CC BY
35
Обзоры
ОБЗОРЫ
37
Применение в тканевой инженерии крупных сосудов трансплантатов на основе аутогенных мононуклеарных клеток костного мозга
АС. Григорян, П.В. Кругляков
ООО «Транс-Технологии», Санкт-Петербург
The use of grafts seeded with autologous bone marrow-derived mononuclear cells in tissue engineering of large vessels
AS. Grigorian, P.V. Kruglyakov Trans-Technologies Ltd., Saint-Petersburg
В настоящее время эффективность операций по замене пораженных атеросклерозом и стенозированных крупных сосудов аутотрансплантатами, а также операций по ангиопластике, направленных на коррекцию врожденных дефектов сердечнососудистой системы, весьма невелика, и зачастую пациентам требуются повторные операции. В связи с этим необходима разработка искусственных тканеинженерных конструкций, обладающих достаточной прочностью и способных со временем замещаться тканями реципиента, обеспечивая формирование функционального сосуда. Обзор посвящен наиболее успешным доклиническим и клиническим исследованиям по данному направлению.
Ключевые слова: тканевая инженерия сосудов, мононук-леары костного мозга, ангиопластика.
To date the efficiency of the operations for replacement of large vessels, affected by atherosclerosis and stenosis, and of the angioplasty operations for correction of the congenital defects of cardiovascular system, not sufficient and in most cases the patient needs a repeated operation. In this connection it is necessary to develop artificial tissue-engineered vessel-like structures, possessing the needed strength and able to be replaced by the recepients' tissue to form a functional vessel. One of the most beneficial methods in this field is the creation of synthetic grafts seeded with autologous mononuclear cells derived from the bone marrow.
Key words: tissue engineering of vessels, mononuclear cells, angioplasty.
Введение
Одним из перспективных направлений тканевой инженерии является разработка биотрансплантатов для использования в сердечно-сосудистой хирургии. Необходимость создания таких трансплантатов очевидна. Например, сегодня для такой распространенной операции на сердце, как аорто-коронарное шунтирование (АКШ), применяются аутогенные трансплантаты большой подкожной вены бедра. Несмотря на практически нулевой риск отторжения, по своим механическим свойствам они не вполне соответствуют динамическим нагрузкам, которым подвергаются после установки. Более того, сам процесс их получения весьма травматичен для пациентов. Ранняя смертность после операции АКШ составляет около 8%, трехлетняя выживаемость — около 80%, а спустя 10 лет после операции примерно 50% пациентам требуется повторная операция в связи с тем, что трансплантат стенозируется [1].
Разработка синтетических биотрансплантатов — сложная задача, так как внутренняя поверхность трансплантата должна контактировать с кровью, не приводя к ее свертыванию и образованию тромбов, а сам трансплантат должен выдерживать существенные динамические нагрузки. Такие материалы, как дакрон и политетра-флуороэтилен, из которых в настоящее время изготавливают стенты и сосудистые трансплантаты, несмотря на подходящие механические характеристики, провоци-
е-таН: [email protected]
руют тромбообразование, обызвествление внутренней стенки трансплантата и особенно областей его соприкосновения с тканями реципиента [2].
Чтобы предотвратить эти нежелательные явления, в разные годы предпринимались попытки покрытия внутренней поверхности трансплантата гепарином, оксидом полиэтилена, а также заселения ее аутогенными эндотелиальными и гладкомышечными клетками, выделенными из биоптатов собственного сосуда реципиента. Данные подходы показали свою эффективность в краткосрочных клинических испытаниях, однако обычно трансплантаты на основе синтетических материалов требуют в скором времени (через 2—3 года после установки) повторной операции и их замены [3].
Сегодня исследователи и клиницисты возлагают большие надежды на коллагеновые структуры и бескле-точные аллогенные и ксеногенные (изготовленные из крупных сосудов или перикарда сельскохозяйственных животных) трансплантаты, предоставляющие оптимальные условия для адгезии, пролиферации и дифферен-цировки аутогенных и аллогенных гладкомышечных, эндотелиальных клеток и фибробластов [4—8]. Тем не менее, и такие трансплантаты после установки зачастую требуют повторных операций, подвергающих опасности жизнь пациента [9, 10], причем ранняя смертность после таких операций составляет примерно 2%, а десятилетняя выживаемость — около 60—70% в зависимости
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009
I I I I I I
■ I I I
Обзоры
от материала, из которого изготовлен трансплантат, его локализации и прочих условий.
