CC BY
34
ОРИГИНАЛЬНОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ
УДК 579.64
Новые штаммы бактерий Pseudomonas laurentiana — перспективные агенты для агробиотехнологии
Г.Ф. Рафикова* ф, Е.В. Кузина, Т.Ю. Коршунова, О.Н. Логинов
Уфимский Институт биологии, Уфимский федеральный исследовательский центр, РАН, 450054, г. Уфа, просп. Октября, д. 69, лит. Е *e-mail: rgf07@mail.ru
Из активного ила биологических очистных сооружений были выделены штаммы бактерий АНТ 17 и АНТ 56, обладающие способностью к подавлению роста фитопатогенного гриба Bipolaris sorokiniana. Изучение культурально-морфологических и физиолого-биохимиче-ских свойств, а также нуклеотидных последовательностей гена 16S рРНК и состава жирных кислот клеточных стенок показало принадлежность штаммов АНТ 17 и АНТ 56 к виду Pseudomonas laurentiana. Было установлено, что штаммы — P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 — обладают комплексом свойств, характерных для PGP-микро-организмов (от англ. plant growth-promoting — способствующие росту растений): проявляют антигрибную активность в отношении фитопатогенных микромицетов, способны к разложению фосфатов и синтезу фитогормональных веществ. Инокуляция обоими штаммами семян растений огурца, томата и капусты оказывала благоприятное воздействие на их всхожесть. Предпосевная обработка семян пшеницы в условиях естественного инфекционного фона инокулятом выделенных штаммов бактерий способствовала снижению распространения грибов, вызывающих корневые гнили. Предполагается возможность применения штаммов P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 в биотехнологии с целью повышения продуктивности агроэкосистем. Способность к стимулированию роста и развития растений для штаммов вида P. laurentiana показана впервые.
Ключевые слова: Pseudomonas laurentiana, PGP-микроорганизмы, ген 16SрРНК, антигрибная активность, индолилуксусная кислота, цитокинины
Род Pseudomonas на сегодняшний день является наиболее многочисленной группой грамо-трицательных бактерий и включает более 191 вида. Представители рода обладают широкими метаболическими возможностями и являются обитателями различных сред и источников, таких как вода, почва, растения, животные. Они выполняют функции, связанные с разложением органических веществ, стимулированием роста растений и др., а также могут оказывать патогенное воздействие [1].
Среди псевдомонад большое количество штаммов, относящихся к группе PGPR (от англ. plant growth-promoting rhizobacteria - ризобакте-рии, способствующие росту растений). PGPR могут усиливать рост растений с помощью самых разнообразных механизмов: биологической фиксации азота, солюбилизации фосфатов, синтеза фитогормонов, сидерофоров, антибиотических веществ, 1 -аминоциклопропан-1 -карбоксилат-деаминазы, летучих органических соединений, индукции системной устойчивости и др. [2]. В почве PGPR могут эффективно конкурировать с аборигенной микробиотой, приживаться в ризосфере растений и затем функционировать в особых условиях данной экосистемы [3].
В настоящей работе представлено описание таксономического положения и комплекса полезных для растений свойств у двух новых PGP-штаммов рода Pseudomonas, которые в рамках данного исследования были идентифицированы как представители вида Р. laurentiana. Этот вид был открыт относительно недавно [4], и его типовой штамм описан как микроорганизм, способный к окислению Mn(III). Способность к стимулированию роста и развития растений для штаммов вида P. laurentiana показана впервые.
Материалы и методы
Объектами исследования служили штаммы бактерий: АНТ 17 — выделенный из проб активного ила биологических очистных сооружений нефтеперерабатывающего предприятия, расположенного в г. Орск (Оренбургская область); АНТ 56 — выделенный из проб активного ила биологических очистных сооружений предприятия, являющегося крупным производителем кальцинированной, пищевой и каустической соды в России (г. Стерлитамак, Республика Башкортостан).
Бактерии рода Pseudomonas выделяли на жидкой среде Козера с 0,1% соли пировиноградной кислоты в качестве источника углерода [5].
Культурально-морфологические и физиоло-го-биохимические свойства микроорганизмов определяли по общепринятым методикам [6] при выращивании на мясопептонном агаре (МПА) и селективных средах Кинг А и Кинг Б [5]. Первичную идентификацию бактерий проводили согласно определителю Берджи [7].
