CC BY
62
© д. В. крутило1, В. с. Зотов 2
1 Институт сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН, Чернигов, Украина;
2 ФГБУН Институт биохимии им. А.Н. Баха Российской академии наук, Москва, Россия
C проведён анализ последовательностей гена 16s ррнк и межгенного региона 16s-23s ррнк (ITs) клубеньковых бактерий сои, отличающихся скоростью роста и выделенных из почв украины с различной интенсивностью выращивания данной культуры. В результате показана близость штаммов с интенсивным ростом к ризобиям сои группы usDA 123. исследуемые штаммы, как и другие представители этой группы, обладают повышенной сапрофитной компетентностью. рестрикционный анализ последовательностей межгенного региона ITs ризобий сои позволил разделить их на два Its-типа: первый ITs-тип — штаммы с интенсивным ростом и второй ITs-тип — медленнорастущие штаммы. такое разделение штаммов соответствует распределению их на физиологические группы.
C ключевые слова: Bradyrhizobium japonicum; 16S рРНК; 16S-23S рРНК (ITS); RFLP-анализ; секвенирование ДНК; Glycine max.
Поступила в редакцию 05.04.2013 Принята к публикации 01.10.2013
УДК 575:577.21:631.847.21 1:633.34:631.4
ГЕнотипичЕский анализ клубеньковых бактерий, нодулирующих сою в почвах украины
Известно, что в процессе фиксации молекулярного азота из атмосферы важная роль принадлежит клубеньковым бактериям, которые способны инициировать образование азотфиксирующих клубеньков на корнях бобовых растений. Благодаря этой способности ризобии рассматривают как ценный генетический ресурс для создания микробных препаратов.
В последнее время большое внимание уделяется изучению естественных природных популяций клубеньковых бактерий — микросимбионтов как традиционных, так и редких бобовых культур. Исследование генетического разнообразия специфических клубеньковых бактерий является одной из актуальных задач почвенной микробиологии (Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями, 2002).
Учитывая важность такой ценной зернобобовой культуры, как соя, наше внимание было направлено на изучение популяций ее микросимбионтов (клубеньковых бактерий) в почвах разных регионов Украины.
Известно, что соя может вступать в симбиоз с клубеньковыми бактериями нескольких видов: медленнорастущими Bradyrhizobium japonicum, B. elkanii, B. liaoningense (Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями, 2002; Willems, 2006) и быстрорастущими Sinorhizobium fredii, S. xinjiangensis (Chen et al., 1988) и Mesorhizobium thianshanense (Chen et al., 1995).
Следует отметить, что в почвах Украины нет аборигенных клубеньковых бактерий сои, поскольку дикая соя и другие бобовые из группы перекрестно заражаемых растений (вигна, маш) в естественных фитоценозах не встречаются (Толкачев, 1997). Формирование же почвенных популяций специфических для сои ризобий началось сравнительно недавно, с момента интенсивного внедрения этой культуры в севообороты. Согласно литературным данным, типичными микросимбионтами культурной сои в почвах Украины выступают медленнорастущие бактерии вида B. japonicum, которые были интродуци-рованы в агроценозы в составе коммерческих биопрепаратов (Ризоторфин российского и украинского производства) (Бабич, 1993; Патика та ш., 2003; Толкачев, 1990). Поэтому популяции ризобий сои являются чрезвычайно удобным объектом для изучения процессов микроэволюции, в результате которых может происходить дивергенция микросимбионтов сои, связанная с их адаптацией, как к различным генотипам растений, так и к новым почвенно-климатическим условиям.
В течение нескольких лет (2001—2004 гг.) нами изучалось распространение клубеньковых бактерий сои в агроценозах с различной интенсивностью выращивания данной культуры (соя в севообороте 10—30 лет). Полученные результаты свидетельствуют о том, что в почвах страны сформировались и функционируют разные по численности локальные популяции клубеньковых бактерий сои. Несмотря на однообразие интродуцированных штаммов-ино-кулянтов, почвенные популяции оказались достаточно гетерогенными. В результате анализа морфолого-культуральных и физиолого-биохимических свойств 180 штаммов ризобий сои, выделенных из почв различных регионов Украины, нами впервые обнаружены клубеньковые бактерии (Крутило та ш., 2008), существенно отличающиеся от медленнорастущих симбионтов сои вида B. japonicum, описанных ранее (Jordan, 1982). Известно, что среди бактерий рода Bradyrhizobium выделяют несколько групп штаммов, от-
личающихся по скорости роста (Jordan, 1982; Keyser, Cregan, 1987; Xu et al., 1995). Выделенные нами штаммы характеризовались повышенной скоростью роста и были условно названы «штаммами с интенсивным ростом». Серологический анализ 45 штаммов клубеньковых бактерий сои показал, что 20 штаммов с интенсивным ростом, независимо от их географического происхождения, относились к одной серогруппе. Медленнорастущие клубеньковые бактерии оказались серологически гетерогенными и были отнесены, как минимум, к 5 серогруппам. Еще одной важной отличительной особенностью ризобий сои с интенсивным ростом является их чувствительность к антибиотикам (штаммы чувствительны к 7—9 из 17 исследованных антибиотических веществ), что не характерно для медленнорастущих клубеньковых бактерий.
Следует отметить, что штаммы с интенсивным ростом встречаются не во всех регионах Украины. Соотношение между представителями этих двух групп изменяется в зависимости от почвенно-климатической зоны, а количество выделенных штаммов с интенсивным ростом колеблется в пределах от 33 % до 53 % (Патика та ш., 2010).