Анализ литературных данных по экспериментальным и клиническим работам в данной области позволяет из всего многообразия разрабатываемых подходов выделить наиболее многообещающие методики и сравнить их эффективность для применения в клинике.
Тканевая инженерия сосудов: методики
и их эффективность
Результаты доклинических испытаний
Тканевая инженерия сосудов насчитывает на сегодняшний день около двух десятилетий (первая попытка создания настоящей тканеинженерной сосудистой структуры in vitro была предпринята в 1986 г. [11]). За это время исследователи добились весьма впечатляющих результатов [табл.], а в 1999 г. в Японии была проведена первая успешная трансплантация искусственного
сосуда, созданного на основе биодеградируемого матрикса из сополимера полилактида и полигликолиевой кислоты, заселенного аутогенными эндотелиальными клетками, выделенными из биопсийного материала периферической подкожной вены пациентки. Трансплантат был применен для реконструкции подвергшейся окклюзии легочной артерии [12].
Как оказалось, абсолютное большинство перечисленных выше трансплантатов не подходит для использования в клинике. На наш взгляд, основной причиной этого является не оптимальное время биодеградации трансплантата, так как в случае, если время разрушения трансплантата в организме реципиента не соответствует времени образования нормальных тканей сосуда, это приводит либо к риску разрыва трансплантата и кровотечения (в случае, если трансплантат разрушается быстрее, чем необходимо), либо к дистрофическим изменениям в стенке сосуда, включая петрификацию трансплантата, если он остается в организме реципиента дольше необходимого времени.
Методы создания тканеинженерных сосудистых конструкций и результаты их доклинических испытаний
Матрикс Клетки Механические качества трансплантата Область имплантации на модели Сохранность трансплантата Ссылка
Естественный: Коллаген (тип не указан) Бычьи лейомиоциты, эндотелиоциты и фибробласты Недостаточная прочность, требовалось его укрепление плетеным дакроновым скаффолдом Не тестировался in vivo [її]
Коллаген I и III типа Лейомиоциты и эндотелиоциты, выделенные из вены пуповины человека, фибробласты кожи человека Недостаточная прочность Не тестировался in2vivo [13]
Коллаген I типа Лейомиоциты и эндотелиальные клетки, выделенные из яремной вены собаки Недостаточная прочность, требовалось его укрепление плетеным дакроновым скаффолдом Задняя полая вена собаки 65% сохранности, 35% трансплантата подверглось биодеградации с замещением нормальной сосудистой стенкой вены реципиента (срок анализа - 6 мес.) [14, 15]
Искусственный: Сополимер полиглактина и полигликолиевой кислоты Эндотелиальные клетки и фибробласты, выделенные из сонной артерии или яремной вены овец Не тестировались Легочная артерия овец Около 20% сохранности, 80% трансплантата резорбировалось, замещаясь тканями реципиента (срок анализа - 6 мес.) [16, 17]
Сополимер полигликолиевой кислоты и полигидроксиал-каноата Лейомиоциты, эндотелиальные клетки и фибро-бласты, выделенные из сонной артерии овцы Хорошие, соответствуют механическим свойствам нормального сосуда Инфраренальная аорта овцы 100% сохранности, трансплантат не подвергся биодеградации (срок анализа - 5 мес.)
