ТИКС были использованы коллаген, фибробласты, лейомиоциты и эндотелиальные клетки бычьей аорты. Для усиления механической прочности в стенку протеза помещалась сетка из дакрона. Сосудистые кондуиты, созданные без такой сетки, расширялись и разрывались при очень низких внутрипросветных давлениях (10 мм рт. ст.). У протеза с одной сеткой прочность на разрыв была 40—70 мм рт. ст., тогда как три слоя коллагена, чередующиеся с двумя сетками, обеспечивали прочность на разрыв до 120—180 мм рт. ст.
Причинами недостаточных механических свойств протезов, по мнению авторов, явились отсутствие эластина, продольная (вместо циркулярной) ориентация гладкомышечных клеток, низкая плотность лейомиоцитов и коллагена. Однако наличие высоко дифференцированных гладкомышечных клеток и функционального эндотелия, который синтезировал фактор фон Виллебранда и простациклины, привлекло внимание к данному виду протезов кровеносных сосудов, что стало причиной дальнейших исследований в этой области.
J. Hirai et al. (1994, 1996) заливали раствор, содержащий гладкомышечные клетки собачьей яремной вены и коллаген I типа, в стеклянную форму, получая при этом гибридную ткань в виде трубки, внутренняя поверхность которой была засеяна эндотелиоцитами яремной вены собаки [54, 55]. Получившийся ТИКС был вшит в нижнюю полую вену собаки. Несмотря на низкое давление в вене, протез разорвался в течение нескольких дней после операции. Последующие протезы были обернуты сеткой из дакрона, чтобы предотвратить разрыв, их проходимость при этом составила 64% через 6 мес. О полной перестройке графта свидетельствовало образование продольно-ориентированного эндотелиального монослоя на внутренней поверхности, наличие циркулярно-ориентированных лейомио-цитов контрактильного фенотипа в субинтимальном слое, вросших фибробластов по всей толще сосудистой стенки, сети волокон коллагена в межклеточном пространстве и образование мембраны из эластина в субинтимальном слое. Однако синтезировать достаточно протяженную конструкцию из коллагена со структурой нативного сосуда пока не удается. Кроме того, до сих пор не решена проблема недостаточной механической прочности искусственных сосудов с основой из коллагена [22].
Носители на основе децеллюляризованных
сосудов
Интересным выглядит предложение использовать в качестве биодеградируемого носителя аллогенный или ксеногенный кровеносный сосуд, удалив из него все клеточные элементы, оставив только внеклеточный матрикс [32, 34, 56, 57]. Этот процесс называется децеллюляризация и заключается в наиболее полном удалении клеток и их остатков (клеточного дебриса) с минимальным повреждением соединительнотканного каркаса сосуда, который должен быть пригоден для дальнейшего заселения клетками реципиента (рецеллюляризации).
Преимущества внеклеточного матрикса кровеносных сосудов, полученных методом децеллюля-ризации, заключаются в их естественной структуре, сохраненной механической прочности, отсутствии синтетических материалов, минимальных имму-
ногенных свойствах, максимально благоприятных условиях для роста клеток реципиента [57—59]. В связи с этим не удивительно, что в настоящее время большинство стратегий создания искусственного сосуда направлены на получение децеллюляризи-рованного соединительнотканного каркаса сосуда, который может быть засеян клетками реципиента in vitro до трансплантации [16, 22, 58, 60, 61]. Однако мелкопористая структура внеклеточного матрикса артерии затрудняет активное заселение клеток вглубь сосудистой стенки [62].
Основные типы клеток,
совмещаемые с носителями с целью создания
графтов сосудов
Наличие в составе тканеинженерного эквивалента оптимального количества функционально активных клеток, способных поддерживать соответствующий фенотип и выполнять конкретные биологические функции, является одним из основных факторов успеха [16, 34, 40, 57, 63]. Клетки пролиферируют и продуцируют компоненты внеклеточного матрикса (в частности, коллаген) соответствующей организации и структуры, выделяют цитокины и другие биологически активные вещества, а также взаимодействуют с соседними клеткам или тканями. Варианты клеток, применяющихся для создания ТИКС, весьма многочисленны.
Эндотелиальные и гладкомышечные клетки
Логичным выглядит предложение использовать высокодифференцированные клетки сосудистой стенки, а именно эндотелиоциты и гладкомышечные клетки, для получения графта сосуда. Однако их основные недостатки, такие как ограниченный пролиферативный потенциал, требовательность к питательной среде и условиям культивирования, значительно затрудняют их использование [13, 21, 64, 65].
Стволовые и прогениторные клетки
Существуют и другие потенциальные клеточные субстраты, в том числе стволовые и прогенитор-ные клетки различных типов. При этом ключевыми требованиями, предъявляемыми к таким клеточным популяциям, являются относительная доступность тканевого источника их получения, возможность их эффективной экспансии in vitro с наработкой значительного числа клеток в течение короткого времени, возможность заселения такими клетками носителей с сохранением механических свойств и, наконец, их функциональность in vivo [18, 59]. Учитывая совокупность перечисленных выше критериев, наиболее перспективными клеточными типами являются эндотелиальные прогениторные клетки (ЭПК) и мультипотентные мезенхимальные стромальные клетки (ММСК), полученные из различных источников [64—67].
Эндотелиальные прогениторные клетки
К настоящему времени идентифицировано несколько популяций ЭПК, в первую очередь, циркулирующие ЭПК периферической крови. Однако без проведения процедуры мобилизации костного мозга,
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
26
О б з о р ы
имеющей высокую стоимость и связанной с риском развития осложнений, число выделяемых из умеренного объема периферической крови ЭПК крайне невелико, а их экспансия in vitro малоэффективна из-за относительно низкого пролиферативного потенциала таких клеток [65].
С этих позиций, более оптимальной альтернативой является применение эндотелиальных клеток пупочной вены человека (HUVEC), совокупность биологических свойств которых соответствует ЭПК [68]. Такие клетки широко используются в качестве модели ЭПК, при этом они являются относительно доступным типом клеток, а их высокая пролиферативная активность обеспечивает эффективную экспансию in vitro в относительно простых условиях. Заселение внутренней поверхности носителей клетками первичных культур HUVEC позволит придать сосудам необходимые биологические характеристики, однако следует учитывать наличие у таких клеток иммуногенных свойств. Аллогенное происхождение HUVEC делает необходимым проведение иммуносупрессивной терапии, имеющей высокую стоимость и связанной с риском развития ряда побочных явлений и осложнений. До настоящего времени, применение аллогенных клеток, в том числе прогениторных клеток пуповины человека, а также специализированных клеток сосудов пуповины, таких как эндотелиоциты и гладкомышечные клетки, ограничено их использованием только в доклинических исследованиях в качестве моделей для отработки способов совмещения клеток и носителей и оценки работы сосудистых графтов в эксперименте [65, 67 ,68].