Амплификацию гена 16S рРНК осуществляли с использованием универсальных праймеров [8]. Секвенирование полученных ПЦР-фрагментов проводили с использованием набора реагентов ABI PRISM BigDye Terminator v.3.1 (Applied Biosystems, США) с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе «ABI PRIZM 3730» (Applied Biosystems, США). Поиск нуклеотидных последовательностей генов 16S рРНК, гомологичных соответствующим последовательностям исследуемого штамма, и расчет их попарного сходства проводили с помощью сервера EzBioCloud (http://ezbiocloud.net) [9]. Дендрограммы филогенетического сходства строили в программе MEGA X [10] методом neighbor-joining [11] с использованием двухпара-метрической модели Кимура [12].
Состав жирных кислот клеточных стенок исследуемых штаммов определяли с помощью идентификационной системы Sherlock 6.1 (MIDI; Microbial ID) в соответствии с техническими инструкциями этой системы [13].
Наличие способности к синтезу индолилук-сусной кислоты (ИУК) и цитокининоподобных веществ выявляли с помощью иммуноферментно-го анализа так, как описано ранее [14].
Антагонистические свойства выделенных штаммов бактерий в отношении фитопатогенных микромицетов оценивали в условиях in vitro методом совместного культивирования в чашках Петри [15]. Засеянные чашки инкубировали в течение 72 ч при 28°С. В качестве тест-организмов, обладающих фитопатогенной активностью, использовали Fusarium avenaceum ВКМ 132, F. culmorum ВКМ 844, F. gibbosum ВКМ 848, F. nivale ВКМ 3106, F. oxysporum ВКМ 137, F. semitectum ВКМ 1938, F. solani ВКМ 142, Bipolaris sorokiniana ИБ Г-12. Последняя культура является местным изолятом и хранится в Коллекции микроорганизмов Уфимского Института биологии Уфимского федерального исследовательского центра (УФИЦ) РАН.
Для изучения влияния железа на антигрибные свойства бактериальных штаммов проводили сравнение антагонистической активности бактерий на среде Кинг Б в отсутствие FeCl3 и при добавлении 100 мкг/мл FeCl3.
Способность к гидролизу фосфатов изучали на средах Пиковской (состав (г/л): Са3(РО4)2 -5,0; глюкоза - 20,0; NaCl - 0,2; MgS04 - 0,1; MnSO4 - следы; FeS04 - следы, агар-агар - 20,0) и Муромцева (состав (г/л): глюкоза - 10; аспара-
гин — 1; K2SO4 — 0,2; кукурузный экстракт — 0,02; агар-агар - 20; свежеосажденный Са3(РО4)2 - 1,5).
Для определения влияния бактеризации штаммами на всхожесть семян сельскохозяйственных культур использовали семена растений томата, огурца и капусты. Для обработки использовали разбавленную культуру бактерий (титр ~105 КОЕ/мл), выращенных на питательной среде Кинг Б. Контролем служили семена, замоченные в дистиллированной воде. Всхожесть семян определяли на вторые и четвертые сутки.
Изучение эффективности штаммов-антагонистов против комплекса возбудителей корневых гнилей проводили в лабораторных условиях на семенах мягкой яровой пшеницы (всхожесть 90,7%) с естественным уровнем заражения посевного материала спорами фитопатогенных грибов F. oxysporum и B. sorokiniana. В качестве эталонов использовали биопрепарат «Ризоплан» (0,5 л/т), основу которого составляет штамм бактерий Pseudomonas fluorescens АР-33. Через 7 сут учитывали распространение и развитие корневых гнилей проростков, а также распространение на семенах альтернариоза. Статистическую обработку данных проводили с использованием MS Excel. В таблицах данные представлены как среднее ± стандартная ошибка. Достоверность различий оценивали по t-критерию Стьюдента.
Результаты и обсуждение
Скрининг. В результате скрининга были выделены штаммы, обладающие способностью к росту на селективной среде для псевдомонад и образованию флуоресцирующих пигментов. Основополагающим критерием для дальнейшего отбора бактерий являлась способность штаммов к подавлению роста фитопатогенного гриба B. sorokiniana, вызывающего гельминтоспориоз-ные корневые гнили, темно-бурую пятнистость листьев, симптом «черного зародыша», сажистый налет на колосьях злаковых культур. В результате было отобрано два штамма — АНТ 17 и АНТ 56 — с наиболее высокой степенью антагонистической активности.
