CC BY
4
DOI: 10.24412/2074-5036-2023-4-53-60 УДК: 619:616.98:578.834.1:615.371:616-076
Ключевые слова: альфа-коронавирус, титр инфекционной активности вируса, вакцина против коронавирусной инфекции, тест-система
Keywords: alpha-coronavirus, titer of infectious activity of virus, vaccine against coronavirus infection, test system 'Малыгин М. П., 2Доронин М. И.
ТЕСТ-СИСТЕМА ОПОСРЕДОВАННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТИТРА ИНФЕКЦИОННОЙ АКТИВНОСТИ АЛЬФА-КОРОНАВИРУСА МЕТОДОМ ОТ-ПЦР-РВ В СЫРЬЕ ДЛЯ ИЗГОТОВЛЕНИЯ КУЛЬТУРАЛЬНЫХ ВАКЦИН
TEST SYSTEM FOR THE INDIRECT DETERMINATION OF THE TITER OF INFECTIOUS ACTIVITY OF ALPHA-CORONAVIRUS BY RV-RT-PCR IN RAW MATERIALS FOR THE MANUFACTURE OF CULTURE VACCINES
'Областное бюджетное учреждение здравоохранения
«Ивановский областной наркологический диспансер» Адрес: 153008, Россия, г. Иваново, ул. Постышева, д. 54/1.
Regional budgetary healthcare institution "Ivanovo Regional Narcological Dispensary".
Address: 153008, Russia, Ivanovo, Postysheva str., 54/1. 2ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец Federal Centre for Animal Health Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Малыгин М. П., заведующий отделением. E-mail: ivreg@doctor-malygin.ru
Malygin M. P., Head of the Department. E-mail: ivreg@doctor-malygin.ru Доронин М. И., д. б. н., вед. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru
Doronin M. I., Doctor of Biological Sciences, Leading Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru
Аннотация. В данной статье отражены сведения о разработке и применении тест-системы опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса на основе обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени в сырье для изготовления кульутраль-ных вакцин. На основе анализа аминокислотной последовательности матриксного белка возбудителя альфа-коронавирусной инфекции разработаны дизайны прямого праймера CCoV RICH-T-F, обратного прай-мера CCoV RlCH-T-R и флуоресцирующего зонда CCoV RICH-T-P для создания тест-системы. Сконструирован вектор назначения pJet1.2sfGFP-CCoV на основе плазмиды pJet1.2sfGFP и целевого участка кДНК альфа-коронавируса (фрагмент M-гена в позициях 26355...26453 п. н.) с применением технологии высокопро-цессивного клонирования Golden Gate и эндонуклеазы рестрикции BsaI класса II S. В результате трансфекции полученной плазмидой клеток чувствительной линии почки кошки Крэнделла Риса CRFK in vitro создан положительный контрольный образец. Зависимость между пороговым циклом амплификации и титром инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для вакцин представлена в виде логарифмической функции: lg TCCoV = -0,2998 х Ct + 10,491 с эффективностью реакции амплификации 99,43 % и достоверностью аппроксимации - 0,9991. Данные, полученные с помощью разработанной тест-системы, коррелировали с результатами метода титрования в культуре клеток на 99,2-100,0 % для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 98,9-99,2 % для 5,9-4,0 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 98,8-99,1 % для 3,9-1,6 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 97,5-99,1 % для 1,5-1,0 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 97,0-98,2% для 0,9-0,5 lg ТЦД50/см3 (n=96). Аналитическая чувствительность разработанной тест-системы составила не менее 0,5 lg ТЦД50/см3 с достоверностью результатов исследования не менее 97,0 %. В 95 %-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 99,12-100,00 %, диагностическая специфичность - 98,03-100 %, k-критерий - 1,000.
Summary. This article reflects information on the development and application of a test system for indirect determination of the titer of infectious activity of alpha-coronavirus based on RV RT PCR in raw materials for the manufacture of cultural vaccines. Based on the analysis of the amino acid sequence of the matrix protein of the causative agent of alpha-coronavirus infection, the forward primer CCoV RICH-T-F, the reverse primer CCoV RlCH-T-R and the fluorescent probe CCoV RICH-T-P were developed for the study. The pJetl.2sfGFP-CCoV destination vector was constructed based on the pJet1.2sfGFP plasmid, the target region of the alphacoronavirus cDNA (the M-RNA gene fragment at positions 26355-26453 nb) using the Golden Gate high-process cloning technology and BsaI class II S restriction endonuclease. Endell Rice CRFK in vitro generated a positive control sample with the resulting plasmid. The relationship between the threshold amplification cycle and the titer of infectious activity of alphacoronavirus in vaccine raw materials is presented as a logarithmic function: lg TCCoV =-0.2998 x Ct + 10.491 with an efficiency of the amplification reaction of99.43% and an approximation reliability of 0.9991. The data obtained using the developed test system correlated with the titration method in cell culture by 99.2-100.0 %
for 8.0-6.0 lg TCIDJcm3 (n=96), by 98.9-99.2 % for 5.9-4.0 lg TCIDJcm3 (n=96), by 98.8-99.1 % for 3.9-1.6 Ig TCIDJcm3 (n=96), by 97.5-99.1 % for 1.5-1.0 lg TCIDJcm3 (n=96), by 97.0-98.2 % for 0.9-0.5 lg TCIDJcm3 (n=96). The ana5ytical sensitivity of the developed test system was at least 0.5 lg TCID5(/cm3 with the reliability of the study results at least 97.0 %. In the 95 % confidence interval, the diagnostic sensitivity was 99.12-100.00 %, the diagnostic specificity was 98.03-100 %, the kappa was 1.000.