Мультипотентные мезенхимальные
стромальные клетки
ММСК обладают такими ключевыми свойствами, как высокая пролиферативная активность и способность к дифференцировке в различные типы специализированных клеток. При этом они легко могут быть получены в необходимом количестве в аутогенном варианте, в отличие от HUVEC и стволовых клеток пуповинной крови, что в совокупности делает их использование для создания ТИКС привлекательным для многих исследователей [15, 59]. Наиболее широко применяются ММСК, полученные из костного мозга (ММСК КМ), где численность их популяции составляет лишь 0,01—0,001% от общего числа ядросодержащих клеток. Однако безопасная эксплантации значительных объемов костного мозга, а также высокая пролиферативная активность ММСК КМ in vitro обеспечивают быстрое получение необходимого количества функционально активных клеток [65].
Альтернативным костному мозгу тканевым источником ММСК является жировая ткань, аспирация которой является еще более легкой и безопасной процедурой, чем пункция костного мозга. Выделение первичной популяции ММСК жировой ткани (ММСК ЖТ), экспансия in vitro до получения необходимого количества клеток является на сегодняшний день отработанной и стандартизированной методикой [64, 65, 68]. Более того, по данным ряда авторов, ММСК ЖТ обладают более высокой пролиферативной активностью по сравнению с ММСК КМ того же донора, что делает их применение в создании ТИКС еще более привлекательным [65, 69].
Совмещение носителей с ММСК разных типов позволяет получить ТИКС, функция которого будет
опосредована двумя механизмами. Во-первых, ММСК могут дифференцироваться (in vitro и in vivo) в эндотелиоциты (прямой механизм). Во-вторых, ММСК секретируют сложный комплекс цитокинов, в том числе хемоаттрактантов для циркулирующих ЭПК и индукторов/регуляторов дифференцировки ЭПК в функциональные эндотелиоциты (паракрин-ный эффект).
Способы совмещения различных носителей
и клеток
Статичный метод
В настоящее время обычным способом совмещения клеток с носителем является так называемый статичный (пассивный, гравитационный) метод, заключающийся в нанесении концентрированной клеточной суспензии с помощью пипетки непосредственно в просвет или на наружную поверхность заселяемого матрикса (рис. 1) [13, 27, 34]. Клетки под действием силы тяжести оседают на матриксе. После этого будущий сосуд помещают в чашку Петри с ростовой средой и инкубируют от нескольких часов до нескольких дней. Эффективность совмещения оценивается в процентном отношении адгезировавших на матриксе клеток к их исходному количеству. Для этой методики данный показатель составляет приблизительно 10—25% [70]. Помимо низкой эффективности использования клеточной культуры, что особенно актуально при ее ограниченном количестве, применение этой методики лимитирует минимальное проникновение клеток вглубь сосудистой стенки, что напрямую зависит от пористости носителя [13, 17, 25, 71]. С одной стороны, это может быть полезно для заселения эндотелиоцитами просвета мелкопористых носителей, поскольку при этом клетки будут адгезироваться только к внутренней поверхности графта, не проникая вглубь его стенки. С другой стороны, при статичном заселении крупнопористых носителей, наоборот, легче достигается равномерное распределение по всей толще стенки матрикса, что важно для других типов клеток, таких как гладкомышечные клетки, ММСК, фибробласты.
Рис. 1. Статичный метод совмещения клеток и носителя: 1 — пипетка; 2 — клеточная суспензия; 3 — заселяемый носитель
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
О б з о р ы
27
Трудности с достижением однородности распределения клеток по всей поверхности матрикса решаются либо путем периодического переворачивания конструкции, либо культивированием в течение достаточно продолжительного времени [13, 70]. Несмотря на то, что длительное время инкубации может повысить эффективность метода, это же может привести к повышенному риску контаминации, а также к нежелательной трансформации клеток [13, 17]. Надо также отметить, что этот метод сильно зависит от квалификации оператора, что может сказаться на его воспроизводимости [13].
Таким образом, данный подход может быть использован с любым типом носителя и клеток, но на практике чаще всего используется для децеллюля-ризованных тканей [19, 34, 57, 59]. Это связано, прежде всего, с тем, что все методы активного быстрого внедрения клеток посредством центрифугирования, вакуумирования и тому подобных процедур позволяют гораздо быстрее и равномернее совместить клетки с синтетическими носителями, и в то же время они не эффективны для децеллюляризо-ванных сосудов вследствие огромного гидродинамического сопротивления тканей [26, 72].
Использование веществ, улучшающих адгезию
клеток к носителю
Иногда, для улучшения клеточной адгезии и повышения эффективности совмещения, внутреннюю поверхность носителя предварительно покрывают одним или несколькими биологически активными веществами, из которых наиболее часто используют фибронектин, фибрин, коллаген, ламинин и плазму [73, 74]. Чаще всего эти вещества используют с синтетическими матриксами, повышая биосовместимость носителя. A. Mathews et al. (2012) совмещали мелкопористые синтетические носители из поликапролактона, покрытые фибрином, с эндотелиоцитами, получая функционально-активный эндотелиальный монослой [63]. Интересно отметить, что децеллюляризованные артерии, в отличие от синтетических носителей, не требуют такой обработки, так как они состоят практически полностью из коллагена и содержат в оптимальных количествах фибронектин, являющийся внеклеточным белком [27]. Методы покрытия ТИКС биоактивными веществами могут быть различными: от простого погружения протеза в раствор до его перфузии [17, 75].
Одной из главных проблем использования веществ, повышающих адгезию клеток, является их потенциальная тромбогенность: если адгезирующи-еся клетки не покроют всю внутреннюю поверхность носителя, то останутся «открытые» участки, доступные для прикрепления тромбоцитов и формирования тромба.
Кроме того, с целью повышения числа адгези-ровавшихся клеток исследуется возможность иммобилизации биоактивных пептидов на заселяемом матриксе. Например, трансформирующий фактор роста-p (TGF-p) может быть применен для увеличения синтеза внеклеточных белков гладкомышечными клетками и улучшения механических свойств ТИКС [76, 77]; некоторые пептиды могут способствовать клеточной адгезии и распределению клеток в толще матрикса [76, 78]. На сегодняшний момент редкое применение биоактивных пептидов
обусловлено недостаточно хорошо изученной безопасностью, возможной иммуногенностью и их потенциальным нежелательным влиянием на применяющиеся клетки [13].
Использование веществ, способствующих адгезии клеток, может оказаться полезным совместно с динамическими способами заселения, когда достигается полное покрытие внутренней поверхности ТИКС клетками.
Динамические методы
Неудовлетворенность исследователей результатами статичного засевания клеток привела к разработке целого ряда способов, основанных на ускоренной доставке клеток при действии разницы давлений, центробежных, электростатических, магнитных сил и их комбинаций. При этом значительно повышается эффективность использования клеток, однородность и глубина внедрения их в структуру носителя. Полая трубчатая структура матрикса в данном случае является преимуществом и играет ключевую роль во многих описываемых методах, соответственно их применение в тканевой инженерии других тканей ограничено.
