CC BY
64
DOI 10.24412/2074-5036-2021-4-13-20 УДК 619:578.835.2:615.371.004.12:616-076
Ключевые слова: вектор назначения, плазмида, вирус ящура, вирус бешенства, Golgen Gate-технология
Keywords: destination vector, plasmid, FMD virus, rabies virus, Golgen Gate-technology
Доронин М. И., Михалишин Д. В., Гочмурадов Ы. М., Мудрак Н. С., Перевозчикова Н. А.
КОНСТРУИРОВАНИЕ ПЛАЗМИДЫ С ПОМОЩЬЮ ТЕХНОЛОГИИ GOLDEN GATE ДЛЯ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ИССЛЕДОВАНИЯ СУСПЕНЗИЙ ВИРУСА ЯЩУРА И БЕШЕНСТВА
PLASMID CONSTRUCTION USING GOLDEN GATE TECHNOLOGY FOR QUANTITATIVE STUDY OF FOOT-AND-MOUTH DISEASE AND RABIES VIRUS SUSPENSIONS
ФГБУ «Федеральный центр охраны здоровья животных» Адрес: 600901, Россия, г. Владимир, мкр. Юрьевец
Federal Centre for Animal Health, Federal Governmental Budgetary Institution Address: 600901, Russia, Vladimir, Yur 'evets
Доронин М. И., к.б.н., вед. науч. сотрудник. E-mail: doronin@arriah.ru
Doronin M. I., PhD in Biological Science, Leading Researcher. E-mail: doronin@arriah.ru. Михалишин Д. В., доктор ветеринарных наук, зав. лабораторией.
E-mail: mihalishindv@arriah.ru Michalishin D. V., Doctor of Veterinary Sciences, Head of the Laboratory. E-mail: mihalishindv@arriah.ru.
Гочмурадов Ы. М., аспирант. E-mail: gochmuradov@arriah.ru Gochmuradov Y. M., Post-Graduate Student. E-mail: gochmuradov @arriah.ru.
Мудрак Н. С., доктор биологических наук, главный научный сотрудник. E-mail: mudrak@arriah.ru
Mudrak N. S., Doctor of Biological Sciences, Chief Researcher. E-mail: mudrak@arriah.ru. Перевозчикова Н. А., доктор биологических наук, профессор. E-mail: perevozchikova@arriah.ru Perevozchikova N. A., Doctor of Biological Sciences, Professor. E-mail: perevozchikova @arriah.ru
Аннотация. В последние годы для достижения высоких результатов в области молекулярной биологии и генетики стали применять методы высокопроцессивного клонирования. Данная группа методов позволяет стандартизировать процесс встраивания таргетных участков ДНК в плазмиду, проводить одновременное клонирование сразу нескольких генов, «сшивать» два участка ДНК без посторонних нуклеотидных остатков («шрамов»), увеличивать скорость молекулярного клонирования. В данной статье рассмотрены основные моменты, касающиеся получения плазмиды с помощью технологии Golgen Gate. Сконструирован вектор назначения на основе плазмиды pAGM 1251, таргетных участков ДНК вируса ящура (3Б-ген - 7932...8088 п.н.) и вируса бешенства (G-ген - 4186.4279 п.н.) с применением эндонуклеазы рестрикции класса II S - BsaI. В ПЦР с применением модифицированных праймеров получены ампликоны, содержащие требуемые адапторы. Проведена рестрикция по сайтам узнавания с формированием «липких» концов с последующим простым лигированием по принципу комплементарности. Проведен анализ полученного вектора ввода in silico с помощью рестриктазы Hae II. Для тест-систем по определению титра инфекционной активности вируса ящура и бешенства определена высокая диагностическая чувствительность и специфичность, k-критерий (индекс Каппа Коэна), прогностичность положительного результата, прогностичность отрицательного результата, диагностическая точность. Summary. In recent years, methods of highly processive cloning have been used to achieve high results in the field of molecular biology and genetics. This group ofmethods makes it possible to standartize the process of embedding targeted DNA sections into a plasmid, to carry out simultaneous cloning of several genes at once, to "stitch" two DNA sections without extraneous nucleotide residues ("scars"), to increase the speed of molecular cloning. This article discusses the main points concerning the production of plasmids using Golgen Gate technology. A destination vector was constructed based on the pAGM 1251 plasmid, targeted DNA sites of FMD virus (3D-gene - 7932...8088 bp) and rabies virus (G-gene - 4186...4279 bp) using restriction endonuclease class II S - BsaI. Amplicons containing the required adapters were obtained in PCR using modified primers. Restriction was carried out on recognition sites with the formation of "sticky" ends, followed by simple ligation on the principle of complementarity. The obtained in silico input vector was analyzed using Hae II restrictase. For test systems to determine the titer of infectious activity offoot-and-mouth disease and rabies virus, high diagnostic sensitivity and specificity, k-criterion (Kappa Cohen index), prognosticality of a positive result, prognosticality of a negative result, diagnostic accuracy were determined.
