CC BY
12УДК 579.8.06:663.18
Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич
ТИПИРОВАНИЕ ФЛУОРЕСЦИРУЮЩИХ ПСЕВДОМОНАД С ПОМОЩЬЮ РЕСТРИКЦИОННОГО АНАЛИЗА МЕЖГЕННОГО
16S-23S рРНК СПЕЙСЕРА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Известно, что в связи с развитием филогенетической систематики бактерий род Pseudomonas подвергся существенной таксономической ревизии [1, 2]. Одним из ее итогов стало описание многих новых родов бактерий, относящихся к различным классам типа Proteobacte-ria. Тем не менее, благодаря описанию новых видов, и, в меньшей мере, ревизии других таксонов количество видов рода Pseudomonas постоянно росло. Поскольку в основу проведенной ревизии был положен сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК, корректная идентификация псевдомонад стала невозможной без использования данного метода. На сегодня этот вид анализа является универсальным, наиболее надежным и удобным методом молекулярно-генетической характеристики, позволяющим провести определение родовой принадлежности самых разнообразных в таксономическом отношении бактерий [3]. Однако его результаты следует интерпретировать с осторожностью при проведении видовой идентификации, принимая во внимание, что основным критерием принадлежности бактерий к одному виду является родственность их геномов [4], которая не всегда может быть гарантирована высоким уровнем cходства генов 16S рРНК [5]. В связи с этим для корректного определения видовой принадлежности бактерий часто необходимо проведение дополнительных геноти-
пических тестов. В частности, может оказаться полезным анализ спейсерного участка расположенного между генами 16S и 23S рРНК, для которого характерен высокий уровень межвидового и внутривидового полиморфизма [6, 7].
Ранее нами была продемонстрирована генетическая и таксономическая гетерогенность коллекционных бактерий из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов, определенных по классической схеме идентификации как Pseudomonas fluorescens и Pseudomonas putida [8]. В результате сравнительного анализа нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК флуоресцирующие псевдомонады были распределены по различным филогенетическим группам рода Pseudomonas, при этом видовая принадлежность с достаточной степенью уверенности могла быть установлена менее чем у половины исследованных штаммов. Таксономическое положение большей части исследованных бактерий было определено лишь до уровня группы видов, а его уточнение требовало проведения дополнительных исследований с помощью альтернативных методов.
Целью настоящей работы была оценка возможности использования метода рестрикци-онного анализа межгенного 16S-23S рРНК спейсера (ITS-RFLP) для дифференциации штаммов флуоресцирующих псевдомонад при проведении таксономических исследований.
Материалы и методы
В работе использовали двенадцать штаммов флуоресцирующих псевдомонад из фонда Белорусской коллекции непатогенных микроорганизмов (БИМ), часть из которых была депо-
нирована также во Всероссийской коллекции микроорганизмов (ВКМ) (табл. 1). Культуры исследуемых бактерий выращивали на среде ТУ [5].
Таблица 1
Использованные в работе штаммы флуоресцирующих псевдомонад
Таксономическая принадлежность по каталогу БИМ [9] Обозначение и номер штамма Таксономическая принадлежность по результатам филогенетического анализа [8]
Pseudomonas fluore-scens biovar I БИМ B-98 (= ВКМ В-1476 = №11) Pseudomonas cedrina
БИМ B-100 (= ВКМ В-1459 = С-5-5) Pseudomonas orientalis
БИМ B-143 (= R-3) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas fluorescens)
БИМ B-158 (= ВКМ В-1461 = 5-2) Pseudomonas cedrina
Pseudomonas fluore-scens biovarIV БИМ B-187 (= R-30) Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas fluore-scens biovar V БИМ B-86 (= Pseudomonas syringae pv. syringae 345) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas vancouverensis)
БИМ B-99 (= ВКМ В-1471 = №1) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas vancouverensis)
БИМ B-147 (= R-14) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas fluorescens)
БИМ B-149 (= R-18) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas fluorescens)
БИМ B-156 (= ВКМ В-1472 = №2) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas vancouverensis)
Pseudomonas putida БИМ B-228 (= M-3) Pseudomonas vancouverensis
Pseudomonas sp. БИМ B-137 (= Pseudomonas fluorescens B =№19) Pseudomonas sp. (группа Pseudomonas fluorescens)
Амплификацию 16S-23S межгенного спей-сера осуществляли, придерживаясь ранее изложенной методики [5]. Продукты амплификации анализировали с помощью гель-электрофореза как непосредственно, так и после обработки рестриктазами AluI, либо TaqI, либо смесью рестриктаз Aval, BamHI, EcoRI, EcoRV, HindIIl, NotI, PstI ("Fermentas", Литва). Электрофорез проводили в 2%-ном агарозном геле в стандартном трис-боратном буфере половинной концентрации. Гели окрашивали этидиум бромидом и фотографировали при просвечивании ультрафиолетовыми лучами.