Механическое перемешивание, вращение
Использование простого механического перемешивания питательной среды, в которой находятся совмещающиеся носитель и клетки, например, на орбитальном шейкере, позволяет повысить число контактов клеток с матриксом [79]. B. Kim et al. (1998) обратили внимание, что таким образом уже через 20 ч. количество прикрепившихся гладкомышечных клеток увеличивалось в 10 раз по сравнению со статичным заселением [26].
В ряде работ использовалось вращательное движение клеточной суспензии при помощи спиннер-фласка или магнитного миксера вокруг засеваемого матрикса, находящегося в центре культуральной емкости [26, 80, 81]. Клетки, как более тяжелые частицы, под действием центробежной силы стремились к центру емкости, образуя, таким образом, высокую концентрацию вокруг носителя, что способствовало повышению эффективности использования клеточной популяции (рис. 2). Скорость вращения составляла около 50 об./мин, продолжительность в среднем 24 ч. При этом не описаны какие-либо вредные воздействия на клетки, но отмечено улучшение циркуляции питательной среды, повышение числа контактов клеток с носителем. Тем не менее, стоит отметить, что этот способ неэффективен при низких концентрациях клеток в суспензии [82]. В связи с тем, что использование данного метода приводит к адгезии клеток на внешней стороне носителя, его применяют только в случае фибробластов, гладкомышечных клеток и ММСК.
Кроме того, повысить однородность распределения клеток в стенке матрикса можно при помощи вращения носителя, заполненного клеточной суспензией, с небольшой скоростью, от 0,16 до 5 об./мин, в горизонтальном положении [83]. Этот прием может быть использован как с эндотелиоцитами, так и с другими типами клеток, поскольку идет совмещение клеток с носителем в направлении изнутри-кнаружи. Так, в исследовании S. Wang et al. (2013) синтетический носитель из ко-полимера молоч-
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
28
О б з о р ы
ной кислоты заполняли изнутри суспензией эндо-телиоцитов, после чего обеспечивали вращение матрикса в горизонтальном положении со скоростью 5 об/мин в течение 7 дней, получая эндотелиальный монослой на внутренней поверхности графта [84]. B. Nasseri et al. (1993) совмещали миофи-бробласты с носителем из кополимера ПГК, получая к 10 дню полную инфильтрацию стенки носителя клетками [85].
В других исследованиях скорость вращения была гораздо больше — от 1000 до 6000 об./мин [70, 80, 86—88]. В данных системах использовалась центробежная сила для улучшения проникновения клеток вглубь стенки носителя. Матрикс, заполненный клеточной суспензией, вращался через свою продольную ось, чем достигалось движение клеток в направлении от условного центра графта к его стенке (рис. 3). Такие системы значительно увеличивали эффективность использования клеток: до 90% культуры проникали и однородно распределялись в структуре матрикса при небольшой продолжительности центрифугирования [70, 80, 86]. Интересно, что клетки не только сохраняли свою жизнеспособность, но и морфологию [86—88]. W. Godbey et al. (2004), в частности, показали, что совмещение гладкомышечных клеток и фибробластов с носителем из ПГК с помощью центрифугирования позволяет в течение 10 мин добиться трехкратного увеличения эффективности заселения по сравнению со статичным методом или использованием спиннер-фласка [89]. Однако чем меньше диаметр сосуда, тем выше должна быть скорость вращения для создания нужной силы относительного ускорения, и тем сложнее поддерживать ось вращения. Кроме того, стандартные центрифуги не подходят для реализации этого
Рис. 2. Динамический метод совмещения клеток и носителя: вращение:
1 — клеточная суспензия;
2 — заселяемый носитель;
3 — миксер
метода, что требует либо создания собственных (самодельных) устройств, либо конструирование специального ротора для имеющейся центрифуги [80].
Стоит отметить, что этот способ не применим для эндотелиоцитов при использовании крупнопористых синтетических носителей в связи с их проникновением далеко вглубь стенки матрикса, где они не будут выполнять свои функции. В то же время центрифугирование может оказаться полезным при эндотелиза-ции децеллюляризованных сосудов и других мелкопористых носителей, так как из-за мелкого размера пор, эндотелиоциты окажутся распластаны на внутренней поверхности графта. Исследования такого рода пока проведены не были, но представляются весьма перспективными.
Временное изменение электростатического
заряда носителя
Для улучшения адгезии эндотелиальных клеток к внутренней поверхности носителей из политетрафторэтилена (ПТФЭ) был предложен способ, основанный на изменении электростатических свойств: заряд стенки матрикса из ПТФЭ, который в норме является отрицательным, меняется на положительный для улучшения прикрепления и созревания эндоте-лиоцитов. Экспозиция клеток всего лишь в течение 16 мин в таких системах повышает эффективность заселения до 90% [17, 89]. Среди преимуществ такого способа — возможность достичь быстрой морфологической зрелости клеток до трансплантации, что подтверждено результатами сканирующей электронной микроскопии [89, 90]. Улучшение удержания клеток на поверхности носителя подтверждено исследованием флюоресцентных меток через 1 нед.
:3
#■
Рис. 3. Направления движения клеток в суспензии под действием центробежной силы при центрифугировании носителя через продольную ось: 1 — клеточная суспензия; 2 — заселяемый носитель; 3 — продольная ось
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
О б з о р ы
29
после имплантации [89]. В отличие от рассмотренных ранее веществ, улучшающих клеточную адгезию, электростатическое воздействие на протез носит временный характер и не связано с повышением тромбогенности [91]. С другой стороны, этот способ не был изучен на современных биодеградируемых матриксах, например, из ПГК и ее ко-полимеров, что требует дальнейших исследований.
Использование вакуума
С середины 1980-х годов исследуются системы, использующие для совмещения носителей с клетками разницу давлений [92]. Они подразумевают приложение отрицательного давления — вакуума — либо с внутренней стороны [27, 93], либо с наружной стороны [15, 94] носителя для улучшения прохождения клеточной суспензии через микропо-ры материала (рис. 4, 5). При этом жидкая часть клеточной суспензии достаточно свободно прони-
кает сквозь стенку засеваемой основы, которая выполняет роль своеобразного мембранного фильтра, тогда как клетки «застревают» в его порах. Такие системы позволяют чрезвычайно быстро, в течение 10 мин, заселить ТИКС с эффективностью от 60 до 90% [13 ,15, 94]. Более того, в отличие от статичного совмещения этот метод не зависит от оператора [27]. L. Solchaga et al. (2006) исследовали адгезию человеческих ММСК костного мозга к синтетическому матриксу из ко-полимера ПГК с пористостью 80% и средним размером пор 83 мкм [95]. В результате оказалось, что использование вакуума (85 мм рт. ст.) в течение 10 мин позволяет добиться увеличения эффективности минимум в 2 раза, по сравнению со статичным методом заселения в течение 72 ч. Авторы сделали вывод, что метод является быстрым, воспроизводимым и безопасным. Кроме того, доказано отсутствие негативного влияния на функции и жизнеспособность клеток [95].