Введение
В настоящее время в области синтетической биологии и биотехнологии произошла революция за счет создания организмов с новыми генотипами, полезными для медицины, сельского хозяйства и промышленности. Однако ограничивающим фактором является способность современных методов собирать сложные молекулы ДНК, кодирующие множество генетических элементов в различных предопределенных расположениях.
В основе молекулярного клонирования лежат подходы, позволяющие применять комплексы рестриктаз и лигаз с заданными свойствами. В природе у бактериальных клеток имеются эндонуклеазы рестрикции (рестриктазы), необходимые для разрезания молекул ДНК, встраивания участков чужеродных нуклеиновых кислот внутрь собственной и, тем самым, для приобретения новых биологических свойств [2]. Рестрик-тазы узнают специфический участок нукле-отидной последовательности, называемый сайтом рестрикции. Известно около 4000 рестриктаз, а сайтов рестрикции при этом не более 300 [3]. Это объясняется тем, что у некоторых эндонуклеаз рестрикции совпадают сайты узнавания рестриктаз. Сведения о сайтах рестрикции можно узнать с помощью ресурса Rebase [12]. Бактериальные клетки имеют данные ферменты, однако их собственная кольцевая ДНК защищена от ненужных постоянных разрезаний благодаря работе метилтрансфераз, которые могут находиться в бактерии в разном количестве и формировать между собой функциональные комплексы. Иногда в составе одной сложной белковой молекулы могут одновременно находится рестриктаза и метилтрансфераза [7].
Рестрикция может происходить в пределах сайта узнавания (например, для AluI -AGCT) или на расстоянии от него с одной или двух сторон (например, для BcoDI -GTCTCNNNNN). Наиболее часто в лабораторной практике применяют рестриктазы класса II. Они делятся на подклассы: A, B, C, D, E, F, G, H, P, S, T [5]. Преимущественно используют рестриктазы подкласса P (палиндром), то есть имеющие сайт узнавания, который одинаково читается в обоих направле-
ниях, например, GAATTC. Следует отметить, что рестриктазы могут разрезать молекулы ДНК с образованием «тупых» (например, для BsrBI - CCGCTC) или «липких» концов (например, для BspHI - TCATGA). Последние часто применяются в молекулярном клонировании для «сшивания» двух участков ДНК по принципу комплементарности. Рестриктазы, формирующие «липкие» концы, получили название изокаудомеров [10]. Также следует отметить одну особенность сайтов рестрикции, а именно, чем они короче, тем чаще встречаются в молекуле ДНК и, следовательно, такая рестриктаза сможет разрезать молекулу нуклеиновой кислоты на большее количество фрагментов.
Лигирование участков ДНК - процесс их «сшивания», который происходит по принципу комплементарности в отсутствие специальных ферментов (если выступающие концы небольшой длины) и с помощью ДНК-лигаз (при наличии «липких» концов с большей длиной). В лабораторной практике наиболее часто применяют лигазу бактериофага Т4 [8, 11].