Идентификация новых PGP-штаммов. Клетки изучаемых штаммов АНТ 17 и АНТ 56 — грам-отрицательные подвижные палочки, не образующие споры. На плотной питательной среде МПА колонии округлые с ровными краями, гладкие, слабовыпуклые, непрозрачные, серовато-белые, диаметром 5—7 мм. На МПА и среде Кинг Б образуют желто-зеленый флуоресцирующий пигмент. На диагностической среде Кинг А образование синего пигмента не отмечено. На скошенном мясо-пептонном агаре штрих сплошной, с ровными краями. На жидкой среде (мясопептонный бульон) штамм АНТ 17 образует обильный, плотный, дискообразный осадок; штамм АНТ 56 — обильный, хлопьевидный осадок и тонкую, сплошную, рых-
лую пленку. Каталазо- и оксидазоположительные, метаболизм — дыхательный. Оптимальная температура роста - 28°С, растут при 4°С и в присутствии 3% №01. Не нуждаются в дополнительных органических факторах роста. Не восстанавливают нитрат до нитритов, синтезируют аргининдегидро-лазу. Не гидролизуют желатин, крахмал и лецитин. Не способны к образованию левана из сахарозы и липолизу Твин-80. Оба штамма утилизируют с образованием кислоты следующие углеводы: глюкозу, ксилозу, арабинозу, галактозу. Используют широкий диапазон субстратов: сахарозу, мальтозу, фруктозу, глицерин, этанол, пропанол, бутанол, гексанол, пропионовую, янтарную, а-кетоглутаровую кислоты, ацетат, пируват, лак-тат, цитрат, БЬ-лейцин, Ь-аргинин, БЬ-а-аланин, БЬ-валин, Ь-пролин, БЬ-лизин, Ь-тирозин, Ь-аспарагин, фенилаланин. Способны к росту на безазотистой среде Эшби.
Кроме того, штамм АНТ 56 образует кислоту из раффинозы, лактозы, рамнозы. Использует изомасляную кислоту, не использует маннит, сорбит, Ь-инозит, малеиновую, адипиновую и антраниловаую кислоты, оксалат, БЬ-треонин, БЬ-серин, БЬ-метионин, БЬ-цистеин, БЬ-трип-тофан, Б-аспарагин, тетрадекан, октадекан, аце-тамид, формальдегид, фенол. Продуцирует экзо-полисахарид при росте в жидкой культуре на картофельно-глюкозной среде и среде Федорова с мелассой в качестве источника углерода.
При нанесении живых клеток исследуемых штаммов бактерий на срезы картофеля не наблю-
далось разрушения растительных клеток, что свидетельствует об отсутствии фитопатогенной активности у данных штаммов.
По совокупности культурально-морфологиче-ских и физиолого-биохимических свойств штаммы АНТ 17 и АНТ 56 были предварительно идентифицированы как принадлежащие к роду Fseudomonas и депонированы в Коллекцию микроорганизмов Уфимского Института биологии УФИЦ РАН под номерами IB-B 5-17 и IB-B 5-56 соответственно.
Для изучаемых микроорганизмов было проведено секвенирование гена, кодирующего 16S pPHK. Нуклеотидные последовательности штаммов АНТ 17 (1402 п.н.) и АНТ 56 (1344 п.н.) депонированы в GenBank (MN541118 и MN541119 соответственно).
В результате их сравнительного анализа установлено, что максимальное сходство штамма АНТ 17 наблюдалось с типовыми штаммами P. laurentiana GSL-010T (99,29%), P. japonica NBRC 103040T (98,79%) и P. huaxiensis WCHPs060044T (98,79%).
Степень гомологии между нуклеотидными последовательностями гена 16S рРНК штамма АНТ 56 и штаммов P. laurentiana GSL-010T, P. rhizosphaerae DSM16299T, P. japonica NBRC 103040T была равна 99,63, 99,18 и 99,11% соответственно.