Введение
Коронавирусная инфекция представляет собой серьезную проблему, которой особенно с 2019 года уделяют огромное внимание международные медицинские организации и ветеринарные службы всех стран мира [24].
Возбудитель данной высококонтагиозной инфекционной болезни принадлежит виду Canine Coronavirus (CcoV), роду Alphacoronavirus, подсемейству Orthocoronavirinae, семейству Corona-viridae [10].
Нуклеиновая кислота инфекционного агента представлена одноцепочечной молекулой РНК положительной полярности и размером около 29400-29800 н.о. Около 65 % вирусной рибонуклеиновой кислоты занимают две большие, частично перекрывающиеся открытые рамки считывания (ORF): ORFla и ORFlb, которые кодируют два полипротеина. С 3'-конца 1/3 генома (примерно 9000 н. о.) состоит из других ORF, несущих информацию о структурных и неструктурных вирусных белках. Структурные протеины альфа-коронавируса включают S-, E-, M- и N-белки, кодируемые ORF2-, ORF4-, ORF5-и ОКР6-генами, соответственно [2, 13, 14, 17]. Схема картирования генома CCoV для ORF2-ОЯР6-генов представлена в таблице 1 c нулевым отсчетом нуклеотидов.
Пять основных генов кодируют следующие вирусные протеины: шипообразный белок
^-белок), мембранный гликопротеин (М-белок) [20], нуклеокапсид ^-белок), белок оболочки (Е-белок) и ОЯЛаЬ (репликаза / протеаза) [19, 21, 22]. М-белок — мембранный белок с тройным охватом — играет центральную роль в сборке и морфогенезе вирионов, а также определяет форму вирусной оболочки. Данный белок рассматривается как центральный организатор сборки вирусной частицы, взаимодействующий со всеми другими основными структурными белками коронавируса. для полного формирования вири-она. Взаимодействие спайкового S- и М-белков не требуется для процесса сборки. Однако связывание М- и ^белков стабилизирует нуклеокапсид (иммунный комплекс ^белок-РНК), а также внутреннее ядро вирионов и способствует завершению сборки вируса. Таким образом, мембранный белок и его взаимодействия с другими структурными белками необходимы для сборки полных вирусных частиц, содержащих одну молекулу РНК [25, 27].
Альфа-коронавирусная инфекция, как правило, вызывает сильную диарею, рвоту, обезвоживание, потерю аппетита и даже смерть. Выделение вируса с калом происходит в течение 6-9 дней после заражения [2].
Система мер борьбы с альфа-коронавирусной инфекцией и ее профилактики предусматривает иммунизацию животных, а также контроль уровня напряженности иммунитета. Для вакцинации
Таблица 1
Картирование генома альфа-коронавируса (CCoV)
Наименование гена Тип белка по предназначению Позиции в геноме, н. о.
5'-UTR нетранслируемая область 1...314
ORF1a неструктурный 315...12374
ORF1b неструктурный 12375.20370
S-белок (spike) спайковый белок 20371.24717
ORF3а неструктурный 24820.25035
ORF3b неструктурный 24980.25195
ORF3c неструктурный 25192.25926
ORF4 (E-ген (envelope)) оболочечный протеин 25913.26161
ORF5 (M-ген (matrix)) мембранный протеин 26171.26956
ORF6 (N-ген (nucleocapsid)) нуклеопротеин 26973.28121
ORF7a неструктурный 28126.28431
ORF7b неструктурный 28436.29077
Примечание: н. о. - нуклеотидные основания.
Примечание: объем вносимого элюата РНК (в том числе контроля мРНК) - 5 мкл, общий объем реакционной смеси - 25 мкл.