При решении задачи встраивания участка молекулы ДНК в кольцевую ДНК требуется разрезать линейную ДНК в двух местах по двум разным сайтам рестрикции, такую же процедуру провести с кольцевой ДНК, после чего можно направленно встраивать интересующий (таргетный) участок нуклеиновой кислоты в кольцевую ДНК [3].
Плазмида - экстрахромосомная молекула ДНК, способная к автономной репликации. По своей форме они делятся на линейные и кольцевые и имеют размеры от 1000 п.н. и выше. Плазмиды легко выделяют из бактериальных клеток или синтезируют в лабораторных условиях генно-инженерным способом. Для любой плазмиды характерно наличие точки репликации, или участка инициации репликации (ori - origin of replicate). В состав ДНК обязательно должны входить сайты узнавания для рестриктаз, а также механизмы контроля репликации, от состава которых зависит копийность плазмид. Малокопий-ные плазмиды могут накапливать от 1 до 20 копий, а высококопийные - до 1000 [6, 10]. Для конструирования плазмид, используемых
в качестве контроля для количественной поли-меразной цепной реакции (ПЦР), рационально использовать высококопийные плазмиды.
В последние годы для достижения высоких результатов в области молекулярной биологии и генетики стали применять методы высокопроцессивного клонирования. Данная группа методов позволяет стандартизировать процесс встраивания таргетных участков ДНК в плазмиду, проводить одновременное клонирование сразу нескольких генов, «сшивать» два участка ДНК без посторонних нуклеотидных остатков («шрамов»), увеличивать скорость молекулярного клонирования. В настоящее время существуют различные технологии в данной области, в частности, стандарт biobricks, Golden Gate и Golden Braid, клонирование за счет создания однонитевых выступающих концов с помощью SLIC (Sequence and Ligation Independent Cloning) или изотермической сборки Гибсона, рекомбинационное клонирование и др. [2, 3, 11, 12]. В данной статье рассмотрим основные моменты, которые касаются технологии Golgen Gate. При рассмотрении данного подхода применяют такое понятие, как вектор назначения (destination vector), представляющий собой плазмиду, в которую переносят таргетные участки ДНК. Чаще всего, их переклонируют из вектора ввода, либо используют отдельные подготовленные фрагменты ДНК, которые требуется встроить в вектор назначения. В данной технологии применяют особые рестриктазы класса II подкласса S, которые вносят разрывы в ДНК не в сайте узнавания, а на расстоянии от него (например, Bsa I, Bpi I) и формируют «липкие» концы [12]. На первом этапе исследователь проводит ПЦР с модифицированными праймерами для добавления к ампликонам специальных адапторов, которые представляют собой сайты узнавания рестриктазы класса II S. Причем адапторы «пришивают» на 5-конец в прямом направлении (5'^3'), а на 3'-конец в модификации reverse-complemente. На втором этапе проводят обработку ДНК и вектора назначения выбранной рестриктазой, на третьем - лиги-рование, на четвертом - определение собранности полученного вектора. Преимущество
Pcil «1111
BsaXI tael »Drain pfim
ECO0109I
JBsmFI »BtgZI
Bgll »NgoMIV •Nael »BssHI I Dpol
tBsafil »SnaBI
Рис. 1. Карта плазмиды pAGM 1251 с сайтами рестрикции
данной технологии заключается в простоте, быстроте, а также определенной направленности проведения встраивания таргетных фрагментов ДНК.
В последние годы стали широко применять методы молекулярно-биологического анализа, в частности, ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) для количественного анализа вирусной нагрузки в суспензии. Так, разрабатываются методы ПЦР-РВ для определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства в сырье для изготовления противоящурных и антираби-ческих вакцин (патенты РФ № 2 674 076 и № 2 755 925). При проведении анализа в таком случае желательно использовать постоянный охарактеризованный положительный контрольный образец, в качестве которого ученые советуют применять плазмиды.
Цель исследования заключалась в разработке с помощью технологии высокомолекулярного клонирования Golden Gate универсальной плазмиды, которую возможно применять для определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства.