С целью уточнения филогенетического положения было построено древо на основе сравнительных данных о последовательности нуклеотидов гена 16S рРНК видов, относящихся к роду Pseudomonas (рисунок). На дендрограмме видно,
Pseudomonas taiwanensis BCRC 17751 (T)/EU 103629 Pseudomonas asiatica RYU5(T)/MH517510
-Pseudomonas sichuanensis WCHPs060039(T)/QKVM01000121
I-Pseudomonas monteilii NBRC 103158(T)/BBIS01000088
1— Pseudomonas plecoglossicida NBRC 103162(T)/BBIV01000080 -Pseudomonas reidholzensis CCOS 865(T)/LT009707
-Pseudomonas putida NBRC 14164(T)/AP013070
Pseudomonas japonica NBRC 103040(T)/BBIR01000146 — Pseudomonas alkylphenolica KL28(T)/CP009048
- Pseudomonas huaxiensis WCHPs060044(T)/MH428812 -Pseudomonas vranovensis CCM 7279(T)/AY970951
Pseudomonas donghuensis HYS(T)/AJJP01000212
Pseudomonas tructae SNU WT1 (T)/CP035952
ipc
Pseudomonas wadenswilerensis CCOS 864(T)/LT009706 991 Pseudomonas sp. AHT 17 ' Pseudomonas sp. AHT 56 - Pseudomonas laurentiana GSL-010(T)/KY471137
_94j-Pseudomonas coleopterorum Esc2Am(T)/KM888184
731 I-Pseudomonas rhizosphaerae DSM 16299(T)/CP009533
-Pseudomonas graminis DSM 11363(T)/Y11150
-Pseudomonas helmanticensis OHA11 (T)/HG940537
Pseudomonas mohnii DSM 18327(T)/FNRV01000001 Pseudomonas baetica a390(T)/FM201274 Pseudomonas moorei RW10(T)/AM293566
Рисунок. Филогенетическое положение штаммов Pseudomonas sp. АНТ 17 и Pseudomonas sp. АНТ 56, основанное на анализе ну-клеотидных последовательностей гена 16S рРНК. Масштаб показывает эволюционное расстояние, соответствующее двум ну-клеотидным заменам на каждые 1000 нуклеотидов. Числами показана статистическая достоверность порядка ветвления, определенная с помощью «bootstrap^-анализа (приведены значения «bootstrap^-анализа выше 70%).
что изучаемые микроорганизмы образуют общий кластер, при этом филогенетически наиболее близким к ним штаммом является типовой представитель вида P. laurentiana (P. laurentiana GSL-010T).
В качестве еще одного таксономического признака был изучен жирнокислотный состав клеточной стенки штаммов АНТ 17 и АНТ 56 (табл. 1). В ходе исследований было показано, что в профилях обоих штаммов доминирующими являлись гексадекановая (С16:0), комбинация гексадецено-вой и пентадеценовой (С16:1 ю7е + С15:1 iso 2-OH), цис-11-октадеценовая (С18:1 ю7е) и гекса-деценовая (С16:1) жирные кислоты. В целом жир-нокислотный профиль штаммов соответствует таковому у типового штамма вида P. laurentiana GSL-010.
Таблица 1
Содержание жирных кислот в клетках штаммов Pseudomonas sp. АНТ 17, Pseudomonas sp. АНТ 56 и P. laurentiana GSL-010T [4] (% от суммарного)
Жирные кислоты Pseudomonas sp. АНТ 17 Pseudomonas sp. АНТ 56 P. laurentiana GSL-010T
С10:0 0,2 - 0,1
С12:0 2,5 2,3 2,7
С14:0 1,4 1,9 1,8
С15:0 - 0,3 0,4
С16:0 37,1 33,6 32,3
С17:0 0,2 - 0,1
С18:0 0,2 0,5 0,2
С16:1 8,3 15,0 --
С18:1 1,9 0,7 -
С16:1 ю5е - - 0,1
С17:1 ю8е - - 0,1
С18:1 ю7е 11,2 10,0 8,3
С17:0 cyclo 1,0 2,8 1,1
С18:1 methyl ю7е - - 0,4
С10:0 3-OH - - 3,8
С12:0 2-OH 3,4 4,3 4,2
С12:0 3-OH 2,3 4,0 3,7
С12:1 3-OH - - 0,1
С16:1 ю7е + С15:1 iso 2-OH 29,2 24,6 40,4
С19:1 ю6е + С19:1 cyclo ю10е 1,1 — 0,2
Примечание:«—» — не обнаружено.