Вакуум
Вакуум
Рис. 4. Динамический метод совмещения клеток и носителя: создание вакуума с внутренней стороны носителя: 1 — заселяемый носитель; 2 — направление движения клеток; 3 — клеточная суспензия
Рис. 5.
Динамический метод совмещения клеток и носителя: создание вакуума с наружной стороны носителя:
1 — клеточная суспензия;
2 — заселяемый носитель;
3 — культуральная среда без клеток
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
30
О б з о р ы
Использование сил магнитного притяжения
Интересен способ совмещения клеток с носителем, основанный на использовании сил магнитного притяжения для увеличения эффективности заселения. Одним из вариантов является использование суперпарамагнитных одноразмерных полимерных наночастиц «dynabeads» (DynaBiotec, Норвегия), способных соединяться с выбранным типом клеток, молекулой или белком [96]. Клетки, меченные dynabeads, могут быть засеяны на матрикс с использованием временного магнитного поля менее чем за час с последующим 12-часовым культивированием, а эффективность совмещения достигает 99% [96, 97]. Другим вариантом является применение суперпарамагнитных наночастиц оксида железа (superparamagnetic iron oxide nanoparticles, SPION), которые внедряются внутрь клетки [98]. Клетки с такими частицами засеваются на матрикс, внутрь которого помещают магнит (рис. 6). Через несколько мин магнитного воздействия и 24 ч последующего культивирования количество адгезиро-ванных клеток составило более 90% [33, 98, 99]. Магнитные наночастицы могут быть использованы с любыми типами клеток и носителей, в том числе с децеллюляризованными артериями [34], что является несомненным преимуществом. Более того, описано последовательное совмещение фибробластов, гладкомышечных клеток и эндотелиоцитов с носителем для создания всех трех слоев сосудистой стенки [99]. Также плюсом является быстрота заселения клеток и воспроизводимость результатов. Не было выявлено никакого вредного воздействия на клетки при малой концентрации частиц,
Рис. 6. Динамический метод совмещения клеток и носителя: использованием сил магнитного притяжения: 1 — заселяемый носитель;
2 — клетки с магнитными наночастицами;
3 — магнит
с другой стороны, исследования показали снижение пролиферативной активности при использовании более 100 мкм наночастиц оксида железа на клетку [99] и более 50 dynabeads на клетку [97]. Кроме того, пока не изучены отдаленные эффекты применения таких частиц и не понятно, что с ними происходит после трансплантации ТИКС и каковы их возможные негативные влияния местного и общего характера [13].
Комбинированные способы динамического
совмещения клеток с носителем
Для крупнопористых носителей из синтетических ко-полимеров, сочетание сразу нескольких описанных способов воздействия, таких как вращение, разница давлений и другие, несмотря на некоторое усложнение процесса внедрения клеток, приводит к лучшим результатам [51, 100].
Одним из таких методов является так называемое «ротационное вакуумное заселение», основанное на описанных ранее принципах для эффективного, автоматизированного и воспроизводимого совмещения клеток и носителя [15, 100]. С помощью специальной канюли через матрикс перфу-зируется суспензия прогениторных клеток и одновременно вся конструкция вращается вокруг своей продольной оси внутри вакуумной камеры. К преимуществам данного метода относятся: доставка клеток через всю толщу стенки по всей длине матрикса, воспроизводимость и автоматизация процесса. Авторы говорят о 60—90% эффективности клеточного заселения, и отмечают, что она зависит от размера пор матрикса, а также от скорости перфузии. Лучшие результаты были получены при меньшем размере пор и низкой скорости потока клеточной суспензии [100]. Недостатком данного метода можно считать его сложность. При успешном применении сочетаются сразу несколько принципов засевания клеток с повышенной эффективностью. С другой стороны, из-за такого сочетания снижается надежность метода. Кроме того, в уже готовом устройстве предусмотрена возможность использования графтов только определенной длины и диаметра [101].
Создание ТИКС с использованием
фотополимеризующегося гидрогеля
Известно применение производных фотополимеризующегося полиэтиленгликоля, с характеристиками естественного внеклеточного матрикса, для создания ТИКС [102]. Этот полимер не оказывает негативного влияния на клетки и ткани [103, 104]. Гидрогель, содержащий клетки, заливается в специальную форму и под воздействием ультрафиолета полимеризуется, что позволяет получить однородно заселенный ТИКС [103]. Этот подход демонстрирует обнадеживающие результаты в исследованиях in vitro в отношении эффективности использования клеток, сохранения их жизнеспособности и пролиферативной активности, несмотря на воздействие ультрафиолета во время процедуры фотополимеризации [102]. Испытания ТИКС, полученных из таких гидрогелей, in vivo пока не проведены, поэтому еще предстоит выяснить, сможет ли такая конструкция выдержать артериальное давление и быть устойчивой к тромбообразованию [13].
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
О б з о р ы
31
«Безматриксное» изготовление ТИКС
Альтернативным подходом является использование только клеточных популяций и продуцируемого ими в условиях in vitro межклеточного матрикса для создания ТИКС. В этом случае, нет необходимости использовать носитель для совмещения с клетками: основу ТИКС формируют сами клетки. Такой метод, обозначаемый в зарубежной литературе «cell-sheet engineering» был разработан N. L'Heureux et al. (2007, 1998, 2007, 1993) [8, 105-107]. Вместо использования «классического» метода с совмещением клеток и носителя, клетки выращивали в монослое с получением клеточных пластов. Фибробласты кожи человека культивировали на специальной подложке в течение 6-8 нед. для создания богатого коллагеном пласта живых клеток. Полученный пласт 4 раза оборачивали вокруг металлического стержня диаметром 4,75 мм так, чтобы получилась трубка, которую помещали в питательную среду на 12 нед., в течение которых все слои фибробластов срастались. После этого полученную трубку высушивали на воздухе в течение нескольких часов. Полученную таким образом девитализованную коллагеновую трубку, выполняющую функцию внутренней мембраны, четырежды оборачивали пластом живых аутологичных гладкомышечных клеток и в течение 8-12 нед. культивировали в питательной среде. За 7 сут. до трансплантации полученную трубку изнутри заселяли эндотелиоцитами и проводили прекондиционирование полученного графта в биореакторе. Преимуществами этого метода являются равномерное распределение клеток в сосудистой стенке, наличие слоев гладкомышечных и эндотелиальных клеток, высокая механическая прочность. К недостаткам данного подхода относится слишком длительный срок изготовления таких сосудов - от 6 до 9 мес. (в среднем 7,5 мес.), а также высокая стоимость. В настоящее время эта техника используется компанией Cytograft Tissue Engineering (США) и называется Lifeline™. (рис. 7)
Рис. 7. Сосуд, созданный посредством технологии Lifeline™. (http://cytograft.com)
Применение биореакторов в тканевой инженерии
кровеносных сосудов
В создании ТИКС часто используют биореакторы для воссоздания физиологических условий и биомеханических воздействий, которые сосуды и клетки постоянно испытывают in vivo (напряжение сдвига, циклическое растяжение и гидростатическое давление). Это обеспечивает улучшение клеточной адгезии, стимуляцию формирования внеклеточного матрикса и дифференцировки гладкомышечных клеток и эндотелиоцитов [37, 108, 109]. Однако стоит отметить, что биореактор никогда не применяется для заселения клеток — только для инкубирования уже заселенного графта непосредственно перед трансплантацией. Вопросы, связанные с использованием биореактора являются темой отдельного обсуждения и выходят за рамки данного обзора.