Материалы и методы
Вирус. В работе использовали классический вирус бешенства штамма ВНИИЗЖ и вирус ящура штамма Азия-1/Таджикистан/2011, которые являются производственными
и депонированы в Коллекции штаммов микроорганизмов (КШМ) ФГБУ «ВНИИЗЖ».
Выделение РНК осуществляли с применением магнитных частиц оксида железа (II, III) диаметром 300-320 нм в присутствии 4 М раствора гуанидинизотиоцаната (ГТЦ) последующим отмыванием частиц сорбента с помощью 40 и 70 % изопропанола.
Обратная транскрипция. Получение кДНК вирусов ящура и бешенства проводили с применением набора для проведения реверсии с гексамерами (Applied Biosystems).
ПЦР Реакцию амплификации для таргет-ных участков кДНК вирусов ящура и бешенства проводили в соответствии с требованиями Руководства МЭБ (OIE) [5, 9].
Выделение продуктов ПЦР из агарозно-го геля. Экстракцию ампликнов из 1 %-ного агарозного геля проводили с применением коммерческого набора реагентов Ахургер DNA Gel Extraction.
Вектор назначения. В качестве вектора встраивания применяли плазмиду pAGM 1251 (размер 2240 п.н.).
Рестрикция. Разрезание фрагментов ДНК и кольцевой плазмиды проводили с помощью рестриктазы класса II подкласса S (изо-каудомер) Bsa I со следующими сайтами рестрикции и разрезания: GGTCTCNNNNN.
Лигирование. Процесс соединения фрагментов по «липким» концам проводили при смешивании в одной пробирке трех составляющих: фрагмент 1 (участок ДНК вируса ящура), фрагмент 2 (участок ДНК вируса бешенства), вектор назначения (разрезанный в виде линейной молекулы).
Гель-электрофорез. Для подтверждения факта правильной сборки плазмиды проводили ее рестрикцию с помощью фермента Hae II с сайтом рестрикции: RGCGCY. Проводили электрофорез в 1 %-ном агарозном геле in silico в программе NEB Cutter. Ожидаемые размеры фрагментов следующие: 828, 722, 430, 370, 149 п.н.
Статистическая обработка данных. Определяли следующие диагностические показатели исследуемых тест-систем: диагностическая чувствительность (DSe), диагностическая специфичность (DSp), k-критерий (индекс Каппа Коэна), прогностичность по-
ложительного результата (PPV), прогностич-ность отрицательного результата (NPV), диагностическая точность (DAc) в соответствии с общепринятыми методиками [1].
Результаты исследований и обсуждение
На первом этапе исследования проводили исследования по конструированию плазмид, содержащих различные таргет-ные участки, на примере ДНК вирусов ящура и бешенства с целью получения контрольного универсального образца для определения титра их инфекционной активности в вирусосодержащих суспензиях, применяемых для изготовления противо-ящурных и антирабических вакцин. Для разработки плазмиды использовали метод высокопроцессивного клонирования Golden Gate. В работе применяли вектор назначения pAGM1251, впервые полученный С. Мариллонне. Данная плазмида является производной pUC19, функционирует в бактериальных клетках и обладает резистентностью к стрептомицину. pAGM1251 содержит маркерный ген LacZa, кодирующий фермент Р-галактозидазу, которая расщепляет дисахарид лактозу на глюкозу и галактозу. Имеющийся вектор предназначен для встраивания таргетных линейных участков ДНК.
Проводили исследования по конструированию двух модифицированных участков ДНК: один с таргетным участком ДНК вируса ящура, другой с требуемым участком ДНК вируса бешенства. Первая кодирующая последовательность ДНК представляет собой участок ДНК вируса ящура в области 3D-гена (7932...8088 п.н.) [4], на концы которой с помощью ПЦР «пришивали» адап-торные последовательности:
5 -конец: 5' GTA GGT CTC AAT GC 3'
3-конец: 5' GTA GGT CTC TCA TA 3'
Данные адапторы были необходимы для формирования «липких» концов, образующихся после обработки рестриктазой II S. Данные ферменты вносят разрывы не в сайте рестрикции, а на некотором удалении от него, в частности, для рестриктазы BsaI сайты рестрикции и разрезания следующие: GGTCTCNNNNN.