Кластерный анализ результатов риботипи-рования проводили с помощью программы TREECON for Windows (version 1.3b) [10] по методу невзвешенного попарного арифметического среднего (UPGMA). Матрицы исходных данных получали вручную после визуализации гелей, обозначая присутствие фрагмента как 1, а его отсутствие - 0. Массив данных для кластерного анализа объединял в себе все матрицы, полученные при обработке результатов электрофоретиче-ского разделения продуктов амплификации и продуктов рестрикции.
Результаты и их обсуждение
При анализе продуктов амплификации межгенного 16S-23S спейсера всех исследуемых бактерий обнаруживался фрагмент размером около 850 п.о. (рис. 1A). У штаммов БИМ
В-158, БИМ В-98, БИМ В-187, БИМ В-137, БИМ В-228 имела место амплификация дополнительного фрагмента, размеры которого варьировали от 620 п.о. до 940 п.о. Помимо
основных выявлялись минорные ампликоны, что, однако, не позволяло проводить достаточно надежную дифференциацию штаммов.
Обработка продуктов амплификации межгенных 168-238 участков смесью рестриктаз
позволила выявить дифференцирующие полосы в рестрикционных профилях штаммов БИМ В-158, БИМ В-98, БИМ В-187, БИМ В-86, БИМ В-137, БИМ В-149 и БИМ В-228 (рис. 1 Б).
Рис. 1. Амплификация 16S-23S межгенного спейсера флуоресцирующих псевдомонад (A) и дифференциация штаммов при обработке продуктов амплификации смесью рестриктаз (Б), рестриктазами TaqI (В) или AluI (Г).
Дорожки: 1, 9- маркер молекулярной массы - Gene RulerTM 100 bp Plus DNA Ladder производства Fermentas (Литва); 2 - штамм БИМ В-158, 3 - БИМ B-98, 4 - БИМ B-156, 5 - БИМ B-99, 6 - БИМ B-143, 7 - БИМ B-147, 8 - БИМ B-187, 10 - БИМ В-86, 11 - БИМ В-100, 12 - БИМ B-137, 13 - БИМ В-149, 14 - БИМ В-228.
Как видно на рис. 1 В, при обработке продуктов амплификации межгенных 168-238 спей-серов рестриктазой Taql были обнаружены отличия состава рестрикционных фрагментов для пары штаммов БИМ В-143 - БИМ В-147 и бактерий БИМ В-86, БИМ В-100, БИМ В-137, БИМ В-149, БИМ В-228. При этом различия
рестрикционных профилей у штаммов БИМ В-143, БИМ В-147 и БИМ В-86 заключались в присутствии единственных дополнительных специфических фрагментов.
В результате обработки продуктов амплификации рестриктазой AM (рис. 1Г) была обнаружена уникальность рестрикционных профилей
бактерий БИМ В-187, БИМ В-137, БИМ В-149 и пары штаммов БИМ В-143 - БИМ В-147.
Кластерный анализ, проведенный на основании сравнения всех четырех профилей межгенных 16S-23S участков исследуемых бактерий установил родственность одиннадцати исследованных бактерий, образовывавших большой устойчивый кластер (рис. 2). При этом внутри кластера выделялись три устойчивых пары штаммов, образующих единые
Результаты проведенного кластерного анализа (рис. 2) хорошо согласуются с ранее представленными нами результатами филогенетического анализа и типирования исследуемых бактерий с помощью Яер-ПЦР [8]. Использование любого из этих методов приводило к выводу о тесном генетическом родстве штаммов в парах БИМ В-158 - БИМ В-98, БИМ В-156 - БИМ В-99 и БИМ В-143 - БИМ В-147, свидетельствующем о принадлежности к одному и тому же геномовиду. При этом для сравни-
ветви в дендрограмме. Значения бутстрапа находились на высоком уровне для всех сформированных пар: штаммы БИМ В-158 - БИМ В-98 (76), штаммы БИМ В-156 - БИМ В-99 (95), БИМ В-143 - БИМ В-147 (99), что свидетельствует о статистической достоверности их объединения. Кластирование всех остальных исследуемых бактерий в дереве было неустойчивым, о чем свидетельствовали показатели бутстрапа не превышавшие 35.