Заключение
Исследователи в области тканевой инженерии кровеносных сосудов сфокусировались на создании биодеградируемых носителей и методиках заселения их жизнеспособными клетками [8, 13, 16, 21, 64, 67]. Было предложено множество материалов для создания матриксов — ПГК, ПМК, гидрогели, коллагеновые пласты и децеллюляризованные сосуды [11, 25, 71, 72, 105]. Однако создание носителя — это лишь первый шаг в разработке ТИКС. Его заселение клетками является гораздо более важным и решающим этапом в создании функциональных кровеносных сосудов, и этому посвящены многие исследования [13, 80, 95, 98, 99]. Являясь ключевым моментом в создании ТИКС, способ заселения влияет не просто на количество клеток, изначально прикрепившихся к матриксу, но и на качество эквивалента ткани, получаемого при дальнейшем культивировании.
Метод клеточного заселения зависит от типа используемых клеток, типов носителей и стоящих клинических задач. Так, следует четко разделять совмещение клеток с крупнопористыми искусственными носителями и децеллюляризированными кровеносными сосудами. Рутинно использующийся статичный метод значительно уступает динамическим способам совмещения, при которых повышается не только число иммобилизованных клеток, но и однородность их распределения в матриксе [26].
Максимальное использование клеточной популяции очень важно, что особенно актуально при ее малом количестве, и этому уделяется значительное внимание. Но важно понимать, что максимальная концентрация клеток в матриксе не является самоцелью. Зависимость между клиническим действием и плотностью клеточного заселения до сих пор не изучена, поэтому еще предстоит ответить на вопрос: является ли высокая эффективность клеточного заселения такой уж необходимой? Кроме того, еще необходимо разработать единый метод количественного анализа эффективности заселения клеток для сравнения различных используемых методик.
Требует дополнительного обсуждения выбор типа (или нескольких типов) клеток, наиболее оптимальных для создания ТИКС. Доказано, что наличие эн-дотелиоцитов на внутренней поверхности носителя
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
32
О б з о р ы
снижает его тромбогенность [17, 63, 85, 92, 93]. Использование лейомиоцитов позволяет получить ТИКС, по своей структуре максимально похожий на нормальную артерию, но критическая потребность в их наличии в составе графта сосуда не доказана. Мало изучена возможность одновременного или последовательного заселения носителей разными клеточными типами. Возможно, сочетание различных способов доставки клеток привело бы к лучшим результатам. Многообещающим выглядит предложение использовать прогениторные клетки для заселения ТИКС, из которых наиболее широко используются ММСК [7, 19, 59]. Доказано, что ММСК обладают некоторой антитромбогенной активностью [18], однако их дальнейшая судьба после заселения,
ЛИТЕРАТУРА
1. Veith F.J., Gupta S.K., Ascer E. et al. Six-year prospective multicenter randomized comparison of autologous saphenous vein and expanded polytetrafluoroethylene grafts in infrainguinal arterial reconstructions. J. Vasc. Surg. 1986; 3(1): 104—14.
2. Sapsford R.N., Oakley G.D., Talbot S. Early and late patency of expanded polytetrafluoroethylene vascular grafts in aorta-coronary bypass. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1981; 81(6): 860—4.
3. Klinkert P., Post P.N., Breslau P.J. et al. Saphenous vein versus PTFE for above-knee femoropopliteal bypass. A review of the literature. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2004; 27(4): 357—62
4. Herring M., Gardner A., Glover J. A single-staged technique for seeding vascular grafts with autogenous endothelium. Surgery 1978; 84(4): 498-504.
5. Herring M.B., Dilley R., Jersild R.A. et al. Seeding arterial prostheses with vascular endothelium. The nature of the lining. Ann. Surg. 1979; 190(1): 84-90.
6. Thomson G.J.L., Vohra R., Walker M.G. Cell Seeding for Small Diameter ePTFE Vascular Grafts: A Comparison Between Adult Human Endothelial and Mesothelial Cells. Ann. Vasc. Surg. 1989; 3(2): 140-5.
7. Shin'oka T., Matsumura G., Hibino N. et al. Midterm clinical result of tissue-engineered vascular autografts seeded with autologous bone marrow cells. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 2005; 129(6): 1330-8.
8. L'Heureux N., Dusserre N., Marini A. et al. Technology insight: the evolution of tissue-engineered vascular grafts--from research to clinical practice. Nat. Clin. Pract. Cardiovasc. Med. 2007; 4(7): 389-95.
9. Naito Y., Shinoka T., Duncan D. et al. Vascular tissue engineering: Towards the next generation vascular grafts. Adv. Drug Deliv. Rev. 2011; 63(4-5): 312-23.
10. Campbell G.R., Campbell J.H. Development of tissue engineered vascular grafts. Curr. Pharm. Biotechnol. 2007; 8(1): 43-50.
11. Chen Q.-Z., Harding S.E., Ali N.N. et al. Biomaterials in cardiac tissue engineering: Ten years of research survey. Mater. Sci. Eng.: R: Rep. 2008; 59(1-6): 1-37.
12. Kalra M., Miller V.M. Early remodeling of saphenous vein grafts: proliferation, migration and apoptosis of adventitial and medial cells occur simultaneously with changes in graft diameter and blood flow. J. Vasc. Res. 2000; 37(6): 576-84.
13. Villalona G.A., Udelsman B., Duncan D.R. et al. Cell-seeding techniques in vascular tissue engineering. Tissue Eng., Part B Rev. 2010; 16(3): 341-50.
14. Mohebbi-Kalhori D., Rukhlova M., Ajji A. et al. A novel automated cell-seeding device for tissue engineering of tubular scaffolds: design and functional validation. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2012; 6(9): 710-20.
15. Nieponice A., Soletti L., Guan J. et al. Development of a tissue-engineered vascular graft combining a biodegradable scaffold, muscle-derived stem cells and a rotational vacuum seeding technique. Biomaterials 2008; 29(7): 825-33.