PAGM1251
Рис. 2. «Липкие» концы в составе плазмиды pAGM 1251 (А - нуклеотидная последовательность, Б - плазмида)
__А Б
и.ш.чили iiUM \ Break
♦ 1 G..S..G..R..A..P..N..T..Q..T..A..S..P..R..A..L..A..D..S..L..I..T..L..Y..A..L..C..T..P..W..D..H..T..G..E..V..D..L..R..G..R..T..R.
♦ 2 .E..A..E..E..R..P..I..R..K..P..P..L..P..A..R..W..P..I..H..*..S..L..C..M..P..F..A..R..R..G..T..I..Q..E..K..L..I..S..V..A..G..L..i
♦3 ..K..R..K..S..A..Q..Y..A..N..R..L..S..P..R..V..G..R..F..I..N..H..S..V..C..P..L..H..A..V..G..P..Y..R..R..S..*..S..P..W..Q..D..S. J
... 5' iAW^ШMrtt\ rfrMcfcb и m frM-¿Л^.Ы^ХгЦЛ-к А iWA i<k ¿«ta-t ftftW.frfrf;!^ M
... 3' ЧАНЛЛЛЛЫАЫгЫЛЛЛШftttWJifr*^шПЛ.T*Wi frflW
-1 . . S. . A. . S. . S. . R. . G. . I. . R. . L. . G. . G. . R. . G. . A. . R. .Q. . G. . I. . ». . ». . D. . S. .Q. . I. . G. . K. . A. . R. . R. . P. . V. .M. .C. . S. . F. . N. . I. . E. .T. . A. . P. . S. . .. .
•2----L. . P. . L. . A. .G. . L. . V. .С. . V. . A. . E. .G. .R. . A. .N. . A. . S. . E. . N. . I. . V. . R. . Y. . A. . R. .Q. . V. .G. . H. . S. .W. . V. . P. . S. .T. . S. . R. . R. . P. . L. .V. . R || (.«¡И ¿4U1 Dp
-3 ...F..R..F..L..A..W..Y..A..F..R..R..E..G..R..T..P..R..N..M..U..-..E..T..H..G..K..C..A..T..P..G..Y..L..L..L..Q..O..G..H..C..S..E.
Bsal-HFv2 digestion
Bsal-HFv2 digestion
PAGM1251
Рис. 3. Демонстрация липких концов и результатов лигирования двух фрагментов: плазмиды и участка ДНК вируса ящура (3Э-ген) (А - нуклеотидная последовательность, Б - собранная плазмида)
Рис. 4. Демонстрация липких концов и результатов лигирования участка ДНК вируса ящура (3D-ген - желтый цвет) и участка ДНК вируса бешенства. ^-ген - синий цвет), участка ДНК вируса бешенства ^-ген) и плазмиды (А - нуклеотидная последовательность, Б - собранная плазмида)
Адаптор, расположенный на 3'-конце, записывается с учетом reverse-complemente в направлении 5'^3'.
Для получения первой модифицированной последовательности проводили ПЦР с применением двух следующих праймеров:
F: 5- GTA GGT СТС ААТ GC CCTTTGCACGCCGTGGGACCA-3'
R: 5- GTA GGT СТС TCA TA GCGTTCACCCAACGCAGGTA-3'
В результате получили ампликоны, содержащие таргетную область 1 и адапторы:
5'GTAGGTCTCAATGCCCTTTGCACGC CGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCT CCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGG ACCTGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAG CCTTTCCAGGGCCTCTTTGAGATTCCAA GCTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGT GAACGCTATGAGAGACCTAC -3'
Получали вторую последовательность, содержащую следующие адапторы:
пагкег иппе^. СрБ
юооо -
5000 -
1000
500
100
Рис. 5. Результаты гель-электрофореза после разрезания сконструированной плазмиды рестриктазой Hae II (маркер - 1 kb Plus DNA Ladder)
5'-конец: 5'GTA GGT CTC ATA TG 3' 3'-конец: 5'GTA GGT CTC TTT AC 3' и кодирующую последовательность ДНК G-гена вируса бешенства (4186...4279). Для синтеза данного фрагмента проводили ПЦР с применением следующих праймеров:
F: 5- GTA GGT CTC ATA TG GTTGTAGAGGAGTTGGTCAA -3'
R: 5'- GTA GGT CTC TTT AC GACTGAGACGTCTGAAACTTA -3'
Получали кодирующую последовательность 2 со своими адапторами:
5' GTA GGT CTC ATA TG GTTGTAGAGGAGTTGGTCAAGAAACG ACCCGAGTGTCTGGATGCACTAGAGTCCA ACATGACCACCAAAACAGTAAGTTTCAG ACGTCTCAGTC GTA GGT CTC TTT AC 3'
Проводили электрофорез для полученных продуктов ПЦР с последующим их выделением с помощью набора для экстракции ам-пликонов из агарозного геля.