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, № 3, 2009
Обзоры
Окончание таблицы
Матрикс Клетки Механические качества трансплантата Область имплантации на модели Сохранность трансплантата а к л ы с С
Пoлимеp полигликолиевой кивоты Лейомиоциты и эндотелиальные клетки из бычьей аорты Хорошие, соответствуют механическим свойствам нормального сосуда Бoльшебеpцoвая аpтеpия cвиньи 100% сохранности (срок анализа - 1 мес.) [18]
Coпoлимеp полигликолиевой кивоты, капpoлактoна и молочной киолоты Лейомиоциты и фибробласты, выделенные из бедренной вены собаки Хорошие, соответствуют механическим свойствам нормального сосуда Шжняя полая вена coбаки 100% сохранности (срок анализа - 13 мес.) [19]
Coпoлимеp полигликолиевой киcлoты и поли-4-гидpoкcибyтиpата Лейомиоциты и фибробласты, выделенные из сонной артерии овцы Хорошие, соответствуют механическим свойствам нормального сосуда Hе теcтиpoвалcя in2vivo [5]
Coпoлимеp полигликолиевой киcлoты и поли-4-гидpoкcибyтиpата Мононуклеарные клетки, выделенные из пуповинной крови человека Хорошие, соответствуют механическим свойствам нормального сосуда Hе теcтиpoвалcя in2vivo [20]
Coпoлимеp полимолочной киcлoты и є-капpoлактoна Мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга собаки Хорошие, отмечена продукция мононуклеар-ными клетками факторов УЕЄР и ангиопоэтина-1 (Апд-1) Hижняя полая вена ^бак Подвергался полной биодеградации в течение 6 мес., замещаясь нормальными тканями реципиента; максимальный срок анализа - 2 года, в течение которых не было отмечено деструктивных процессов и нарушения функций в области трансплантата [21]
Coпoлимеp пoли-L-мoлoчнoй киcлoты и є-капpoлактoна Мононуклеарные клетки, выделенные из костного мозга собаки Хорошие, при стимуляции ацетилхолином в трансплантатах продуцировалась эндотелиальная ЫО-синтаза и ЫО, а также УЕСР и Апд-1 Hижняя полая вена ^бак Подвергался полной биодеградации в течение 6 мес., замещаясь нормальными тканями реципиента [22-24]
Без матpикcа, тpанcплантаты на о^ове внеклеточного матpикcа, cекpетиpyемoгo клетками Фибробласты кожи человека, лейомиоциты и эндотелиальные клетки, выделенные из пуповинной вены человека Хорошие, соответствуют механическим свойствам нормального сосуда Бoльшебеpцoвая аpтеpия coбаки 50% сохранности, на 50% трансплантат заместился нормальными тканями реципиента (срок анализа - 7 сут.) [5]
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
Обзоры
На сегодняшний день успешные клинические испытания были проведены только с использованием трансплантатов на основе сополимеров поли-Ь-молочной кислоты, изготовленные с некоторыми модификациями по методике, предложенной Б. МаЬзитига [22]. Под «успешностью» подразумевается стабильный в течение почти десяти лет положительный результат [22].
Клинические испытания тканеинженерных
трансплантатов сосудов
В 1999 г. группа кардиохирургов из Японии под руководством Тошихару Шиноки (Т. БЫпока) начала клинические испытания тканеинженерных эквивалентов сосудов на основе сополимеров поли-Ь-молочной и по-лигликолиевой кислот [12, 26].
Ранее этими исследователями был проведен ряд успешных доклинических испытаний тканеинженерных сосудов на синтетической основе, выполненных на собаках [19] и овцах [27—29]. После начала клинических испытаний в 1999 г. были проведены операции 25 пациентам. Возраст пациентов колебался от 1 до 21 года. У всех пациентов наблюдались множественные врожденные аномалии сердечнососудистой системы, включающие в различных комбинациях два выходных отверстия правого желудочка, дефект межжелудочковой перегородки, дефект митрального клапана, недоразвитие левого желудочка и присутствовавшую во всех случаев атрезию правой либо левой легочной артерии. Большинству пациентов ранее уже проводились хирур-
гические операции на сердце. Т. Шинока и его коллеги провели пациентам модифицированную операцию Фон-тена, при которой трансплантат устанавливался между нижней полой веной и легочной артерией, не только служа шунтом, но и замещая участок легочной артерии с атрезией в области ее отхождения от легочного ствола (рис.).
Обычно при операции Фонтена, необходимой для разделения системного и легочного кровотока путем отведения венозной крови из правого предсердия в легочную артерию, производится, если возможно, прямое соединение правого предсердия и легочного ствола, либо легочного ствола и нижней полой вены. Ранняя смертность после этой тяжелой операции составляет около 48% [30].
В клинических испытаниях применялось три разновидности клеточного материала.
1. Клетки, выделенные из подкожных вен пациентов (п = 3). В этом случае смешанную популяцию клеток, состоящую из эндотелиоцитов и гладкомышечных клеток, высевали с помощью пипетирования на матриксы, культивировали на них в течение недели и затем трансплантировали.
2. Цельный костный мозг (п = 7). На матриксы с помощью пипетирования наносились аспираты аутогенного костного мозга без проведения какой-либо сепарации клеточных популяций. Перед применением матриксы с клетками находились в культуральной среде in vitro в течение 2—4 часов.
Схема модифицированной операции Фонтена, проведенной группой кардиохирургов под руководством Т. Шиноки 25 пациентам
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, 1У< 3, 2009
Обзоры
3. Мононуклеарная фракция костного мозга, выделенная из аспиратов аутогенного костного мозга с помощью центрифугирования в градиенте плотности на перколле (п = 13). Клетки, как и в предыдущем случае, высевали на матрикс, культивировали на нем в течение 2—4 часов, а затем проводили трансплантацию.