Таким образом, на основании сравнительного анализа нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и состава жирных кислот клеточной стенки, а также культурально-морфологических и физиолого-биохимических признаков штаммы АНТ 17 и АНТ 56 были идентифицированы как представители вида Pseudomonas laurentiana.
Характеристика новых PGP-штаммов
Антагонистическая активность. При изучении спектра антагонистической активности штаммов бактерий P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 было показано, что микроорганизмы подавляют развитие фитопатогенных грибов родов Bipolaris и Fusarium (табл. 2). Изучае-
мые штаммы бактерий проявляли избирательность в отношении данных микромицетов, диаметры зон ингибирования роста фитопатогенов значительно варьировали. При этом штаммы наиболее активно подавляли рост B. sorokiniana ИБ Г-12 и F. semitectum ВКМ 1938. Показатели антагонистической активности исследуемых штаммов сопоставимы с таковыми известных штаммов-антагонистов рода Рseudomonas [16, 17].
Таблица 2
Спектр антагонистической активности штаммов P. 1аигепйапа АНТ 17 и Р. laurentiana АНТ 56
Виды фитопатогенных грибов Диаметр зоны ингибирования роста гриба, мм
P. laurentiana P. laurentiana
АНТ 17 АНТ 56
Fusarium avenaceum ВКМ 132 7,0±1,1 7,0±0,9
F. culmorum ВКМ 844 12,0±1,6 17,0±1,9
F.gibbosum ВКМ 848 11,0±1,5 10,0±1,3
F. nivale ВКМ 3106 10,0±1,0 8,0±1,2
F. oxysporum ВКМ 137 10,0±1,4 6,0±0,8
F.semitectum ВКМ 1938 26,0±3,0 21,0±2,5
F. solani ВКМ 142 10,0±1,2 10,0±1,0
Bipolaris sorokiniana ИБ Г-12 26,0±2,8 30,0±3,3
Природа антигрибных метаболитов. Известно, что антагонизм микроорганизмов может быть связан с синтезом железотранспортирующих аген-тов-сидерофоров, конкурирующих с сидерофора-ми фитопатогенных микроорганизмов за необходимое для последних железо.
Было показано, что внесение железа в питательную среду не приводит к изменению антигрибной активности штаммов бактерий. Так, на среде Кинг Б с внесением РеС13 диаметр зоны подавления роста фитопатогена B. sorokiniana для штамма P. laurentiana АНТ 17 составил 26 мм, для штамма P. laurentiana АНТ 56 — 32 мм.
Таким образом, было установлено, что антагонистическая активность штаммов P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 не лимитируется присутствием железа в среде, т.е. и антигрибные свойства культур определяются синтезом не сиде-рофоров, а, вероятно, веществ антибиотической природы.
Синтез фитогормонов — одно из важнейших свойств бактерий, отнесенных к группе РОРЯ. У штаммов P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 была изучена способность к продуцированию фитогормонов — индолил-3-уксусной кислоты (ИУК) и цитокининоподобных веществ. Известно, что ИУК участвует в регуляции деления и роста клеток растяжением, дифференцировке корней и других процессах роста и развития растения [18, 19], в то время как цитокинины и цитоки-ниноподобные вещества индуцируют деление клеток и участвуют в поддержании апикальной меристемы побега [20].
Значимое количество иммунореактивных веществ было обнаружено в культуральной жидко-
сти штамма P. laurentiana АНТ 17. Данный микроорганизм обладал способностью к синтезу ИУК в количестве 804 нг/мл культуральной жидкости и не продуцировал цитокинины. Штамм бактерий P. laurentiana АНТ 56 синтезировал ИУК и цитокинины в количестве 166 и 68 нг/мл культураль-ной жидкости соответственно. Количество ИУК, накапливаемое в культуральной жидкости исследуемыми штаммами, превышало значения данного показателя для продуцента фитогормонов Pseudomonas koreensis ИБ-4 (ВКМ B-2830D), описанного нами ранее [21], для которого оно составляло 40 нг/мл культуральной жидкости. Однако штамм P. laurentiana АНТ 56 уступал ему в продукции цитокининов.