16. Krawiec J.T., Vorp D.A. Adult stem cell-based tissue engineered blood vessels: a review. Biomaterials 2012; 33(12): 3388-400.
17. Pawlowski K.J., Rittgers S.E., Schmidt S.P. et al. Endothelial cell seeding of polymeric vascular grafts. Front. Biosci. 2004; 9: 1412-21.
18. Hashi C.K., Zhu Y., Yang G.-Y. et al. Antithrombogenic property of bone marrow mesenchymal stem cells in nanofibrous vascular grafts. PNAS USA 2007; 104(29): 11915-20.
19. Cho S.-W., Lim S.H., Kim I.-K. et al. Small-diameter blood vessels engineered with bone marrow-derived cells. Ann. Surg. 2005; 241(3): 506-15.
20. Yow K.-H., Ingram J., Korossis S.A. et al. Tissue engineering of vascular conduits. Br. J. Surg. 2006; 93(6): 652-61.
их роль и влияние на ремоделирование ТИКС пока до конца не изучены [16].
Таким образом, оптимальная методика совмещения клеток применительно к определенному типу носителя, которая бы удовлетворяла всем запросам, до сих пор не разработана, хотя определенный научно-технический задел в данном области уже сформирован, в том числе благодаря фундаментальным и прикладным работам российских исследователей [110-113]. Такой протокол должен быть стандартизированным, быстрым, экономически оправданным, желательно одноэтапным, безопасным, надежным, приводить к высокой эффективности заселения клеток и их однородному распределению в структуре матрикса.
21. Parikh S.A., Edelman E.R. Endothelial cell delivery for cardiovascular therapy. Adv. Drug Deliv. Rev. 2000; 42(1-2): 139-61.
22. Kakisis J.D., Liapis C.D., Breuer C. et al. Artificial blood vessel: the Holy Grail of peripheral vascular surgery. J. Vasc. Surg. 2005; 41(2): 349-54.
23. Conte M.S. The ideal small arterial substitute: a search for the Holy Grail? FASEB J. 1998; 12(1): 43-5.
24. Ahsan T., Nerem R.M. Bioengineered tissues: the science, the technology, and the industry. Orthod. Craniofac. Res. 2005; 8(3): 134-40.
25. Ravi S., Qu Z., Chaikof E.L. Polymeric materials for tissue engineering of arterial substitutes. Vascular 2009; 17(Sup.1): S45-54.
26. Kim B.S., Putnam A.J., Kulik T.J. et al. Optimizing seeding and culture methods to engineer smooth muscle tissue on biodegradable polymer matrices. Biotechnol. Bioeng. 1998; 57(1): 46-54.
27. Udelsman B., Hibino N., Villalona G.A. et al. Development of an operator-independent method for seeding tissue-engineered vascular grafts. Tissue Eng. Part C Methods 2011; 17(7): 731-6.
28. Berglund J.D., Mohseni M.M., Nerem R.M. et al. A biological hybrid model for collagen-based tissue engineered vascular constructs. Biomaterials 2003; 24(7): 1241-54.
29. Bacakova L., Novotna K., Panzek M. Polysaccharides as cell carriers for tissue engineering: the use of cellulose in vascular wall reconstruction. Physiol. Res. 2014; 63(Sup.1): S29-47.
30. Seib F.P., Herklotz M., Burke K.A. et al. Multifunctional silk-heparin biomaterials for vascular tissue engineering applications. Biomaterials 2014; 35(1): 83-91.
31. Wray L.S., Tsioris K., Gi E.S. et al. Slowly degradable porous silk microfabricated scaffolds for vascularized tissue formation. Adv. Funct. Mater. 2013; 23(27): 3404-12.
32. Schaner P.J., Martin N.D., Tulenko T.N. et al. Decellularized vein as a potential scaffold for vascular tissue engineering. J. Vasc. Surg. 2004; 40(1): 146-53.
33. Shimizu K., Ito A., Arinobe M. et al. Effective cell-seeding technique using magnetite nanoparticles and magnetic force onto decellularized blood vessels for vascular tissue engineering. J. Biosci. Bioeng. 2007; 103(5): 472-78.
34. Teebken O.E., Bader A., Steinhoff G. et al. Tissue Engineering of vascular grafts: human cell seeding of decellularised porcine matrix. Eur. J. Vasc. Endovasc. Surg. 2000; 19(4): 381-6.
35. Kim B.-S., Park I.-K., Hoshiba T. et al. Design of artificial extracellular matrices for tissue engineering. Prog. Polym. Sci. 2011; 36(2): 238-68.
36. Kim B.-S., Nikolovski J., Bonadio J. et al. Engineered smooth muscle tissues: regulating cell phenotype with the scaffold. Exp. Cell Res. 1999; 251(2): 318-28.
37. Niklason L.E., Gao J., Abbott W.M. et al. Functional arteries grown in vitro. Science 1999; 284(5413): 489-93.
38. Higgins S.P., Solan A.K., Niklason L.E. Effects of polyglycolic acid on porcine smooth muscle cell growth and differentiation. J. Biomed. Mater. Res. A 2003; 67 A(1): 295-302.
39. Shum-Tim D., Stock U., Hrkach J. et al. Tissue engineering of autologous aorta using a new biodegradable polymer. Ann. Thorac. Surg. 1999; 68(6): 2298-304.
40. Hoerstrup S.P., Kadner A., Breymann C. et al. Living, autologous pulmonary artery conduits tissue engineered from human umbilical cord cells. Ann. Thorac. Surg. 2002; 74(1): 46-52.
41. Gogolewski S., Jovanovic M., Perren S. et al. Tissue response and in vivo degradation of selected polyhydroxyacids: polylactides (PLA), poly(3-hydroxybutyrate) (PHB), and poly(3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) (pHb/VA). J. Biomed. Mater. Res. 1993; 27 (9): 1135-48.
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
О б з о р ы
33
42. Watanabe M., Shin'oka T., Tohyama S. et al. Tissue-engineered vascular autograft: inferior vena cava replacement in a dog model. Tissue Eng. 2001; 7(4): 429-39.
43. Mooney D.J., Mazzoni C.L., Breuer C. et al. Stabilized polyglycolic acid fibre-based tubes for tissue engineering. Biomaterials 1996; 17(2): 115-24.
44. Wake M.C., Gupta P.K., Mikos A.G. Fabrication of pliable biodegradable polymer foams to engineer soft tissues. Cell Transplant. 1996; 5(4): 465-73.
45. Nerem R.M., Seliktar D. Vascular Tissue Engineering. Annu. Rev. Biomed. Eng. 2001; 3(1): 225-43.
46. Zhang W.J., Liu W., Cui L. Tissue engineering of blood vessel. J. Cell Mol. Med. 2007; 11(5): 945-57.
47. Sobral J.M., Caridade S.G., Sousa R.A. et al. Threedimensional plotted scaffolds with controlled pore size gradients: Effect of scaffold geometry on mechanical performance and cell seeding efficiency. Acta Biomater. 2011; 7(3): 1009-18.