Из всех пациентов только у одного через четыре года после установки трансплантата наблюдался его стеноз, из-за чего потребовалась повторная трансплантация. У остальных пациентов в течение 5—6-летнего периода наблюдения не было отмечено осложнений, связанных с нарушениями функций трансплантата и перфузии легких, и никому из них не потребовалось дополнительных операций. Двое пациентов умерли в результате сердечной недостаточности [31]. До настоящего времени у остальных пациентов не отмечено никаких дисфункций трансплантатов и нарушений перфузии легких; они ведут нормальный образ жизни, не нуждаясь в иммуно-супрессивной терапии и терапии антикоагулянтами.
Как следует из литературных данных, на сегодняшний день наилучшим вариантом тканеинженерного трансплантата для замены атретических крупных сосудов является трансплантат на основе сополимера поли-Ь-молочной и полигликолиевой кислот, заселенный
аутогенными мононуклеарными клетками костного мозга. Несмотря на то, что использование эндотелиальных и гладкомышечных клеток также принесло хорошие результаты, получение и культивирование этих клеток требует нанесения дополнительной травмы пациенту и длительного времени, что очень неудобно в случае срочной операции. Также не всегда возможно получить эти клетки в достаточном для трансплантации количестве [31].
В мононуклеарной фракции костного мозга, содержатся прогениторные клетки, способные дифференцироваться в несколько клеточных типов in vivo, в частности, в эндо-телиоциты, образующие функциональную выстилку сосуда [32—35], и пациенты не нуждаются в длительной терапии антикоагулянтами, как показали Т. Шинока и его коллеги. Эти клетки несложно получить в достаточном для заселения трансплантата количестве, а их аутогенное происхождение исключает иммунное отторжение тканеинженерной конструкции. Они не требуют длительного культивирования in vitro, что снижает риск инфицирования клеточного материала. Для окончательного подтверждения эффективности этой методики требуются расширенные клинические испытания в нескольких независимых медицинских центрах, а также более длительное наблюдение за пациентами.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Every N.. Maynard С., Cochran R. et al. Characteristics, management, and outcome of patients with acute myocardial infarction treated with bypass surgery. Circulation 1996; 94 tsuppl. Ill: II—81—II—6.
2. Kirklin J., Barratt-Boyes B. Ventricular septal defect and pulmonary stenosis or atresia. New York: Churchill Livingstone, 1993.
3. Langer R., Vacanti J.P. Tissue Engineering. Science 1993; 260: 920-6.
4. L'Heureux N.. Paquet S., Labbe R. et al. A completely biological tissue-engineered human blood vessel. FASEB J. 1998; 12: 47—56.
5. Hoerstrup S.P., Zund G., Sodian R. et al. Tissue engineering of small caliber vascular grafts. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2DD1; 20: 164— 9.
6. Sumpio B.E. Hemodynamic forces and vascular cell biology. Austin, TX: RG Landes Publishers; 1993; p.1—134.
7. Kanda K., Matsuda T., Oka T. In vitro reconstruction of hybrid vascular tissue. Hierarchic and oriented cell layers. ASAIO J. 1993; 39: M561-5.
8. Kakisis J.D., Liapis C.D., Breuer C. et al. Artificial blood vessel: the Holy Grail of peripheral vascular surgery. J. Vase. Surg. 2DD5; 41: 349— 54.
9. Homann M. Haehnel J.C., Mendler N. et al. Reconstruction of the RVOT with valved biological conduits: 25 years experience with allografts and xenografts. Eur. J. Cardiothorac. Surg. 2DDD; 17: 624—30.
10. Bermudez C.A., Dearani J.A., Puga F.J. et al. Late results of the peel operation for replacement of failing extracardiac conduits. Ann. Thorac. Surg. 2004; 77: 881-8.
11. Weinberg CB, Bell E. A blood vessel model constructed from collagen and cultured vascular cells. Science 1986;231:397-400.
12. Shin'oka T., Imai Y., Ikada Y. Transplantation of a tissue-engineered pulmonary artery. N. Engl. J. Med. 2001; 344: 532—3.
13. L'Heureux N.. Germain L., Labbe R., Auger F.A. In vitro construction of a human blood vessel from cultured vascular cells: a morphologic study. J. Vase. Surg. 1993; 17: 499—509.