Фосфатмобилизирующая активность. Способность микроорганизмов к растворению органических и неорганических соединений фосфора в почве играет важную роль в питании растений. Синтез бактериями метаболитов в виде кислот и ферментов (фосфатаз) влияет на подвижность данного органогенного элемента и последующую его доступность для растений. При изучении способности к превращению соединений фосфора у штаммов P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 на питательных средах Пиковской и Муромцева было отмечено образование четких зон просветления, что свидетельствует о наличии мо-билизирующей активности данных бактерий в отношении неорганических фосфатов. Способности к расщеплению органических соединений фосфора при выращивании бактерий на среде, содержащей органический фосфор в виде аденозинтри-фосфата натрия, установлено не было.
Влияние на всхожесть растений. Во всех вариантах опыта было отмечено положительное влияние инокуляции бактериями семян сельскохозяйственных культур на их всхожесть по сравнению с контролем, что подтверждает наличие у изучаемых штаммов PGP-свойств. При этом наиболее «отзывчивыми» на предпосевную обработку оказались семена капусты и огурца — их всхожесть на четвертые сутки увеличилась в среднем на 7% и 9% соответственно по сравнению с контролем. Бактеризация штаммами микроорганизмов ускоряла процесс прорастания семян томатов: на вторые сутки их всхожесть превышала значения контроля на 7—9%, однако к четвертым суткам различия между контроль-
ным и опытными вариантами были статистически не значимы (при p < 0,05).
Эффективность против комплекса возбудителей корневых гнилей. Было показано, что в условиях естественной зараженности семян обработка штаммами бактерий P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 способствует снижению распространения грибов рода Alternaria на 38,3% и 50,6% соответственно и гельминтоспориозной корневой гнили, вызываемой B. sorokiniana, на 71,4% и 87,3% (табл. 3).
Используемый в качестве эталона биопрепарат «Ризоплан» демонстрировал высокую степень биологической эффективности по отношению к вызывающему корневые гнили пшеницы ми-кромицету B. sorokiniana (71,4%), но оказался малоэффективным против альтернариоза проростков. Это свидетельствует о том, что в случае естественного инфекционного фона показатели эффективности воздействия на фитопатогены у исследуемых штаммов были не ниже, чем у известных биологических препаратов.
При обработке биопрепаратом «Ризоплан» и жидкой культурой штамма P. laurentiana АНТ 17 количество непроросших семян было меньше, чем в контроле (табл. 3). При этом в варианте со штаммом P. laurentiana АНТ 56 достоверных различий с контролем по данному параметру не было выявлено.
Показатель, характеризующий долю ненормально развивающихся проростков при обработке бактериями, в том числе биопрепаратом «Ризо-план», был в 2—3 раза меньше, чем в контроле. Это свидетельствует о снижении поражения тканей растений пшеницы фитопатогенными микро-мицетами вследствие воздействия антигрибных метаболитов PGP-бактерий.
Таким образом, на основании анализа физио-лого-биохимических свойств, нуклеотидной последовательности гена 16S рРНК и состава жирных кислот клеточной стенки была установлена принадлежность штаммов бактерий АНТ 17 и АНТ 56 к виду Pseudomonas laurentiana.
Было показано, что штаммы P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 обладают целым рядом полезных для роста и развития растений свойств, характерных для PGP-микроорганизмов. В частности, они проявляют антигрибную активность в отношении большого количества фитопа-
Таблица 3
Эффективность применения штаммов P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 против семенной инфекции пшеницы
Вариант Непроросшие семена, % Ненормально развившиеся проростки,% Количество проростков пшеницы, пораженных болезнями, %
B. sorokiniana Alternaria sp.
Контроль 11,0±0,7* 18,0±0,9* 48,6±1,2* 12,6±0,8*
Биопрепарат «Ризоплан» 8,0±0,6* 8,6±1,2* 44,6±1,6* 3,6±0,2*
P. laurentiana АНТ 17 10,0±0,2* 6,6±0,5* 30,0±1,5* 2,0±0,1*
P. laurentiana АНТ 56 10,6±0,3 8,0±0,7* 24,0±1,1* 1,6±0,07*
Примечание: * — различия с контролем статистически значимы при p < 0,05.