В связи с тем, что в Украине генетическое разнообразие клубеньковых бактерий сои в популяциях не анализировалось, целью нашей работы было изучить генотипические свойства микросимбионтов сои как медленнорастущих, так и штаммов с интенсивным ростом.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Объектами исследований были 6 выделенных нами штаммов — типичных представителей клубеньковых бактерий сои с медленным и интенсивным ростом из Коллекции полезных почвенных микроорганизмов Института сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН. В качестве референтного использован типовой штамм B. japonicum USDA 6T = ATCC 10324Т. Ризобии сои выделяли из корневых клубеньков сои сорта Устя, которую выращивали на образцах почвы, отобранных в различных регионах Украины (2001—2006 гг.): Черниговской (Носовская селекционно-опытная станция, чернозем выщелоченный), Винницкой (Институт кормов и сельского хозяйства Подолья НААН, серая лесная почва) и Сумской (Институт сельского хозяйства Северного Востока НААН, чернозем типичный) областях.
Выделение ДНК. Для выделения препаратов суммарной клеточной ДНК штаммы клубеньковых бактерий сои культивировали на агаризованной среде TY (Beringer, 1974). Тотальная ДНК штаммов ризобий была выделена из свежих культур (экспоненциальная фаза роста) путём лизиса бактериальных клеток лизоцим-SDS с последующей фенол-хлороформной экстракцией и осаждением изопропанолом (Laguerre et al., 1992).
RFLP анализ и секвенирование гена 16S рРНК. Амплификацию нуклеотидной последовательности
гена 16S рРНК для рестрикционного анализа осуществляли с вырожденными бактериальными праймерами fBDl/rBD1: 642f (5'-HAATHYGTGCCAGCAGC-3'), 1445r (5'-GTCRTCCYDCCTCCTC-3') (Коростик и др., 2006). Реакцию проводили на автоматическом амплифи-каторе HYBAID Omn-E в следующем режиме: начальная денатурация при 94 °C — 3 мин, 35 циклов, 94 °C — 30 с, 55 °C — 30 с, 72 °C — 1 мин, окончательная элонгация при 72 °С — 7 мин. Обработанную рестриктазой MspI («Fermentas», США) ДНК анализировали при помощи электрофореза в 4%-м агарозном геле.
Матрицы для секвенирования генов 16S рРНК синтезировали с помощью ПЦР, используя универсальные для большинства эубактерий прайме-ры fD1 (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3') и rP2 (5'-ACGGCTACCTTGTTACGACTT-3') (Weisburg et al., 1991). ПЦР проводили на амплификаторе GeneAmp PCR System 2720 в следующем режиме: начальная денатурация при 94 °C — 5 мин, 30 циклов, 94 °C — 30 с, 55 °C — 30 с, 72 °C — 30 с, окончательная элонгация при 72 °С — 7 мин. Амплифицированные фрагменты детектировались при помощи электрофореза в 1,5 % агарозном геле. Секвенирование осуществляли на автоматическом ДНК-секвенаторе ABI PRISM 3130 Genetic Analyzer («Applied Biosystems», США).
RFLP анализ и секвенирование межгенного спейсера 16S-23S рДНК (ITS). Амплификацию межгенного региона рибосомального кластера (ITS) для последующего рестрикционного анализа проводили с использованием праймеров FGPS1490—72: (5'-TGCGGCTGGATCCCCTCCTT-3') (Normand et al., 1996) и FGPL132—38 (5'-CCGGGTTTCCCCATT-3') (Ponsonnet, Nesme, 1994). Температурно-временной профиль амплификации: денатурация при 94 °С — 30 с, отжиг праймеров при 55 °С — 30 с, синтез комплементарной цепи при 72 °С — 1 мин (30 циклов). Рестрикцион-ный анализ проводился с использованием эндонуклеазы рестрикции MSjOI согласно инструкциям производителя. Обработанную рестриктазой ДНК анализировали при помощи электрофореза в 4%-м агарозном геле.
Секвенирование нуклеотидных последовательностей ITS проводили на секвенаторе Genetic Analyzer 3130xl («Applied Biosystems», США).
Анализ нуклеотидных последовательностей. Сравнительный анализ полученных последовательностей с последовательностями базы данных GenBank проводили с помощью программы NCBI Blast (http://www. ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) (Altschul et al., 1990). Выравнивание последовательностей осуществляли с помощью программы CLUSTALW 1.75v. (Thompson et al., 1994), их проверку и редактирование проводили в редакторе «BioEdit 7.0.5.3» (Hall, 1999). Филогенетические деревья строили в программе Mega 3.1 (Kumar et al., 2004) с помощью алгоритма Neighbor-Joining NJ (Nei, Kumar, 2000).
рис. 1. Электрофоретический анализ продуктов рестрикции фрагмента гена 16S рРНК штаммов ризобий сои после обработки его рестриктазой MspI: М — маркер молекулярного веса; 1, 2, 3 — штаммы ризобий сои с интенсивным ростом (КВ11, КС19, КС22); 4 — типовой штамм B. japonicum USDA 6Т; 5, 6, 7 — медленнорастущие штаммы ризобий сои (46, КС23, КН10)
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Известно, что для молекулярной дифференциации штаммов микроорганизмов широко используется метод риботипирования, который базируется на объединении их в группы по признаку сходства последовательностей гена 16$ рРНК. Для первичной молекулярной дифференциации штаммов клубеньковых бактерий сои с разной скоростью роста, выделенных из почв различных регионов Украины, использовали два варианта метода риботипирования: 1) ПЦР-RFLP — анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов 16$ рРНК, 2) секвенирование гена 16$ рРНК.
В результате ПЦР с использованием праймеров 642! и 1445г нами были получены продукты амплификации размером ~800 п. н. С целью обнаружения полиморфизма ДНК у исследованных штаммов клубеньковых бактерий продукты амплификации обрабатывали ферментом — эндонуклеазой рестрикции MspI, которая
общая характеристика исследуемых клубеньковых бактер
«узнает» в молекуле ДНК нуклеотидную последовательность 5'-CCGG-3'. В результате расщепления продукта амплификации было выявлено, что, несмотря на высокую фенотипическую гетерогенность данных брадиризо-бий, по RFLP-профилю гена 16S рРНК штаммы оказались однородны (рис. 1).