48. O'Brien F.J., Harley B.A., Waller M.A. et al. The effect of pore size on permeability and cell attachment in collagen scaffolds for tissue engineering. Technol. Health Care 2007; 15(1): 3-17.
49. Murphy C.M., O'Brien F.J. Understanding the effect of mean pore size on cell activity in collagen-glycosaminoglycan scaffolds. Cell Adhes. Migr. 2010; 4(3): 377-81.
50. Ma H., Hu J., Ma P.X. Polymer scaffolds for small-diameter vascular tissue engineering. Adv. Funct. Mater. 2010; 20(17): 2833-41.
51. Sodian R., Lemke T., Fritsche C. et al. Tissue-engineering bioreactors: a new combined cell-seeding and perfusion system for vascular tissue engineering. Tissue Eng. 2002; 8(5): 863-70.
52. Boccafoschi F., Habermehl J., Vesentini S. et al. Biological performances of collagen-based scaffolds for vascular tissue engineering. Biomaterials 2005; 26(35): 7410-7.
53. Weinberg C.B., Bell E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science 1986; 231(4736): 397-400.
54. Hirai J., Kanda K., Oka T. et al. Highly oriented, tubular hybrid vascular tissue for a low pressure circulatory system. ASAIO J. 1994; 40(3): 383-8.
55. Hirai J., Matsuda T. Venous reconstruction using hybrid vascular tissue composed of vascular cells and collagen: Tissue regeneration process. Cell Transplant. 1996; 5(1): 93-105.
56. Crapo P.M., Gilbert T.W., Badylak S.F. An overview of tissue and whole organ decellularization processes. Biomaterials 2011; 32(12): 3233-43.
57. Dahl S.L.M., Koh J., Prabhakar V. et al. Decellularized native and engineered arterial scaffolds for transplantation. Cell Transplant. 2003; 12(6): 659-66.
58. Murase Y., Narita Y., Kagami H. et al. Evaluation of compliance and stiffness of decellularized tissues as scaffolds for tissue-engineered small caliber vascular grafts using intravascular ultrasound. ASAIO J. 2006; 52(4): 450-5.
59. Zhao Y., Zhang S., Zhou J. et al. The development of a tissue-
engineered artery using decellularized scaffold and autologous ovine mesenchymal stem cells. Biomaterials 2010; 31(2):
296-307.
60. Fitzpatrick J.C., Clark P.M., Capaldi F.M. Effect of decellularization protocol on the mechanical behavior of porcine descending aorta. Int. J. Biomater. 2010; 2010: 1-11.
61. McFetridge P.S., Daniel J.W., Bodamyali T. et al. Preparation of porcine carotid arteries for vascular tissue engineering applications. J. Biomed. Mater. Res. A. 2004; 70A(2): 224-34.
62. Soletti L., Hong Y., Guan J. et al. A bi-layered elastomeric scaffold for tissue engineering of small-diameter vascular grafts. Acta Biomater. 2010; 6(1): 110-22.
63. Mathews A., Colombus S., Krishnan V.K. et al. Vascular tissue construction on poly(e-caprolactone) scaffolds by dynamic endothelial cell seeding: effect of pore size. J. Tissue Eng. Regen. Med. 2012; 6(6): 451-61.
64. Nemeno-Guanzon J.G., Lee S., Berg J.R. et al. Trends in tissue engineering for blood vessels. J. Biomed. Biotechnol. 2012; 2012: 1-14.
65. Bajpai V.K., Andreadis S.T. Stem cell sources for vascular tissue engineering and regeneration. Tissue Eng. Part B Rev. 2012; 18(5): 405-25.
66. Stegemann J.P., Kaszuba S.N., Rowe S.L. Review: advances in vascular tissue engineering using protein-based biomaterials. Tissue Eng. 2007; 13(11): 2601-13.
67. Peck M., Gebhart D., Dusserre N. et al. The evolution of vascular tissue engineering and current state of the art. Cells Tissues Organs 2011; 195(1-2): 144-58.
68. Howard D., Buttery L.D., Shakesheff K.M. et al. Tissue engineering: strategies, stem cells and scaffolds. J. Anat. 2008; 213(1): 66-72.
69. Hass R., Kasper C., Bohm S. et al. Different populations and sources of human mesenchymal stem cells (MSC): A comparison of adult and neonatal tissue-derived MSC. Cell Commun. Signal. 2011; 9: 1-14
70. Roh J.D., Nelson G.N., Udelsman B.V. et al. Centrifugal seeding increases seeding efficiency and cellular distribution of bone marrow stromal cells in porous biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 2007; 13(11): 2743-9.
71. Ma P.X. Biomimetic materials for tissue engineering. Adv. Drug Deliv. Rev. 2008; 60(2): 184-98.
72. West J.L. Modification of materials with bioactive peptides. In: Hollander A.P., Hatton P.V., editors. Biopolymer methods in tissue engineering. Clifton New Jersey: Humana Press; 2004. p. 113-22.
73. Schmidt C.E., Baier J.M. Acellular vascular tissues: natural biomaterials for tissue repair and tissue engineering. Biomaterials 2000; 21(22): 2215-31.
74. Salacinski H.J., Tiwari A., Hamilton G. et al. Cellular engineering of vascular bypass grafts: role of chemical coatings for enhancing endothelial cell attachment. Med. Biol. Eng. Comput. 2001; 39(6): 609-18.
75. Sagnella S., Anderson E., Sanabria N. et al. Human endothelial cell interaction with biomimetic surfactant polymers containing Peptide ligands from the heparin binding domain of fibronectin. Tissue Eng. 2005; 11(1-2): 226-36.
76. Stephan S., Ball S.G., Williamson M. et al. Cell-matrix biology in vascular tissue engineering. J. Anat. 2006; 209(4): 495-502.
77. Mann B.K., Schmedlen R.H., West J.L. Tethered-TGF-p increases extracellular matrix production of vascular smooth muscle cells. Biomaterials 2001; 22(5): 439-44.
78. Drumheller P.D., Hubbell J.A. Polymer networks with grafted cell adhesion peptides for highly biospecific cell adhesive substrates. Anal. Biochem. 1994; 222(2): 380-8.
79. Blum J.S., Temenoff J.S., Park H. et al. Development and characterization of enhanced green fluorescent protein and luciferase expressing cell line for non-destructive evaluation of tissue engineering constructs. Biomaterials 2004; 25(27): 5809-19.
80. Godbey W.T., Hindy S.B.S, Sherman M.E. et al. A novel use of centrifugal force for cell seeding into porous scaffolds. Biomaterials 2004; 25(14): 2799-805.