тогенных микромицетов, способны к разложению неорганических фосфатов и синтезу фитогормо-нальных веществ. Протравливание семян огурца, томата и капусты жидкой культурой с титром ~105 КОЕ/мл оказывало благоприятное воздействие на всхожесть растений. Предпосевная обработка семян пшеницы в условиях естественного инфекционного фона инокулятом выделенных штаммов бактерий способствовала снижению распространения грибов, вызывающих корневые гнили. По совокупности полезных свойств штаммы P. laurentiana АНТ 17 и P. laurentiana АНТ 56 можно признать перспективными для дальнейше-
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Dignamab B.E., O'Callaghan M, Condron L.M., Raaijmakers J.M., Kowalchuk G.A., Wakelin S.A. Impacts of long-term plant residue management on soil organic matter quality, Pseudomonas community structure and disease suppressiveness // Soil Biol. Biochem. 2019. Vol. 135. P. 396-406.
2. Singh D., Ghosh P., Kumar J., Kumar A. Plant growth-promoting rhizobacteria (PGPRs): functions and benefits // Microbial interventions in agriculture and environment / Eds. D. Singh, G. Gupta, and R. Prabha. Singapore: Springer Nature, 2019. P. 205-227.
3. Fischer S, Príncipe A., Alvarez F. Fighting plant diseases through the application of Bacillus and Pseudomonas strains // Symbiotic endophytes: soil biology, vol. 37 / Ed. R. Aroca. Berlin: Springer Verlag, 2013. P. 165-193.
4. Wright M.H., Hanna J.G., Pica D.A., Tebo B.M. Pseudomonas laurentiana sp. nov., an Mn(III)-oxidizing bacterium isolated from the St. Lawrence Estuary // Phcog. Commn. 2018. Vol. 8. N 4. P. 153-157.
5. Deshmukh A.M. Handbook of media, stains and reagents in microbiology. New Delhi: PAMA Publication, 1997. 240 pp.
6. Gerhardt P. Manual of methods for general bacteriology. Washington: American Society of Microbiology, 1981. 524 pp.
7. Bergey's Manual of systematic bacteriology. The Proteobacteria, part B, the Gammaproteobacteria / Eds. D.J. Brenner, N.R. Krieg, and J.T. Staley. N.Y.: Springer, 2004. P. 323-379.
8. Lane D.J. 16S/23S rRNA sequencing // Nucleic acid techniques in bacterial systematic / Eds. E. Stackebrandt and M. Goodfellow. Chichester: John Wiley and Sons, Ltd., 1991. P. 115-177.
9. Yoon S.H., Ha S.M., Kwon S, Lim J., Kim Y, Seo H, Chan J. Introducing EzBioCloud: a taxonomically united database of 16S rRNA gene sequences and whole-genome assemblies // Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 2017. Vol. 67. N 5. P. 1613-1617.
10. Kumar S., Stecher G., Li M., Knyaz C., Tamura K. MEGA X: Molecular evolutionary genetics analysis across computing platforms // Mol. Biol. Evol. 2018. Vol. 35. N 6. P. 1547-1549.
11. Saitou N, Nei M. The neighbor-joining method: A new method for reconstructing phylogenetic trees // Mol. Biol. Evol. 1987. Vol. 4. N 4. P. 406-425.
го изучения с точки зрения применения в биотехнологии с целью повышения продуктивности агроэкосистем.
Исследование выполнено с использованием оборудования Регионального центра коллективного пользования «Агидель» в рамках госзадания УФИЦ РАН (№ 075-00326-19-00) по теме № АААА-А18-118022190100-9 на базе Уфимского Института биологии УФИЦ РАН. Работа осуществлена без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
12. Kimura M. A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences // J. Mol. Evol. 1980. Vol. 16. N 2. P. 111-120.
13. Sasser M. Identification of bacteria by gas chromatography of cellular fatty acids. Technical Note #101 // MIDI. Newark: MIDI Inc., 1990.
14. Kudoyarova G.R., Vysotskaya L.B., Arkhipova T.N., Kuzmina L.Yu, Galimsyanova N.F., Sidorova L.V., Gabbasova I.M., Melentiev A.I., Veselov S.Yu. Effect of auxin producing and phosphate solubilizing bacteria on mobility of soil phosphorus, growth rate, and P acquisition by wheat plants // Acta Physiol. Plant. 2017. Vol. 39. N 11: 253.
15. Chetverikov S.P., Loginov O.N. New metabolites of Azotobacter vinelandii exhibiting antifungal activity // Microbiol. 2009. Vol. 78. N 4. P. 428-432.