Анализ секвенированных последовательностей гена 16S рРНК показал 100 % сходство по этому маркеру штаммов с интенсивным ростом (Bradyrhizobium sp. КВ11, Bradyrhizobium sp. КС19, Bradyrhizobium sp. КС22) и штамма B. japonicum USDA 127 (AF208508). Наряду с этим медленнорастущие штаммы B. japonicum 46 и B. japonicum КН10 продемонстрировали 100 % сходство с типовым штаммом B. japonicum USDA 6T (AB231927), а штамм B. japonicum КС23—100 % сходство со штаммом B. japonicum USDA 4 (AF208515) (табл. 1). Нуклеотидный полиморфизм между референтными штаммами USDA 127, USDA 6 и USDA 4 обусловлен 4 нуклеотидными заменами. Для каждого вида клу-
Таблица 1
й сои с различной скоростью роста
Штамм (род/вид) Географическое происхождение Рост на агаризованной среде Группа штаммов Сходство по 16S рРНК, % Сходство по ITS, %
B. japonicum usDA 6т Япония Медленный B. japonicum USDA 6 100 -
B. japonicum 46 Украина, Винницкая обл. Медленный B. japonicum USDA 6 100 875/883 (99,1 %)
B. japonicum кн 10 Украина, Черниговская обл. Медленный B. japonicum USDA 6 100 875/883 (99,1 %)
B. japonicum кс23 Украина, Сумская обл. Медленный B. japonicum USDA 4 100 876/884 (99,1 %)
Bradyrhizobium sp. кВ11 Украина, Винницкая обл. Интенсивный B. japonicum USDA 127 100 873/875 (99,8 %)
Bradyrhizobium sp. кс19 Украина, Сумская обл. Интенсивный B. japonicum USDA 127 100 873/875 (99,8 %)
Bradyrhizobium sp. кс22 Украина, Сумская обл. Интенсивный B. japonicum USDA 127 100 873/875 (99,8 %)
ГЕНЕТИКА ПОВЕДЕНИЯ
89
Bradyrtuzobium sp. KB 11 Bradyrhizobium sp. KC22 Bradyrhizobium sp. КС 19 B.japonicum USDA 127 (AF208508) B.japonicum USDA 123 (AF363151) — B. yuaiumngense B071 T (NR 028768) I B.japonicum USDA 6 T(AB231927) B. japonicum 46 B.japomcum KH10 -B. canaiiense BTA-1 T(AJ558025) ,B.japomcum USDA 4 (AF208515) 31B. japonicum КС23
-В. betae PL7HGI T(AY372I84)
-B.japonicum USDA 110 (NR 074322)
-B. iriomotense NBRC 102520 T (AB681854) -В. denitrificansIFAM1005 T(NR 041827) - B. jicamae РАС68 T (NR 043036) -B. lablabi CCBAU23086 T(GU433448) elkaniiNBRC 14791 T(AB509378) 100'-S. pachyrliizi PAC48 T(NR 043037)
7"!—M mediterraneum UPM-Ca36 T(L3S825) -M tianshanense USDA 3592 T/AF041447) -M. loti LMG 6125 T(X67229)
штаммы с интенсивным ростом
группа USDA 123
медленнорастущие штаммы (группа USDA 6)
медленнорастущие штаммы (группа USDA 4)
82 100
77J-Ü
q-Lj
11-л. / е
П-Ä. pha
L R. etli (
rSj
00 I—
R leguminosarum LMG 14904 T(AM181757) :. pliaseoli ATCC 14482 T(EF141340) R. etli С FN 42 T(EU488751) S.fiediiATCC 35423 T(DO1272) S. medicaeA 321 T(L39882) 99 <-S. meliloti LMG 6133 T(X67222)
Рис. 2. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа полных нуклеотидных последовательностей 16S рРНК клубеньковых бактерий родов Bradyrhizobium, Rhizobium, Sinorhizobium и Mesorhizobium c использованием алгоритма Neighbor-Joining. Масштаб соответствует 1 замене на 100 пар оснований (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (в %), определенная с помощью «bootstrap» — анализа 1000 альтернативных деревьев
беньковых бактерий рода Bradyrhizobium в базе данных NCBI были найдены последовательности гена 16S рРНК типовых штаммов, которые также были взяты для анализа. В качестве удаленных контролей были использованы ДНК-последовательности 16S рРНК типовых штаммов родов Rhizobium, Sinorhizobium, Mesorhizobium и построено филогенетическое дерево (рис. 2).
Для дифференциации штаммов ризобий сои с разной скоростью роста на внутривидовом уровне мы использовали рестрикционный анализ амплифициро-ванной с использованием праймеров FGPS1490—72 и FGPL132—38 последовательности межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS). Известно, что у клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium рибосомальный 16S-23S-5S рРНК оперон, в отличие от ризобий других родов, представлен в геноме только одной копией, что исключает вероятность получения продуктов амплификации разной длины и нуклеотидного состава, как например, в случае с бактериями рода Rhizobium (Зотов и др., 2012). Размер целевого фрагмента у всех исследованных штаммов клубеньковых бактерий сои составлял около 1000 п. н. После обработки межгенного спейсера
рестриктазой было показано разделение клубеньковых бактерий сои на две группы: к первой группе отнесены штаммы с интенсивным ростом, а во вторую группу объединены медленнорастущие штаммы, имевшие схожий паттерн с типовым штаммом B. japonicum USDA 6Т (рис. 3). Кроме того, нами была определена длина фрагментов рестрикции. Из данных таблицы 2 видно, что у штаммов клубеньковых бактерий сои с медленным и интенсивным ростом совпадают по размеру только два
фрагмента--220 п. н. и ~ 150 п. н. Очевидно, у штаммов
первой группы в амплифицируемом фрагменте присутствует дополнительный сайт узнавания MspI, отсутствующий у штаммов второй группы, что, вероятнее всего, вызвано единственной нуклеотидной заменой.