81. Yasuda K., Inoue S., Tabata Y. Influence of culture method on the proliferation and osteogenic differentiation of human adipo-stromal cells in nonwoven fabrics. Tissue Eng. 2004; 10(9-10): 1587-96.
82. Vunjak-Novakovic G., Obradovic B., Martin I. et al. Dynamic cell seeding of polymer scaffolds for cartilage tissue engineering. Biotechnol. Prog. 1998; 14(2): 193-202.
83. Hsu S., Tsai I., Lin D. et al. The effect of dynamic culture conditions on endothelial cell seeding and retention on small diameter polyurethane vascular grafts. Med. Eng. Phys. 2005; 27(3): 267-72.
84. Wang S., Mo X.M., Jiang B.J. et al. Fabrication of small-diameter vascular scaffolds by heparin-bonded P(LLA-CL) composite nanofibers to improve graft patency. Int. J. Nanomedicine 2013; 8): 2131-9.
85. Nasseri B.A., Pomerantseva I., Kaazempur-Mofrad M.R. et al. Dynamic rotational seeding and cell culture system for vascular tube formation. Tissue Eng. 2003; 9(2): 291-9.
86. Ng R., Gurm J.S., Yang S.-T. Centrifugal seeding of mammalian cells in nonwoven fibrous matrices. Biotechnol. Prog. 2010; 26(1): 239-45.
87. Way L., Scutt N., Scutt A. Cytocentrifugation: a convenient and efficient method for seeding tendon-derived cells into monolayer cultures or 3-D tissue engineering scaffolds. Cytotechnology 2011; 63(6): 567-79.
88. Wolf M., Yunker L., Trescony P. Seeding implantable medical devices with cells. US patent WO/2006/094146. 2006.
89. Bowlin G.L., Meyer A., Fields C. et al. The persistence of electrostatically seeded endothelial cells lining a small diameter expanded polytetrafluoroethylene vascular graft. J. Biomater. Appl. 2001; 16(2): 157-73.
90. Fields C., Cassano A., Allen C. et al. Endothelial cell seeding of a 4-mm I.D. polyurethane vascular graft. J. Biomater. Appl. 2002; 17(1): 45-70.
91. Fields C., Cassano A., Makhoul R.G. et al. Evaluation of electrostatically endothelial cell seeded expanded polytetrafluoroethylene grafts in a canine femoral artery model. J. Biomater. Appl. 2002; 17(2): 135-52.
92. Kempczinski R.F., Rosenman J.E., Pearce W.H. et al. Endothelial cell seeding of a new PTFE vascular prosthesis. J. Vasc. Surg. 1985; 2(3): 424-9.
93. Williams C., Wick T.M. Perfusion bioreactor for small diameter tissue-engineered arteries. Tissue Eng. 2004; 10(5-6): 930-41.
94. Van Wachem P.B., Stronck J.W., Koers-Zuideveld R. et al. Vacuum cell seeding: a new method for the fast application of an evenly distributed cell layer on porous vascular grafts. Biomaterials 1990; 11(8): 602-6.
95. Solchaga L.A., Tognana E., Penick K. et al. A rapid seeding technique for the assembly of large cell/scaffold composite constructs. Tissue Eng. 2006; 12(7): 1851-63.
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
34
О б з о р ы
96. Perea H., Aigner J., Hopfner U. et al. Direct magnetic tubular cell seeding: a novel approach for vascular tissue engineering. Cells Tissues Organs 2006; 183(3): 156—65.
97. Tiwari A., Punshon G., Kidane A. et al. Magnetic beads tDynabead) toxicity to endothelial cells at high bead concentration: implication for tissue engineering of vascular prosthesis. Cell Biol. Toxicol. 2003; 19(5): 265-72.
98. Gonzalez-Molina J., Riegler J., Southern P. et al. Rapid magnetic cell delivery for large tubular bioengineered constructs. J. R. Soc. Interface 2012; 9(76): 3008-16.
99. Ito A., Ino K., Hayashida M. et al. Novel methodology for fabrication of tissue-engineered tubular constructs using magnetite nanoparticles and magnetic force. Tissue Eng. 2005; 11(9-10): 1553-61.
100. Soletti L., Nieponice A., Guan J. et al. A seeding device for tissue engineered tubular structures. Biomaterials 2006; 27(28): 4863-70.
101. Nieponice A., Vorp D.A., Soletti L. Vacuum rotational seeding and loading device and method for same. US patent 20060075963. 2006.
102. Nguyen K.T., West J.L. Photopolymerizable hydrogels for tissue engineering applications. Biomaterials 2002; 23(22): 4307-14.
103. Mann B.K., Gobin A.S., Tsai A.T. et al. Smooth muscle cell growth in photopolymerized hydrogels with cell adhesive and proteolytically degradable domains: synthetic ECM analogs for tissue engineering. Biomaterials 2001; 22(22): 3045-51.
104. Schmedlen R.H., Elbjeirami W.M., Gobin A.S. et al. Tissue engineered small-diameter vascular grafts. Clin. Plast. Surg. 2003; 30(4): 507-17.
105. L'Heureux N., Paquet S., Labbe R. et al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 1998; 12(1): 47-56.
106. L'Heureux N., McAllister T.N., de la Fuente L.M. Tissue-engineered blood vessel for adult arterial revascularization. N. Engl. J. Med. 2007; 357(14): 1451-3.
107. L'Heureux N., Germain L., Labbe R. et al. In vitro
construction of a human blood vessel from cultured vascular cells: a morphologic study. J. Vasc. Surg. 1993; 17(3):
499-509.
108. Topper J.N., Gimbrone M.A. Blood flow and vascular gene expression: fluid shear stress as a modulator of endothelial phenotype. Mol. Med. Today. 1999; 5(1): 40-6.
109. Resnick N., Yahav H., Shay-Salit A. et al. Fluid shear stress and the vascular endothelium: for better and for worse. Prog. Biophys. Mol. Biol. 2003; 81(3): 177-99.
110. Kalmykova N.V., Cherepanova O.A., Gorelik I.V.et al. Various effects of laminin-1 and laminin-2/4 on adhesion and migration of cultured human keratinocytes. Tsitologiia 2002;44(8):792-8.
111. Iudintseva N.M., Blinova M.I., Pinaev G.P.Characteristics of cytoskeleton organization of human normal postnatal, scar and embryonic skin fibroblasts spreading on different proteins of extracellular matrix. Tsitologiia2008;50(10):861-7.
112. Sedov V.M., Andreev D.I., Semenova E.G. et al. Endothelialvascular grafts (experimental research). Angiol. Sosud. Khir.2004;10(2):111-7.
113. Шевченко Ю.Л., Матвеев С.А. Клеточные технологии в сердечно-сосудистой хирургии. М.: Наука; 2005.
Поступила 21.03.2014
Гены & Клетки Том IX, № 1,2014