Таблица 2
Состав реакционной смеси для опосредованного определения титра инфекционной активности
альфа-коронавируса
№ п/п Наименование компонента смеси Концентрация компонента на 1 реакцию
1 Праймеры и зонд по 5 пМ
2 Дезоксирибонуклеозидтрифос фаты по 0,20 мМ каждого
3 Хлорид магния 3 мМ
4 Taq-буферный раствор Colorless Flexi (х 5) 20% от объема реакционной смеси
5 Tag ДНК-полимераза 1 е. а.
6 Деионизированная вода, свободная от нуклеаз довести объем до 20 мкл
животных применяют культуральные вакцины против альфа-коронавирусной инфекции [19, 22, 25]. При изготовлении вакцинных препаратов до процесса инактивации вируссодержащую суспензию исследуют на определение титра инфекционной активности возбудителя для оценки его активности в чувствительных клеточных линиях. В 1,0 см3 суспензии вируса определяют количество тканевых цитопатических доз, вызывающих 50 %-ное поражение клеток, что фактически отражает концентрацию вирионов, содержащих вирусную РНК, способную к репликации.
Для определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса, как правило, применяют метод титрования в монослойной перевиваемой клеточной линии почки кошки Крэнделла Риса CRFK (Crandell Feline Kidney), с помощью которой вычисляют минимальную дозу вируса, способную вызвать лизис 50 % клеток [2]. При этом данный метод имеет ряд следующих ограничений в применении: 1) методика титрования в клеточной линии предполагает учет результатов только спустя 72 ч; 2) определенная степень субъективности при оценке результатов анализа; 3) высокая стоимость одного исследования по причине использования в качестве биологической тест-системы клеточной линии; 4) вероятность риска контаминации культуры клеток другими инфекционными агентами, что снижает специфичность проводимого анализа [14].
В связи с этим целесообразно провести разработку альтернативной тест-системы определения титра инфекционной активности возбудителя ко-ронавирусного заболевания животных в сырье для изготовления культуральных вакцин.
Цель исследования заключалась в разработке и применении высокочувствительной и специфичной тест-системы опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса на основе обратной транс-
крипции и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ОТ-ПЦР-РВ) в сырье для производства культуральных вакцин.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали вакцинный штамм «РИЧ» альфа-коронавируса, который депонирован во Всероссийской государственной коллекции экзотических типов вируса ящура и других патогенов животных (ГКШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Выделение РНК осуществляли с помощью набора «РИБО-сорб» («Интерлабсервис», РФ) в соответствии с инструкцией производителя.
Обратная транскрипция. Реверсию РНК вируса проводили с применением набора для проведения обратной транскрипции с гексамерами (Applied Biosystems, США).
ПЦР в режиме реального времени. Реакцию амплификации в режиме реального времени проводили с применением стандартных реагентов, концентрации которых отражены в таблице 2.
Разработку высокоспецифических оригинальных олигонуклеотидных праймеров и зонда проводили в соответствии с требованиями, представленными в работах B. Deiman и R. Sooknanan [15].
Конструирование положительного контроля проводили с помощью метода высокопро-цессивного клонирования Golden Gate [9, 11], позволяющего создать мРНК, кодирующую целевой участок генома альфа-коронавируса. В качестве вектора встраивания применяли плаз-миду pJet1.2sfGFP с геном зеленого флуоресцирующего белка для трансфекции (рисунок 1), которую применяют для встраивания в нее тар-гетных участков генов между T7 promotor и HDV ribozyme. Для обработки плазмиды pJet1.2sf GFP и ампликонов использовали рестриктазу BsaI. Полученной плазмидой проводили трансфекцию компетентных клеток CRFK in vitro с помощью
Ala Су» Aip Glu
Set Thr Vil Тф Тут
Рис. 2. Анализ аминокислотной композиции М-белка альфа-коронавируса
Рис. 1. Схематическое изображение плазмиды pJet1.2sfGFP с сайтами рестрикции и указанием позиций T7 promoret и HDV ribozime
высокомолекулярного полиэтиленимина (ПЭИ-500) для синтеза в процессе экспрессии генов плазмиды участка мРНК альфа-коронавируса. Суспензию полученных клеток после трансфек-ции культивировали в течение 72 ч [7], подвергали центрифугированию и полученный супер-натант использовали в качестве положительного контроля для тест-системы.
Статистическая обработка данных. Для характеристики разработанной тест-системы рассчитывали следующие диагностические показатели: диагностическая чувствительность (DSe), диагностическая специфичность (DSp), k-критерий (индекс Каппа Коэна) в соответствии с общепринятыми методиками [1, 5, 26].
Рис. 3. Гидрофобный профиль аминокислотной последовательности матриксного белка альфа-коронавируса вакцинного штамма «РИЧ» по Kyte and Doolittle
2i35j 2Ш 2E31Û 2Ш> 2E3S0 2НОО 2«10 2Ш0 2É«û UM 2E45Û ититкнкттплтсгсктсятншнбксгсидоз^^ ылмкнкткпмскктеи
ÂCCKMCœiGCKôîKeîSÎJÎCSCiîî
:::т strain SICH Xoï RICH-Ï-Г "Oï MCS-7-?