Таким образом, при изучении структуры межгенного региона 16S-23S рРНК нам впервые удалось выявить два генотипа микросимбионтов сои в почвах Украины, что свидетельствует о генетическом полиморфизме данного региона у клубеньковых бактерий, отличающихся скоростью роста. К первому ITS-типу отнесены штаммы с интенсивным ростом Bradyrhizobium sp. КВ11, Bradyrhizobium sp. КС19, Bradyrhizobium sp.
М 1 2 3 4 6 6 7 М
Рис. 3. Электрофоретический анализ продуктов рестрикции эндонуклеазой MspI межгенного региона 16S-23S рРНК клубеньковых бактерий сои. М — маркер молекулярного веса М100; 1, 2, 3 — штаммы ризобий сои с интенсивным ростом (КВ11, КС19, КС22); 4 — типовой штамм B. japonicum USDA 6Т, 5, 6, 7 — медленнорастущие штаммы ризобий сои (46, КС23, КН10)
КС22, а ко второму ITS-типу отнесены медленнорастущие штаммы B. japonicum 46, B. japonicum КС23, B. japonicum КН10. Полученные результаты свидетельствуют о том, что данный генетический маркер может быть одним из критериев дифференциации представителей почвенных популяций микросимбионтов сои.
Опираясь на полученные результаты, следующим этапом работы было определение нуклеотидных последовательностей межгенного региона 16S-23S рРНК исследуемых микросимбионтов сои, а также проведение их сравнительного анализа. В совокупности с нуклеотид-ными последовательностями типовых штаммов клубеньковых бактерий различных видов рода Bradyrhizobium из GenBank было построено филогенетическое дерево (рис. 4).
Анализ ITS последовательностей исследованных медленнорастущих штаммов показал, что они формируют две достоверно различающихся группы (два кластера). Кластер I образовали штаммы B. japonicum 46, КН10 и типовой штамм B. japonicum USDA 6 Т (группа USDA 6), а кластер II включал штамм B. japonicum КС23 и штамм B. japonicum USDA 4 (группа USDA 4).
В отличие от медленнорастущих микросимбионтов сои, штаммы с интенсивным ростом (Bradyrhizobium sp. КВ11, КС19, КС22) разного эколого-географического
происхождения объединяются в один кластер и образуют обособленную филогенетическую группу штаммов. Особого внимания заслуживает тот факт, что секвенирован-ные последовательности 16S-23S рДНК этих штаммов имеют высокий уровень сходства с аналогичными последовательностями штаммов B. japonicum USDA 127 (сходство 99,8 %) и B. japonicum USDA 123 (сходство 99,5 %) из GenBank, которые относятся к известной, по литературным данным, серогруппе 123. Отличительной особенностью этих штаммов является повышенная сапрофитная компетентность, то есть способность клубеньковых бактерий выживать в почве вне растения-хозяина. Факт доминирования этих штаммов в клубеньках впервые был установлен рядом исследователей в США в многочисленных полевых опытах на разных почвах. Так, при анализе более 600 клубеньков сои, произраставшей в 75 местах штата Айова, было установлено, что штаммы ризобий сои серогруппы 123 преобладали, образуя на корнях от 52 % до 97 % клубеньков (Ham et al., 1971). При изучении местных популяций ризобий сои в почвах Бразилии и Польши также показано доминирование бактерий серогруппы 123 (Godoy et al., 2008; Madrzak et al., 1995).
Важно отметить, что в предыдущих исследованиях с интенсивнорастущими штаммами клубеньковых бактерий сои нами получены аналогичные результаты. С по-
Таблица 2
ITS-типы и рестрикционные паттерны, полученные в ПЦР-анализе 16S-23S рДНК клубеньковых бактерий сои (обработка рестриктазой Мзр!)
Первый ITS-тип Второй ITS-тип
№ Штаммы с интенсивным ростом Медленнорастущие штаммы
з/п КВ11 КС19 КС22 USDA 6Т 46 КС23 КН10
Ориентировочный размер фрагментов (п.н.)
1 590 590 590 590
2 460 460 460
3 220 220 220 220 220 220 220
4 150 150 150 150 150 150 150
5 110 110 110
Bradyrhizobiuiii sp. KB 11 Bradyrhizobiuiii sp. KC22 Bradyrliizobiwn sp. КС 19 - В. Japonicam USDA 123 I.4F20S504) B. japonicum USDA 127 (AF20850S) r-B. japonicum USDA 6 T(HQ143390) B. japonicum KH10
штаммы с интенсивным ростом
группа USDA 123
100
991 В. japonicum 46 —В. cmiariense ВТА-1 T/AY3S670S)
I пг, l- /
-В. betae PL7HG1 Т(AJ631967) - В. japonicum КС23 100 В. japonicum USDA 41AF20S515)
-В. liaoningense 22S11AF2085131
—B. japonicum USDA 110 (AF33S865) -B. iriomotense EK05 T(AB300993) — В. yiiaimängense CCBAU10071 TiAY3S6734i -В. elkanii USDA 76 T(BEU35000)
медленнорастущие штаммы (группа USDA 6)
медленнорастущие штаммы (группа USDA 4)
-В. pachyrhizi PAC4S Т (AY62S092)
-B.jicamae PAC6S Т (AY62S094)
-В. lablabi CCBAU23086 Т (GU433583)
-В. denitrificam IFAM1005 T/AF338176)
0.02
Рис. 4. Филогенетическое дерево, построенное на основе данных сравнительного анализа последовательностей межгенного региона 16S-23S рРНК (ITS) клубеньковых бактерий рода Bradyrhizobium sp. c использованием алгоритма Neighbor-Joining. Масштаб соответствует 2 заменам на 100 пар оснований (эволюционным расстояниям). Цифрами показана статистическая достоверность порядка ветвления (в %), определенная с помощью «bootstrap» — анализа 1000 альтернативных деревьев
мощью серологического метода была проанализирована популяция ризобий, сформированная 8—10 лет назад при выращивании сои, инокулированной медленнорастущими штаммами и штаммами с интенсивным ростом. В ходе исследований обнаружено, что основная часть клубеньков на корнях культурной сои (60—73 % в среднем за последние три года) была образована интенсивнорастущими ризобиями серогруппы КВ11 (первый ITS-тип). Данный факт послужил доказательством их более высокой приживаемости в почве, по сравнению с медленнорастущими штаммами (Крутило, Волкова, 2012).