16. Yang M., Mavrodi D.V., Mavrodi O.V., Bonsall R.F., Parejko J.A., Paulitz T.C., Thomashow L.S., Yang H.-T., Weller D.W., Guo J.-H. Biological control of take-all by fluorescent Pseudomonas spp. from Chinese wheat fields // Phytopathology. 2011. Vol. 101. N 12. P. 1481-1491.
17. Zakharchenko N.S., Kochetkov V.V., Buryanov Y.I., Boronin A.M. Effect of rhizosphere bacteria Pseudomonas aureofaciens on the resistance of micropropagated plants to phytopathogens // Appl. Biochem. Microbiol. 2011. Vol. 47. N 7: 661.
18. Spaepen S., Vanderleyden J., Remans R. Indole-3-acetic acid in microbial and microorganism-plant signaling // FEMS Microbiol. Rev. 2007. Vol. 31. N 4. P. 425-448.
19. Francis I., Holsters M., Vereecke D. The Grampositive side of plant-microbe interactions // Environ. Microbiol. 2010. Vol. 12. N 1. P. 1-12.
20. Zhao Z., Andersen S.U., Ljung K., DolezalK., Miotk A., Schultheiss S.J., Lohmann J.U. Hormonal control of the shoot stem-cell niche // Nature. 2010. Vol. 465. N 7301. P. 1089-1092.
21. Rafikova G.F., Korshunova T.Yu., Minnebaev, L.F., Chetverikov, S.P., Loginov O.N. A new bacterial strain Pseudomonas koreensis IB-4, as a promising agent for plant pathogen biological control // Microbiology. 2016. Vol. 85. N 3. P. 333-341.
Поступила в редакцию 27.02.2020 г.
После доработки 17.08.2020 г.
Принята в печать 15.09.2020 г.
RESEARCH ARTICLE
New bacterial strains Рseudomonas laurentiana as promising agents for agrobiotechnology
G.F. Rafikova Е.У. Kuzina, T.Yu. Korshunova, O.N. Loginov
Ufa Institute of Biology, Ufa Federal Research Center, Russian Academy of Sciences, st. Prospect Oktyabrya 69, lit. E, Ufa, 450054, Russia *e-mail: rgf07@mail.ru
Bacterial strains ANT 17 and ANT 56 were isolated from activated sludge, antagonistic to plant pathogenic fungi Bipolaris sorokiniana. Physiological, biochemical, and culture morphological properties, analysis of the 16S rRNA gene sequence and composition of fatty acids of cell walls of strains AHT 17 and AHT 56 supported its classification within the species Pseudomonas laurentiana. It was shown that strains P. laurentiana AHT 17 and P. laurentiana AHT 56 possess a set of properties characteristic of PGP microorganisms: they exhibit antifungal activity against phytopathogenic micromycetes, are capable of decomposing phosphates and synthesizing phytohormonal substances. Inoculation of cucumber, tomato and cabbage seeds had a beneficial effect on their germination. Pre-sowing treatment of wheat seeds under the conditions of a natural infectious background with an inoculum of isolated bacterial strains contributed to a decrease in the spread of fungi that cause root rot. The possibility of using strains P. laurentiana and P. laurentiana AHT 56 in biotechnology in order to increase the productivity of agroecosystems. The ability to stimulate the growth and development of plants for strains of the P. laurentiana species was shown for the first time.
Keywords: Pseudomonas laurentiana, PGP-microorganisms, 16S rRNA gene, antifungal activity, indolylacetic acid, cytokinins
Сведения об авторах
Рафикова Гульназ Фаилевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологий Уфимского Института биологии УФИЦ РАН. Тел: 8-347-235-57-04; e-mail: rgf07@mail.ru; ORCID: https://orcid.org/0000-0001-7655-5588
Кузина Елена Витальевна — канд. биол. наук, ст. науч. сотр. лаборатории биотехнологий Уфимского Института биологии УФИЦ РАН. Тел: 8-347-235-57-04; e-mail: misshalen@mail.ru
Коршунова Татьяна Юрьевна — докт. биол. наук, вед. науч. сотр. лаборатории биотехнологий Уфимского Института биологии УФИЦ РАН. Тел: 8-347-235-57-04; e-mail: korshunovaty@mail.ru
Логинов Олег Николаевич — докт. биол. наук, глав. науч. сотр. лаборатории биотехнологий Уфимского Института биологии УФИЦ РАН. Тел: 8-347-235-57-04; e-mail: biolab316@yandex.ru