исн-j-s Xal MCH-ï-a
Рис. 4. Дизайн олигонуклеотидного прямого праймера (CCoV RICH-T-F), флуоресцирующего зонда (CCoV RICH-T-P), обратного праймера (CCoV RICH-T-R), обратного праймера в формате RevComp (реверсивная и комплементарная) для амплификации участка M-гена кДНК альфа-коронавируса собак в позициях 26355.26453 п. н. Примечание: размер ампликона - 99 п. н.
Рис. 5. Процесс модифицирования плазмиды pJet1.2sfGFP для клонирования участка M-гена альфа-коронавируса. Примечание: А - концевые участки плазмиды и гена (слева), Б - концевые участки гена и плазмиды (справа), В - электрофореграмма химерной плазмиды после обработки рестриктазой BsaI, размер ампликона № 1 - 187 п. н., № 2 - 2503 п. н.
Результаты исследований и обсуждение
Анализ M-гена кДНК и матриксного белка альфа-коронавируса для разработки тест-системы опосредованного определения титра инфекционной активности вируса в сырье для изготовления культуральных вакцин.
В результате анализа полногеномной нукле-отидной последовательности кДНК альфа-ко-ронавируса производственного штамма «РИЧ» выявили, что для разработки дизайна олигону-клеотидных праймеров и зонда, применяемых в количественном исследовании в ОТ-ПЦР-РВ, целесообразно использовать M-ген, который кодирует матриксный белок, задействованный в различных процессах формирования вириона. Данный белок имеет наибольшее представительство среди всех белков вирусной частицы. М-ген занимает в кДНК позиции 26172...26957 п. н. и кодирует белок размером 262 а. о.
При анализе аминокислотной композиции M-белка CCoV вакцинного штамма «РИЧ» определили, что в составе полипептида преобладают лейцин (Leu) (11,1 %), а также серин (Ser) (8,8 %), изолейцин (Ile) (8,0 %), валин (Val) (7,7 %) и ала-нин (Ala) (7,2 %). В сумме они составили 42,8 % от всего аминокислотного состава. Минимальное содержание в данной последовательности у гисти-дина (Gis) (0,8 %) (рисунок 2). Следует отметить, что перечисленные аминокислоты, которые преобладали в композиции M-белка альфа-корона-вируса, являлись неполярными (гидрофобными) (валин, изолейцин, лейцин, аланин) и полярными незаряженными аминокислотами (глицин, серин).
Данный анализ позволил построить гидрофобный профиль по средним значениям показателя гидрофобности (в модификации Kyte and Doolittle [4]) (рисунок 3).
Как показано на рисунке 3, можно было выделить семь основных гидрофобных участков в линейной структуре матриксного белка альфа-коронавируса штамма «РИЧ». Данные области расположены в позициях 9.13, 55.65, 82.97, 115.133, 156.165, 170.187, 208.213 а. о. Гидрофильными являлись области в следующих позициях M-белка: 20.40, 75.77, 104.110, 135.150, 230.255 а.о. Данные участки определяли функциональность белковой молекулы, активно участвующей в формировании вириона.
При анализе нуклеотидных последовательностей для разработки дизайна олигонуклеотидных праймеров и зонда был выбран участок в диапазоне 26355.26453 п. н. При анализе подобранных последовательностей, отраженных на рисунке 4, было выявлено, что данные праймеры и зонд позволяли выявлять кДНК альфа-коронавируса про-
А Гссоу = -0,2998 X Ct + 10,491
■•а. R2 = 0,9991, Е = 99,4 3%
"JK..
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Пороговый цикл амплификации
Рис. 6. Зависимость титра инфекционной активности альфа-коронавируса штамма «РИЧ» в сырье для вакцин (TCCOV) и величины порогового цикла амплификации (Ct). Примечание: n=4, отмечены точки, отображающие средние значения пороговых циклов реакции амплификации
изводственного штамма «РИЧ» для проведения последующего количественного анализа. Экстраполируя данный участок на аминокислотную последовательность (61.94 а. о.), было определено, что амплифицируемый участок кДНК соответствовал фрагменту, обладающему и гидрофобными, и гидрофильными участками. Таким образом, проведен анализ аминокислотной последовательности матриксного белка исследуемого инфекционного агента, подобраны олигонуклеотидные праймеры и зонд для проведения опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса штамма «РИЧ» в сырье для изготовления культуральных вакцин.
Получение положительного контроля для опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для производства культуральных вакцин. В данной работе проводили исследования по конструированию плазмиды, содержащей целевой фрагмент нуклеиновой кислоты возбудителя альфа-коро-навирусной инфекции, с целью получения положительного контрольного образца для разработки указанной выше тест-системы с применением технологии высокопроцессивного клонирования методом Golden Gate [9, 11].