Исходя из вышесказанного, а также согласно результатам секвенирования гена 16S рРНК и межгенного ITS-региона, интенсивнорастущие штаммы — микросимбионты сои разного эколого-географического происхождения, оказались близки ризобиям группы USDA 123 (сходство 100 % по гену 16S рРНК и 99,5-99,8 % по межгенному ITS-региону) и, следовательно, могут быть отнесены к виду B. japonicum.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, нами впервые проведена оценка гено-типических свойств микросимбионтов сои с медленным и интенсивным ростом, распространённых в почвах Украины. На основании фенотипического и генотипическо-го (16S рРНК и 16S-23S рРНК) сходства медленнорастущих штаммов клубеньковых бактерий сои с типовым штаммом B. japonicum USDA 6Т подтверждена их принадлежность к виду B. japonicum. Поскольку штаммы
с интенсивным ростом по последовательности гена 16S рРНК на 99,7 % сходны с типовым штаммом, а по последовательности межгенного ITS-региона наиболее близки к штамму B. japonicum USDA 127 (сходство 99,8 %) широко известной серогруппы 123, это позволило сделать вывод о принадлежности интенсивнорастущих штаммов также к виду B. japonicum.
Основываясь на результатах рестрикционного анализа межгенного региона, исследованные ризобии сои были разделены на два ITS-типа, которые соответствуют распределению штаммов на физиологические группы. Согласно результатам секвенирования нуклеотидных последовательностей ITS ризобии сои с разной скоростью роста образуют 3 достоверно различающихся кластера, два из которых включают медленнорастущие штаммы (группа USDA 6 и USDA 4), а третий формируют интенсивнорастущие микросимбионты сои (группа USDA 123).
Полученные нами данные, относительно генетического разнообразия микросимбионтов сои в почвах Украины, согласуются с результатами исследователей других стран, которые также указывают на существование разных ITS-типов клубеньковых бактерий сои в почвах с различной интенсивностью выращивания культурной сои (Madrzak et al., 1995; Saeki et al., 2007; Jaiswal et al., 2012).
Следует отметить, что большинство работ по оценке разнообразия и структуры популяций клубеньковых бактерий сои проводились с использованием штаммов, выделенных из местных многочисленных популяций ризобий, которые сформировались в регионах интенсивного выра-
щивания сои (van Berkum and Fuhrmann, 2000; Appunu et al., 2008; Jaiswal et al., 2012). Значительно меньше внимания уделялось изучению биоразнообразия ризобий сои в относительно молодых популяциях, которые формируются в почвах, не содержащих местных специфических бактерий. Вместе с тем обнаружение и часто доминирование клубеньковых бактерий сои группы USDA 123 в почвах стран как традиционного выращивания сои (Китай, Индия, Япония), так и стран, где соя является относительно новой культурой (Украина, Польша), является весьма интересным фактом, требующим особого внимания (Madrzak et al., 1995; Saeki et al., 2007; Jaiswal et al., 2012; Крутило, Волкова, 2012). Вполне вероятно, что в ходе коэволюции симбиотических партнеров некоторые генотипы клубеньковых бактерий могли приобрести способность к повышенному выживанию в почве и преимущественному инфицированию растения-хозяина.
Особый интерес представляет вопрос о распространении штаммов с интенсивным ростом (группы USDA 123) в почвах Украины, учитывая то, что на момент выделения данных штаммов в качестве инокулянтов использовалось ограниченное количество биопрепаратов, биоагентами которых были медленнорастущие клубеньковые бактерии сои (Ризоторфин). Даже если предположить, что в определенном регионе страны интенсивнорастущие штаммы были интродуцированы в почву, остается открытым вопрос о распространении этих штаммов в другие регионы.
Полученные результаты демонстрируют необходимость дальнейшего детального анализа популяций клубеньковых бактерий сои в агроценозах культурной сои с привлечением новых методов. Изучение ризобий сои с интенсивным ростом позволит расширить наши знания о формировании биоразнообразия и природного потенциала местных популяций микросимбионтов относительно новой для Украины культуры — сои.
БЛАГОДАРНОСТИ
Коллектив авторов выражает искреннюю благодарность руководителю отделения геномных технологий Центра коллективного пользования научным оборудованием «Геномные технологии и клеточная биология» Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной микробиологии Россельхозакаде-мии, к. б. н., Андронову Евгению Евгеньевичу за помощь в проведении рестрикционного анализа, обсуждение полученных результатов и ценные советы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бабич А. О. (1993) Сучасне виробництво i вико-ристання сой К.: Урожай. 432 с.
2. Зотов В. С., Пунина Н. В., Хапчаева С. А. и др. (2012) Новый таксономический маркер клубень-
ковых бактерий рода Rhizobium и его эволюция.
Экологическая генетика. Т. 10(2): С. 50-63.
3. Коростик Е. В., Пинаев А. Г., Ахтемова Г. А., Андронов Е. Е. (2006) Универсальные 16S rRNA прай-меры для описания генетического разнообразия сообщества почвенных прокарют. Экологическая генетика. Т. 4(4): С. 32-37.
4. Крутило Д. В., Волкова I. В. (2012) Серолопчне р1з-номанггтя бульбочкових бактерш со'1 у грунтах Украши. Агроеколог1чний журнал. № 4: C. 66-71.