14. Hirai J., Kanda K., Oka T., Matsuda T. Highly oriented, tubular hybrid vascular tissue for a low pressure circulatory system. ASAIO J. 1994; 40: M383-8..
15. Hirai J., Matsuda T. Venous reconstruction using hybrid vascular tissue composed of vascular cells and collagen: tissue regeneration process. Cell Transplant. 1996; 5: 93—105.
16. Shinoka T., Shum-Tim D., Ma P.X. et al. Creation of viable pulmonary artery autografts through tissue engineering. J. Thorac. Cardiovasc. Surg. 1998; 115: 532-46
17. Shum-Tim D., Stock U., Hrkach J. et al. Tissue engineering of autologous aorta using a new biodegradable polymer. Ann. Thorac. Surg. 1999; 68: 2298-305.
18. Niklason L.E., Gao J., Abbott W.M. et al. Functional arteries grown in vitro. Science 1999; 284: 489—93.
19.Watanabe М., Shin'oka T., Tohyama S. et al. Tissue-engineered vascular autograft: inferior vena cava replacement in a dog model. Tissue Eng. 2001;7:429-39.
20. Hoerstrup S.P., Kadner A., Breymann C. et al. Living, autologous pulmonary artery conduits tissue engineered from human umbilical cord cells. Ann. Thorac. Surg. 2002; 74: 46—52.
21. MatsumuraG., Miyagawa-Tomita S., Shin'oka T. et al. First evidence that bone marrow cells contribute to the construction of tissue-engineered vascular autografts in vivo. Circul. 2003; 108: 1729—34.
22. Matsumura G., Ishihara Y., Miyagawa-Tomita S. et al. Evaluation of tissue-engineered vascular autografts. Tissue Eng. 2006; 12: 3075— 83.
23. Moncada S., Palmer R.M., Higgs E.A. Nitric oxide: physiology, pathophysiology, and pharmacology. Pharmacol. Rev. 1991; 43: 109.
24. Ziche М., Morbidelli L., Masini E. et al. Nitric oxide promotes DNA synthesis and cyclic GMP formation in endothelial cells from postcapillary venules. Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993; 192: 1198.
25. Babaei S., Teichert-Kuliszewska K., Zhang Q. et al. Angiogenic actions of angiopoietin-1 require endothelium-derived nitric oxide. Am. J. Pathol. 2003; 162: 1927.
26. Matsumura G., Hibino N.. Ikada Y. et al. Successful application of tissue engineered vascular autografts: clinical experience. Biomat. 2003; 24: 2303-8.
27. Shinoka T., Breuer C.K., Tanel R.E. et al. Tissue engineering heart valves: valve leaflet replacement study in a lamb model. Ann. Thorac. Surg. 1995; 60 [6 SupplJ: S513-6.
28. Shinoka Т., Ma P.X., Shum-Tim D. et al. Tissue-engineered heart valves. Autologous valve leaflet replacement study in a lamb model. Circul. 1996; 94 [9 SupplJ: 11164-8.
29. Shinoka T., Shum-Tim D., Ma P.X. et al. Tissue-engineered heart valve leaflets: does cell origin affect outcome? Circul. 1997; 96t9 SupplJ: 11102-7.
30. Довгань A.M., Зиньковский М.Ф., Лазоришинец В.В. и др. Результаты операции Фонтена при аномалиях сердца с функционально единственным желудочком. Украінський Медичний Часопис 2000; 16: 76-80.
31. Shinoka Т., Breuer С. Tissue-engineered blood vessels in pediatric cardiac surgery. Yale J. Biol. Med. 2008; 81: 161-6.
32. McKay R. Stem cells —hype and hope. Nature 2000; 406: 361-4.
33. Takahashi T., Kalka C., Masuda H. et al. Ischemia- and cytokine-induced mobilization of bone marrow-derived endothelial progenitor cells for neovascularization. Nat. Med. 1999; 5: 434—8.
34. Shintani S., Murohara T., Ikeda H. et al. Mobilization of endothelial progenitor cells in patients with acute myocardial infarction. Circul. 2001; 103: 2776-9.
35.Asahara T., Masuda H., Takahashi T. et al. Bone marrow origin of endothelial progenitor cells responsible for postnatal vasculogenesis in physiological and pathological neovascularization. Circ. Res. 1999; 85: 221-8.
Поступила 23.06.2009
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том IV, hl< 3, 2009