Для анализа использовали участок РНК аль-фа-коронавируса вакцинного штамма «РИЧ» в позициях 26355.26453 н. о. (участок РНК M-гена вируса:
AAUAUUGAUUGUUUUGUUAACUGUGUU ACAUUACGGUAGACCUCAACGCAGCUGGU UCGUGUAUGGCAUUAAAAUGCUUAUAAUG UGGCUAUUCUUGCCCGUU
или соответствующий участок кДНК: AATATTGATTGTTTTGTTAACTGTGTTACA TTACGGTAGACCTCAACGCAGCTGGTTCGT GTATGGCATTAAAATGCTTATAATGTGGCTAT TCTTGCCCGTT).
Для амплификации данного участка кДНК были выше разработаны олигонуклеотидные праймеры и зонд. На концы выбранной последовательности с помощью ПЦР «пришивали» адап-торные последовательности:
5 -конец: 5' GTA ШТ СТС AGCAT 3' и 3 -конец: 5' вТЛ ШТ СТС ТЛЛвв 3' (- сайты для разрезания ферментом Bsa I [3, 6, 8]).
Данные адаптеры были необходимы для формирования «липких» концов, образующихся после обработки рестриктазой II S. Данные ферменты вносили разрывы не в сайте рестрикции, а на некотором удалении от него, в частности, для рестриктазы Bsa I сайты рестрикции и разрезания следующие: GGTCTCNNNNN.
Адаптор, расположенный на 3'-конце, размещался с учетом геуегее-сотр1етеПе в направлении 5'^3'.
Для получения модифицированной последовательности проводили ПЦР с применением двух следующих праймеров (подчеркнуты участки для комплементарности с последовательностями плазмиды):
Б: 5- вТА ввТ СТС ЛОСАТ АСТввААСТТСАвСТввТСТАТ -3'
Я: 5- вТЛ ввТ СТС ТЛЛОО
В результате получили ампликоны, содержащие целевую область и адапторы: 5'0ТЛ00ТС ТСАОСТЛАСТООААСТТСАОСТООТСТАТАА ТАТТОЛТТОТТТТОТТААСТОТОТТАСАТТЛС ввТЛвЛССТСЛЛСвСЛвСТввТТСвТвТЛТв ОСАТТААААТОСТТЛТААТОТООСТЛТТСТТО СССОТТАТОСАТТЛААААТСОТААОАОССАЛ AACGGAATGAGACCTAC-3'. Полученные концевые участки нуклеотидов в целевой последовательности и плазмиде отражены на рисунке 5.
Провели гель-электрофорез для полученных продуктов ПЦР с последующим их выделением с помощью набора для экстракции ампликонов из агарозного геля.
Плазмиду pJet1.2sfGFP и продукты ПЦР обрабатывали рестриктазой BsaI, в результате этого формировались «липкие» 5' и 3'-концы. После соединения в одной пробирке всех компонентов (плазмида и модифицированный кодирующий фрагмент) происходило их лигирование по «липким» концам [3, 12, 16, 23].
С помощью программы №ВСийег для разрезания плазмид и линейных ДНК рестриктазами получили электрофореграмму с двумя фрагментами (размер фрагмента № 1 составляет 2503 п. н., № 2 - 187 п.н.), как отражено на рисунке 5 В.
Полученной плазмидой pJet1.2sfGFP-CCoV проводили трансфекцию компетентных клеток
линии CRFK in vitro и, как указано выше, получили супернатант, который использовали в качестве положительного контроля для разработанной тест-системы.
Выявление зависимости титра инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для вакцины и порогового цикла реакции амплификации в режиме реального времени.
Для выявления зависимости титра инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для вакцин и порогового цикла реакции амплификации подготавливали контрольную панель суспензий альфа-коронавируса собак штамма «РИЧ», в качестве которых использовали очищенные суспензии вируса указанного вакцинного штамма с титрами: 1,0; 2,0; 3,0; 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0 lg ТЦД50/см3. В качестве отрицательных контролей применяли суспензию клеток линии CRFK, не контаминированную вирусами, бактериями, микоплазмами и грибами. Выделение нуклеиновой кислоты, постановку обратной транскрипции и реакции амплификации проводили, как указано выше.
Результаты ПЦР в режиме реального времени анализировали, оценивая и сравнивая графики накопления флуоресцентного сигнала по значениям пороговых циклов амплификации Ct, определенных с помощью пересечения пороговой линии и логарифмическим отображением функции Fl = f (Ct). Устанавливали зависимость между пороговым циклом амплификации и титром инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для вакцин в процессе построения логарифмической функции. Полученные данные отражены на рисунке 6 и выражены в виде логарифмической функции: lg TCCoV = -0,2998 х Ct + 10,491.