5. Крутило Д. В., Надкернична О. В., Ковалевсь-ка Т. М., Патика В. П. (2008) Бюлопчна рiзно-манггшсть бульбочкових бактерш со'1 в грунтах Украши. М1кробюл. журн. Т. 70(6): С. 27-34.
6. Патика В. П., Крутило Д. В., Надкернична О. В. та ш. (2010) Фенотипш та генотипш ознаки бульбочкових бактерш со'1, поширених у грунтах Украши. Допов1д1 НАНУкрати. № 8: С. 167-172.
7. Патика В. П., Коць С. Я., Волкогон В. В. та ш. (2003) Бюлопчний азот / за ред. В. П. Патики. К.: Свгг. 424 с.
8. Толкачев Н. З. (1990) Модифицированный метод определения количества клубеньковых бактерий сои в почве. Тр. ВНИИСХМ. Т. 60; С. 37-43.
9. Толкачев Н. З. (1997) Потенциальные возможности симбиотической азотфиксации при выращивании сои на юге Украины. Мжробюл. журн. Т. 59(4): С. 34-41.
10. Altschul S. F., Gish W., Miller W. et al. (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. V. 2150: P. 403-410.
11. Appunu C., N'Zoue A., Laguerre G. (2008) Genetic diversity of native Bradyrhizobia isolated from soybeans (Glycin max L.) in different agricultural-ecological-climatic regions of India. Appl. Environ. Microbiol. V. 74: P. 5991-5996.
12. Beringer J. E. (1974) R1 transfer in Rhizobium legu-minosamm. J. Gen. Microbiol. V. 84: P. 188-198.
13. Chen W., Wang E., Wang S. et al. (1995) Characteristics of Rhizobium tianshanense sp. nov., a moderately and slowly growing root nodule bacterium isolated from an arid saline environment in Xinjiang, people's republic of China. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 45(1): Р. 153-159.
14. Chen W. X., Yan G. H., Li J. L. (1988) Numerical taxonomic study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 38(4): Р. 392-397.
15. Godoy L. P., Vasconcelos A. T. R., Chueire L. M. O. et al. (2008) Genomic panorama of Bradyrhizobium japonicum CPAC 15, a commercial inoculant strain largely established in Brazilian soils and belonging to the same serogroup as USDA 123. Soil Biology and Biochemistry. V. 40(11): P. 2743-2753.
16. Hall T. A. (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. V. 41: P. 95-98.
17. Ham G. E., Frederick L. R., Anderson I. C. (1971) Se-rogroups of Rhizobium japonicum in soybean nodules sampled in Iowa. Agronomy Journal. V. 63(1): Р. 69-72.
18. Jaiswal S. K., Anand A., Dhar B., Vaishampayan A. (2012) Genotypic characterization of phage-typed indigenous soybean Bradyrhizobia and their host range symbiotic effectiveness. Microbiol. Ecol. V. 63 (1): P. 116-126.
19. Jordan D. C. (1982) Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow-growing, root nodule bacteria from leguminous plants. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 32: P. 136-139.
20. Keyser H. H., Cregan P. B. (1987) Nodulation and Competition for nodulation of selected soybean genotypes among Bradyrhizobium japonicum serogroup 123 isolates. Appl Environ. Microbiol. V. 53(11): P. 2631-2635.
21. Kumar S., Tamura K., Nei M. (2004) MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bio-informatics. V. 5: P. 150-163.
22. Laguerre G. (1992) Plasmid profiles and restriction fragment length polymorphism of Rhizobium legu-minosarum bv. viceae in field populations. FEMS Microbiol. Ecol. V. 10: P. 17-26.
23. Madrzak C. J., Golinska B., Kroliczak J., et al. (1995) Diversity among Field Populations of Bradyrhizobium japonicum in Poland. Appl. Environ. Microbiol. Vol. 61(4): P. 1194-1200.
24. Nei M., Kumar S. (2000) Molecular evolution and phy-logenetics. New York: Oxford University Press. 336 p.
25. Normand P., Ponsonnet C., Nesme X., et al. (1996) ITS analysis of prokaryotes. Molec. Microbial Ecology Manual. V. 5(3.4): P. 1-12.
26. Ponsonnet C., Nesme X. (1994) Identification of Agrobacterium strains by PCR-RFLP analysis of pTi and chromosomal regions. Arch. Microbiol. V. 161: P. 300-309.
27. Rhizobiaceae. Молекулярная биология бактерий, взаимодействующих с растениями / под ред. Спайнка Г., Кондороши А., Хукаса П. Пер. с англ. С-Пб.: Бионт. 2002. 558 с.
28. Saeki Y., Murata T., Yamakawa T., Akao S. (2007) Differentiation of soybean-nodulating Bradyrhizobi-um USDA strains using restriction fragment length polymorphism analysis of 23S-5S rRNA genes. Soil Science and Plant Nutrition. V. 53: P. 562-567.
29. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence
weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nuc. Ac. Res. V. 22: P. 4673-4680.
30. Van Berkum P., Fuhrmann J. J. (2000) Evolutionary relationships among the soybean Bradyrhizobia reconstructed from 16S rRNA gene and internally transcribed spacer region sequence divergence. Int. J. Syst. EV. Microbiol. V. 50: P. 2165-2172.
31. Weisburg W. G., Barns S. M.,Pelletier D. A.,Lane D. J. (1991) 16S ribosomal DNA amplification for phylo-genetic study. J. Bacteriol. V. 173: P. 697-703.
32. Willems A. (2006) The taxonomy of rhizobia: an overview. Plant and Soil. V. 287: P. 3-14.
33. Xu L. M., Ge C., Cui Z. et al. (1995) Bradyrhizobium liaoningense sp. nov., isolated from the root nodules of soybeans. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 45: P. 706-711.