тельного анализа геномной ДНК с помощью ERIC- и BOX-ПЦР характерна более высокая разрешающая способность при дифференциации штаммов рода Pseudomonas в сравнении с риботипированием в силу более высокой вариабельности повторяющихся последовательностей бактерий и образования более сложного состава фрагментов при их амплификации. Подобная закономерность отмечена и в ряде других работ по генотипированию бактерий различной родовой принадлежности [12, 13]. Расширением спек-
Рис. 2. UPGMA дендрограмма, построенная на основании анализа результатов риботипирования штаммов флуоресцирующих псевдомонад.
Значения бутстрапа вычислены на основании анализа 100 деревьев. Показаны значения бутстрапа выше 30. Шкала - генетическая дистанция, вычисленная как доля несовпадающих фрагментов по методу
Nei and Li, 1979 [11].
тра используемых рестриктаз при проведении способность метода и достигнуть достоверной рестрикционного анализа межгенного 16S-23S идентификации штаммов на видовом и внутри-спейсера можно повысить дифференцирующую видовом уровнях.
Заключение
Таким образом, применение метода рестрикционного анализа межгенного 168-238 спей-сера позволило выявить среди исследуемых штаммов флуоресцирующих псевдомонад ге-нотипические группы, степень родства внутри которых позволяет относить входящие в них
бактерии к одному и тому же геномовиду. Полученные результаты свидетельствует о возможности использования этого метода в таксономических исследованиях штаммов рода Pseudomonas с целью определения их видовой принадлежности.
Список использованных источников
1. Recent change in classification of the pseudomonads: an overvieiw / K. Kersters [et al.] // System. Appl. Microbiol. - 1996. - V. 19. -P. 465-477.
2. Phylogenetic affiliation of the pseudomonads based on 16S rRNA sequence / Y. Anzai [et al.] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2000. -V. 50. - P. 1563-1589.
3. Olsen G.J. Ribosormal RNA: a key to phy-logeny / G.J. Olsen, C R. Woese // FASEB J. -1993. - V. 7. - P. 113-123.
4. Report of the ad hoc committee for the reevaluation of the species definition in bacteriology / E. Stackebrandt [et. al] // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. - 2002. - V. 52. - P. 1043-1047.
5. Бажанов, Д.П. Филогенетическая идентификация трех штаммов ризосферных бактерий на основании анализа нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и генетического типирования / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич, А. А. Бажанова // Микробиология. - 2010. - Т. 79, № 3. - С. 394-404.
6. Jensen, M.A. Rapid identification of bacteria on the basis of polymerase chain reaction-amplified ribosomal DNA spacer polymorphisms / M.A Jensen, J.A. Webster, N. Straus // Appl. Environ. Microbiol. - 1993. - V. 59. - P. 945-952.
7. Gurtler V. New approaches to typing and identification of bacteria using the 16S - 23 S
rDNA spacer region / V. Gurtler, V.A. Stanisich // Microbiology. - 1996. - V. 142 - P. 3-16.
8. Бажанов, Д.П. Таксономическая гетерогенность коллекционных штаммов флуоресцирующих псевдомонад / Д.П. Бажанов, К.К. Яцевич // Микробиология. - 2011. -Т. 80, № 1. - С. 93-99.
9. Каталог культур микроорганизмов / Под ред. чл.-корр. НАН Беларуси Э.И. Коломиец. - Минск, 2006. - 166 с.
10. Van de Peer Y. Treecon for Windows: a software package for the construction and drawing of evolutionary trees for Microsoft Windows environment / Y. Van de Peer, R. De Wachter // Comput. Appl. Biosci. - 1994. -V. 10. - P. 569-570.
11. Nei, M. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonu-cleases / M. Nei, W.-H. Li // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 1979. - V. 76. - P. 5269-5273.
12. . Vila M.J., Marcos A., De Anta M.T.J. A comparative study of different PCR-based DNA fingerprinting techniques for typing of the Aci-netobacter calcoaceticus - A. baurnannii complex / M.J. Vila, A. Marcos, M.T.J. A De Anta // J. Med. Microbiol. - 1996. - V. 44. - P. 482-489.
13. Genomic fingerprinting of Haemophilus somnus by a combination of PCR methods / S. Appuhamy [et al.] // J. Clin. Microbiol. -1997. - V. 35. - P. 288-291.
Дата поступления статьи 14 февраля 2011 г.