Эффективность реакции амплификации составила 99,43 %, достоверность аппроксимации -0,9991, что является высоким показателем.
Применение разработанной тест-системы опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для изготовления вакцин.
Для анализа использовали 576 суспензий культурального альфа-коронавируса со значениями титра инфекционной активности от 0,00 до 8,00 lg ТЦД50/см3. В качестве контролей применяли образцы, представленные выше. Анализ проводили в трех повторностях в соответствии с методикой, отраженной выше. Для положительного контроля значение порогового цикла амплификации составило 15,00±0,01 (n=20), что соответствовало титру вируса, равному 5,99 lg ТЦД50/см3. При анализе в культуре клеток значение составляло 6,00 lg ТЦД50/см3. Таким
образом, получены сопоставимые значения. При использовании статистического t-критерия и степени свободы df = 19 нулевая гипотеза о равенстве полученных средних значений в двух выборках верна. Для отрицательных контролей экспоненциальные графики не были сформированы, что означало отсутствие альфа-коронави-руса в данных образцах.
Анализируемые пробы тестировали классическим методом титрования в монослойной перевиваемой клеточной линии CRFK и в ПЦР в режиме реального времени. Выявили, что данные, полученные с помощью разработанной тест-системы, коррелировали с методом титрования в культуре клеток на 99,2-100,0% для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 98,9-99,2 % для 5,9-4,0 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 98,8-99,1 % для 3,9-1,6 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 97,5-99,1 % для 1,5-1,0 lg ТЦД5500/см3 (n=96), на 97,0-98,2 % для 0,9-0,5 lg ТЦД5500/см3 (n=96), на 90,3-95,2 % для 0,0-0,4 lg ТЦД50/см3 (n=96). В отдельности каждую пробу исследовали в трех повторностях. Полученные результаты свидетельствовали о высокой степени точности разработанной тест-системы.
Опираясь на данное исследование выявили, что аналитическая чувствительность разработанной тест-системы составляла не менее 0,5 lg ТЦД50/см3 с достоверностью результатов исследования не менее 97,0 %.
При оценке специфичности данной тест-системы исследовали суспензии альфа-коронави-руса, вирусов ящура, бешенства, инфекционного некроза гемопоэтической ткани, инфекционного некроза поджелудочной железы. Титр инфекционной активности вирусов в суспензиях составлял не менее 6,0 lg ТЦД50/см3 или lg ККИД50/см3 (n=3). В результате проведения реакции амплификации в режиме реального времени с системой олигонуклеотидных праймеров и зондов, специфичной для участка M-гена альфа-корона-вируса, наблюдали построение логистических кривых накопления флуоресцентного сигнала только для альфа-коронавируса. Для проб, содержащих другие вирусы, не наблюдалось формирования графиков экспоненты, и они не выходили за пороговый уровень флуоресцентного сигнала (0,010 у. е.). Таким образом, разработанная тест-система была специфичной по отношению к возбудителю альфа-коронавирусной инфекции.
Для разработанной тест-системы анализировали стандартные диагностические показатели. Для определения диагностической чувствительности (DSe) исследовали 415 проб производственного сырья для изготовления вакцины против корона-вирусной инфекции, которые являлись заведомо
положительными. Уровень титра инфекционной активности вируса до инактивации находилась в диапазоне 0,5-8,0 lg ТЦД50/см3. Постановку реакции проводили, как отражено выше. С помощью разработанной тест-системы выявили, что из 415 образцов сывороток крови все определены в качестве положительных. Для исследования диагностической специфичности (DSp) тест-системы анализировали 185 отрицательных проб. В результате анализа обнаружили, что из 185 отрицательных проб - все определены в качестве отрицательных. Таким образом, в 95 %-ном доверительном интервале DSe составила 99,12-100,00 %, DSp - 98,03100,00 %, k-критерий - 1,000.
Заключение
Проведен анализ аминокислотной последовательности матриксного белка возбудителя альфа-коронавирусной инфекции вакцинного штамма «РИЧ», разработаны прямой CCoV RICH-T-F и обратный праймеры CCoV RICH-T-R и флуоресцирующий зонд CCoV RICH-T-P для проведения опосредованного определения титра инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для культуральных вакцин.
Сконструирован вектор назначения pJet1.2sfGFP-CCoV на основе плазмиды pJet1.2sfGFP, целевого участка кДНК альфа-ко-ронавируса (фрагмент M-гена РНК в позициях 26355.26453 н. о.) с применением технологии высокопроцессивного клонирования методом Golden Gate и эндонуклеазы рестрикции BsaI класса II S. С помощью реакции амплификации в режиме реального времени с применением модифицированных праймеров синтезированы ампликоны, содержащие требуемые адаптеры. Проведена рестрикция по сайтам узнавания с образованием «липких» концов с последующим простым лигированием. Осуществлен анализ полученного вектора ввода in silico с помощью рестриктазы BsmBI с получением ампликонов ожидаемых размеров: 187 и 2503 п. н. Осуществлена трансфекция клеток линии CRFK in vitro полученной плазмидой pJet1.2sfGFP-CCoV и получен положительный контрольный образец для создания тест-системы.