GENOTYPIC ANALYSIS OF NODULE BACTERIA NODULATING SOYBEAN IN UKRAINE SOILS
Krutylo D. V., Zotov V. S.
C SUMMARY: Background. Distribution of root nodule bacteria of soybean in soils of Ukraine is the result of intensive cultivation of soybeans over the last 20 years. During the observation the structure of soybean rhizobia populations for the first time we have determined the strains which significantly differ in phenotypic properties from typical slow-growing bacteria of B. japonicum species previously described. These strains are characterized by high speed growth and we tentatively called them "stains with intensive growth". The aim of our work was to investigate the genotypic properties of microsymbionts of soybeans with different rates of growth spreading in soils of Ukraine. Materials and methods. The 16S rRNA gene and intergenic 16S-23S rRNA region of six strains - typical representatives of soybean nodule bacteria with slow- and intensive growth-rates was carried out. The strains were picked up from different Ukrainian soils. Results. Analysis of the 16S rRNA nucleotide sequences showed the 100% similarity of slow-growing strains to B.japonicum USDA 6T and USDA 4 ones. This analysis proved propinquity of strains with intensive growth to the strain B. japonicum USDA 127 (USDA 123 group). Representatives of this group possessed increased saprophytic competence so as the examined strains. With use of restriction analysis of ITS intergenic region soybean rhizobia were divided among two ITS types: 1st ITS type — strains with intensive growth, 2nd ITS type — slow- growing strains. According to results of ITS-region sequencing soybean rhizobia form 3 reliably different clusters: two of which include slow-growing strains (group USDA 6 and USDA 4), and a third include soybean microsymbionts with intensive growth (USDA 123 group). Conclusion. On the basis of phenotypic and genotypic (16S rRNA and 16S-23S rRNA) analysis all of the investigated soybean strains of root nodule bacteria were related to the Bradyrhizobium japonicum species. The division of strains by the structure of the ITS-region into two genotypes corresponds to the division of strains into two physiological groups: the strains of an intense and slow growth.
C KEY WORDS: Bradyrhizobium japonicum, 16S rRNA, 16S-23S rRNA (ITS), RFLP-analysis, DNA sequencing, Glycine max.
c references (transliterate)
1. Altschul S. F., Gish W., Miller W. et al., (1990) Basic local alignment search tool. J. Mol. Biol. V. 215: P. 403-410.
2. Appunu C., N'Zoue A., Laguerre G., (2008) Genetic diversity of native Bradyrhizobia isolated from soybeans (Glycin max L.) in different agricultural-ecological-climatic regions of India. Appl. Environ. Microbiol. V. 74: P. 5991-5996.
3. Babich A. O. suchasne virobnitstvo i vikoristannya soyi [Modern production and use of soybean]. Kyiv, urozhaj. 1993. 432 p.
4. Beringer J. E. (1974) R1 transfer in Rhizobium legu-minosamm. J. Gen. Microbiol. V. 84: P. 188-198.
5. Chen W., Wang E., Wang S. et al. (1995) Characteristics of Rhizobium tianshanense sp. nov., a moderately and slowly growing root nodule bacterium isolated from an arid saline environment in Xinjiang, people's republic of China. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 45(1): P. 153-159.
6. Chen W. X., Yan G. H., Li J. L. (1988) Numerical taxonomic study of fast-growing soybean rhizobia and a proposal that Rhizobium fredii be assigned to Sinorhizobium gen. nov. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 38(4): P. 392-397.
7. Godoy L. P., Vasconcelos A. T. R., Chueire L. M. O. et al. (2008) Genomic panorama of Bradyrhizobium japonicum CPAC 15, a commercial inoculant strain largely established in Brazilian soils and belonging to the same serogroup as USDA 123. Soil Biology and Biochemistry. V. 40(11): P. 2743-2753.
8. Hall T. A. (1999) BioEdit: a user-friendly biological sequence alignment editor and analysis program for Windows 95/98/NT. Nucl. Acids. Symp. Ser. V. 41: P. 95-98.
9. Ham G. E., Frederick L. R., Anderson I. C. (1971) Sero-groups of Rhizobium japonicum in soybean nodules sampled in Iowa. Agronomy Journal. V. 63(1): P. 69-72.
10. Jaiswal S. K., Anand A., Dhar B., Vaishampayan A. (2012) Genotypic characterization of phage-typed indigenous soybean Bradyrhizobia and their host range symbiotic effectiveness. Microbiol. Ecol. V. 63 (1): P. 116-126.
11. Jordan D. C. (1982) Transfer of Rhizobium japonicum Buchanan 1980 to Bradyrhizobium gen. nov., a genus of slow-growing, root nodule bacteria from leguminous plants. Int. J. Syst. Bacteriol. V. 32: P. 136-139.
12. Keyser H. H., Cregan P. B. (1987) Nodulation and Competition for nodulation of selected soybean genotypes among Bradyrhizobium japonicum serogroup 123 isolates. Appl. Environ. Microbiol. V. 53(11): P. 2631-2635.
13. Korostik E. V., Pinaev A. G., Akhtemova G. A., Andro-nov E. E. (2006) universalnyie 16s rRNA praymeryi dlya opisaniya geneticheskogo raznoobraziya soob-schestva pochvennyih prokariot [universal 16s rRNA
primers BD1 for soil microbial community analysis].
Ecological genetics («Ekologicheskaja genetika»). V. 4(4): P. 32-37.
14. Krutylo D. V., Volkova I. V. (2012) serologichne riznomanittya bulbochkovih bakteriy soyi u gruntah ukrayini [serological diversity of soybean nodule bacteria in ukraine soils]. Agroecological journal. № 4: P. 66-71.
15. Krutylo D. V., Nadkernychna О. V., Kovalevska Т. М., Patyka V. P. (2008) Biologichna riznomanitnist bulbochkovih bakteriy soyi v gruntah ukrayini [Biological diversity of soybean nodule bacteria in soils of ukraine]. Microbiologichny zhurnal. V. 70(6): P. 27-34.