Установлена зависимость между пороговым циклом амплификации и титром инфекционной активности альфа-коронавируса в сырье для изготовления культуральных вакцин в виде логарифмической функции: lg TCCoV = -0,2998 х Ct + 10,491 с эффективностью реакции амплификации 99,43 % и достоверностью аппроксимации - 0,9991.
Выявлено, что данные, полученные с помощью разработанной тест-системы, кор-
релировали с методом титрования в культуре клеток на 99,2-100,0 % для 8,0-6,0 lg ТЦД50/см3 (n=96), на 98,9-99,2 % для 5,9-4,0 lg lg ТЦД50/см3 (n=96), на 98,8-99,1 % для 3,9-1,6 lg lg ТЦД50/см3 (n=96), на 97,5-99,1 % для 1,5-1,0 lg lg ТЦД50/см3 (n=96), на 97,0-98,2 % для 0,9-0,5 lg lg ТЦД50/см3 (n=96), на 90,3-95,2 % для 0,0-0,4 lg lg ТЦД50/см3 (n=96).
Определено, что аналитическая чувствительность разработанной тест-системы составляла не менее 0,5 lg ТЦД50/см3 с достоверностью результатов исследования не менее 97,0 %.
Доказано, что для разработанной тест-системы в 95 %-ном доверительном интервале диагностическая чувствительность составила 99,12-100,00 %, диагностическая специфичность - 98,03-100 %, k-критерий - 1,000.
Список литературы
1. Васильева Л. А. Статистические методы в биологии, медицине и сельском хозяйстве: учеб. пособие / Л. А. Васильева. Новосибирск: Институт цитологии и генетики СО РАН, 2007. 124 с.
2. Диагностика и профилактика инфекционных болезней кошек и собак: Руководство для практикующих ветеринарных врачей под редакцией Т.И. Алипера. Москва, 2017; 207-212.
3. Компания iGEM. Информация о разных последовательностях промоторов, терминаторов. // URL: http://parts. igem.org/Promoters/Catalog. (Дата обращения: 17.07.2023).
4. Модель Kyte and Doolittle для расчета средних значений гидрофобности и составления гидрофобного профиля аминокислотных последовательностей белков [Электронный ресурс] https://www.researchgate.net/figure/A-Kyte-Doolittle-Hydrophobicity-plot-of-the-RNase-k-02-protein-Regions-with-values_fig5_262071562. (Дата обращения: 15.04.2023).
5. СТБ ИСО 5725-2002. «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений». Части 1-6. -01.11.2002.
6. Ashwini M. Advances in Molecular Cloning / M. Ashwini, S. B. Murugan, S. Balamurugan // Mol Biol (Mosk). 2016 Jan-Feb. V. 50(1). P. 3-9.
7. Dalby B. Advanced transfection with Lipofectamine reagent: primary neurons, siRNA, and high-throughput applications / B. Dalby, S. Cates, A. Harris et al. // Methods. 2004. V. 33 (2). P. 95-103.
8. Dryden D. T. Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes / D. T. Dryden, N. E. Murray, D. N. Rao // Nucleic Acids Research. 2001. V.29 (18). P. 3728-41.
9. Engler C. Golden Gate cloning / C. Engler, S. Marillonnet // Methods Mol Biol. 2014. V. 1116. P. 119-131.
10. Enjuanes L. Coronaviridae. / L. Enjuanes, D. Brian, D. Cavanagh, K. Holmes, M. M. C. Lai, H. Laude, P. Masters, P. Rottier, S. Siddell, W. J. M. Spaan, F. Taguchi, P. Talbot // van Regenmortel M. H. V., Fauquet C. M., Bishop D. H. L., Carstens E. B., Estes M. K., Lemon S. M., Maniloff J., Mayo M. A., McGeoch D. J., Pringle C. R., Wickner R. B. (Eds.) Virus Taxonomy, Classification and Nomenclature of Viruses. Academic Press, New York. 2000. P. 835-849.
11. HamediRad M. Highly Efficient Single-Pot Scarless Golden Gate Assembly / M. HamediRad, S. Weisberg, R. Chao // ACS Synth Biol. 2019. V. 8(5). P. 1047-1054.
12. Lessard J. C. Molecular cloning. / J. C. Lessard // Methods Enzymol. 2013;529:85-98.
13. Licitra B. N. Canine enteric coronaviruses: emerging viral pathogens with distinct recombinant spike proteins. /
B. N. Licitra, G. E. Duhamel, G. R. Whittaker // Viruses. 2014 Aug 22;6(8):3363-76. doi: 10.3390/v6083363.
14. Naylor M. J. Identification of canine coronavirus strains from faeces by S gene nested PCR and molecular characterization of a new Australian isolate / M. J. Naylor, G. A. Harrison, R. P. Monckton, S. McOrist, P. R. Lehrbach, E. M. Deane // J. Clin. Microbiol. 2001. V. 39. P. 1036-1041.
15. N. von Ahsen. Oligonucleotide melting temperatures under pcr conditions: nearest-neighbor corrections for Mg2+, deoxynucleotide triphosphate, and dimethyl sulfoxide concentrations with comparison to alternative empirical formulas / N. von Ahsen, C. T. Wittwer, E. Schütz // Clinical Chemistry: journal. 2001. Vol. 47, no. 11. P. 1956-1961.
16. Ninfa J. P. Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology / J. P. Ninfa, D. P. Balou, M. Benore // Hoboken, N. J.: John Wiley & Sons. 2010. 341 p.
17. Ntafis V. Canine coronavirus, Greece. Molecular analysis and genetic diversity characterization. / V. Ntafis, V Mari, N. Decaro, M. Papanastassopoulou, D. Pardali, T. S. Rallis, T. Kanellos, C. Buonavoglia, E. Xylouri // Infect Genet Evol. 2013 Jun;16:129-36.
18. Nunes M. C. T-cell responses to SARS-CoV-2 in unexposed South African women. / M. S. Nunes, M. J. Johnson, G. Kwatra, A. Weinberg, S. A. Madhi // Gates Open Res. 2022 Jul 13;5:150. doi: 10.12688/gatesopenres.13373.2.
19. Pratelli A. Diagnosis of canine coronavirus infection using nested-PCR / A. Pratelli, D. Buonavoglia, V. Martella, M. Tempesta, A. Lavazza, C. Buonavoglia // J. Virol. Methods. 2000. V. 84. P. 91-94.
20. Pratelli A. Variation of the sequence in the gene encoding for transmembrane protein M of canine coronavirus (CCoV) / A. Pratelli, V. Martella, G. Elia, N. Decaro, A. Aliberti, D. Buonavoglia, M. Tempesta, C. Buonavoglia // Mol. Cell. Probes. 2001. V 15. P. 229-233.
21. Pratelli A. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs / A. Pratelli, A. Tinelli, N. Decaro, M. Camero, G. Elia, A. Gentile, C. Buonavoglia // J. Virol. Methods. 2002. V. 106. P. 209-213.
22. Pratelli A. PCR assay for the detection and the identification of atypical canine coronavirus in dogs / A. Pratelli, A. Tinelli, N. Decaro, M. Camero, G. Elia, A. Gentile, C. Buonavoglia // J. Virol. Methods. 2002. V. 106. P. 209-213.
23. Roberts R. J. REBASE-enzymes and genes for DNA restriction and modification / R. J. Roberts, T. Vincze, J. Posfai et al. // Nucleic Acids Research. 2007. V. 35 (Database issue): D269-70.
24. Tortorici M. A. Structure, receptor recognition, and antigenicity of the human coronavirus CCoV-HuPn-2018 spike glycoprotein. / M. A. Tortorici, A. C. Walls, A. Joshi, Y. J. Park, R. T. Eguia, M. C. Miranda, E. Kepl, A. Dosey, T. Stevens-Ayers, M. J. Boeckh, A. Telenti, A. Lanzavecchia, N. P. King, D. Corti, J. D. Bloom, D. Veesler // Cell. 2022 Jun 23;185(13):2279-2291.e17.
25. Takano T. Prevalence of canine coronavirus (CCoV) in dog in Japan: detection of CCoV RNA and retrospective serological analysis. / T. Takano, S. Yamashita, M. Murata-Ohkubo, K. Satoh, T. Doki, T. Hohdatsu // J Vet Med Sci. 2016 Feb;78(2):341-5.
26. Vallat B. OIE Quality Standard and Guidelines for Veterinary Laboratories: Infectious Diseases. / B. Vallat. 2nd ed. Paris, France, 2008. 67 p.
27. Vlasova A. N. Novel Canine Coronavirus Isolated from a Hospitalized Patient With Pneumonia in East Malaysia. / A. N. Vlasova, A. Diaz, D. Damtie, L. Xiu, T. H. Toh, J. S. Lee, L. J. Saif, G. C. Gray // Clin Infect Dis. 2022 Feb 11;74(3):446-454.
Исследование выполнено в рамках совместного научного исследования на базах областного бюджетного учреждения здравоохранения «Ивановский областной наркологический диспансер» и ФГБУ «ВНИИЗЖ». Исследование выполнено без использования животных и без привлечения людей в качестве испытуемых. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