16. Kumar S., Tamura K., Nei M. (2004) MEGA3: Integrated software for molecular evolutionary genetics analysis and sequence alignment. Briefings in Bioin-formatics. V. 5: P. 150-163.
17. Laguerre G. (1992) Plasmid profiles and restriction fragment length polymorphism of Rhizobium legumi-nosarum bv. viceae in field populations. FEMS Microbiol. Ecol. V. 10: P. 17-26.
18. Madrzak C. J., Golinska B., Kroliczak J., et al., 1995. Diversity among Field Populations of Bradyrhizobium japonicum in Poland. Appl. Environ. Microbiol. V. 61(4): P. 1194-1200.
19. Nei M., Kumar S. (2000) Molecular evolution and phylogenetics. New York: Oxford University Press. 336 p.
20. Normand P., Ponsonnet C., Nesme X. et al. (1996) ITS analysis of prokaryotes. Molec. Microbial Ecology Manual. V. 5(3.4): P. 1-12.
21. Ponsonnet C., Nesme X. (1994) Identification of Agrobac-terium strains by PCR-RFLP analysis of pTi and chromosomal regions. Arch. Microbiol. V. 161: P. 300-309.
22. Patyka V. P., Krutylo D. V., Nadkernychna О. V., et al. (2010) Fenotipni ta genotipni oznaki bulbochkovih bakteriy soyi, poshirenih u gruntah ukrayini [Phe-notypic and genotypic signs of soybean nodule bacteria widespread in soils of ukraine]. Reports of NAS of Ukraine. № 8: P. 167-172.
23. Patyka V. P., Kots S.Ya., Volkogon V. V. et al. (2003) Biologichniy azot [Biological nitrogen]. V. P. Patyka (eds.). Kyiv, Svit. 424 p.
24. Spaink H., Kondorosi A., Hooykaas P. (2002) Rhizo-biaceae: molecular biology of model plant-associated bacteria/transl. from English. I.А. Tikhonovich, N. А. Provorov. St. Peterburg, IPK — Biont. 558 p.
25. Saeki Y., Murata T., Yamakawa T., Akao S. (2007) Differentiation of soybean-nodulating Bradyrhizobium USDA strains using restriction fragment length polymorphism analysis of 23S-5S rRNA genes. Soil Science and Plant Nutrition. V. 53: P. 562-567.
26. Thompson J. D., Higgins D. G., Gibson T. J. (1994) CLUSTAL W: improving the sensitivity of progres-
sive multiple sequence alignment through sequence weighting, position specific gap penalties and weight matrix choice. Nuc. Ac. Res. V. 22: P. 4673-4680.
27. Tolkachov N. Z. (1990) Modifitsirovanyiy metod opredeleniya kolichestva klubenkovyih bakteriy soi v pochve [A modified method of determining the amount of soybean root nodule bacteria in the soil]. ARRIAM works («trudy VNIISHM»). V. 60: P. 37-43.
28. Tolkachov N. Z. (1997) Potentsialnyie vozmozhnosti simbioticheskoy azotfiksatsii pri vyiraschivanii soi na yuge Ukrainyi [Potentialities of soybean symbiotic nitrogen fixation in the south of Ukraine]. Microbio-logichny zhurnal. V. 59(4): P. 34-41.
29. Van Berkum P., Fuhrmann J. J. (2000) Evolutionary relationships among the soybean Bradyrhizobia reconstructed from 16S rRNA gene and internally tran-
scribed spacer region sequence divergence. Int. J. Syst. EV. Microbiol. V. 50: P. 2165-2172.
30. Weisburg W. G., Barns S. M.,Pelletier D. A.,Lane D. J. (1991) 16S ribosomal DNA amplification for phyloge-netic study. J. Bacteriol. V. 173: P. 697-703.
31. Willems А. (2006) The taxonomy of rhizobia: an overview. Plant and Soil. V. 287: P. 3-14.
32. Xu L. M., Ge C., Cui Z. et al. (1995) Bradyrhizobium liaoningense sp. nov., isolated from the root nodules of soybeans. International Journal Syst. Bacteriol. Vol. 45: P. 706-711.
33. Zotov V. S., Punina N. V, Khapchaeva S. A. et al. (2012) Novyiy taksonomicheskiy marker klubenkovyih bakteriy roda Rhizobium i ego evolyutsiya [The new taxo-nomic marker of nodulation bacteria of Rhizobium genus and its evolution]. Ecological genetics («Ekolo-gicheskaja genetika»). V. 10(2): P. 50-63.
C Информация об авторах
Крутило Дмитрий Валериевич — к. б. н., старший научный сотрудник лаборатории растительно-микробных взаимодействий. Институт сельскохозяйственной микробиологии и агропромышленного производства НААН. 14027, Украина, Чернигов, ул. Шевченко, д. 97. E-mail: krutilod@mail.ru.
Зотов Василий Сергеевич — младший научный сотрудник лаборатории биохимии азотфиксации и метаболизма азота. Институт биохимии им. А. Н. Баха РАН. 119071, Москва, Ленинский пр-т., д. 33. E-mail: adni83@yandex.ru.
Krutylo Dmitriy Valeriyevich — Ph.D., senior research scientist, Laboratory of plant-microbial interactions, Institute of Agricultural Microbiology and Agro-industrial Manufacture, National Academy of Agrarian Sciences of Ukraine. 14027, Chernigov, Shevchenko St., 97. Ukraine. E-mail: krutilod@mail.ru.
Zotov Vasiliy Sergeyevich — junior research scientist, Laboratory of biochemistry of nitrogen fixation and nitrogen metabolism. A. N. Bach Institute of Biochemistry, Russian Academy of Sciences. 119071, Moscow, Leninskiy prospekt, 33. Russia. E-mail: adni83@yandex.ru.