Плазмиду pAGM 1251 и продукты ПЦР обрабатывали рестриктазой BsaI, в результате этого формировались «липкие» 5' и 3'-концы. После соединения в одной пробирке всех компонентов (плазмида и два модифицированных кодирующих фрагмента) происходило их лигирование по «липким» концам (рисунки 2, 3, 4).
Для подтверждения факта сборки готовой плазмиды проводили гель-электрофорез с помощью рестриктазы Hae II с сайтом рестрикции: RGCGCY. Результаты электрофореза в 1 %-ном агарозном геле in silico представлены на рисунке 5, из которого видно, что получены 5 фрагментов: 828 п.н. (2187515 п.н.), 722 п.н. (1095-1816 п.н.), 430 п.н. (516-945 п.н.), 370 п.н. (1817-2186 п.н.), 149 (946-1094 п.н.). Полученные фрагменты были ожидаемого размера, что подтверждало правильность собранной конструкции. С полученной плазмидой проводили количественный анализ для суспензий вируса ящура и бешенства.
На заключительном этапе работы проводили ПЦР-РВ для определения титра инфекционной активности вирусов ящура и бешенства с помощью ранее разработанных методик и с применением предложенной плазмиды. Определили диагностические по-
казатели для обеих методик. Для определения чувствительности тест-системы по определению титра вируса ящура исследовали 314 образцов суспензий, которые являлись заведомо положительными по данным исследования культуральным методом. Титр инфекционной активности в данных пробах находился в диапазоне 1,25-8,25 ^ ТЦД50/ мл. При интерпретации результатов исследования положительными считали пробы, которые содержат вирус ящура и вызывают поражение клеток линии ВНК-21 по данным культурального метода, отрицательными -пробы, в которых вирус ящура отсутствует и не вызывает цитопатического действия (ЦПД) в чувствительной клеточной линии. В результате в ОТ-ПЦР-РВ определили, что из 314 истинно положительных образцов суспензий 313 определены в качестве положительных, а 1 - в качестве отрицательной (титр составлял 1,25 ^ ТЦД50/мл). Для исследования специфичности метода тестировали 120 образцов суспензий клеточной линии ВНК-21, которые не были заражены вирусом ящура. В результате исследования в ОТ-ПЦР-РВ определили, что из 120 истинно отрицательных суспензий 120 определены в качестве отрицательных.
Пользуясь общеизвестными статистическими методами анализа определили, что диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,68 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 98,24-99,99 %), диагностическая специфичность (DSp) - 100 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 96,97-100,0 %), к-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,994, прогностичность положительного результата (РРУ) - 100 %, прогностичность отрицательного результата (КРУ) - 99,17 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 94,43-99,88 %), диагностическая точность (DAc) - 99,77 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 98,7399,99 %).
Аналогично исследовали диагностические характеристики тест-системы для определения титра инфекционной активности вируса бешенства в ОТ-ПЦР-РВ с применением разработанного положительного контрольного образца. Для определения чувствительности анализировали 245
положительных образцов с титрами вируса бешенства 1,25-8,25 lg ККИД50/мл. Для исследования специфичности - 110 суспензий клеточной линии ВНК-21, не зараженной вирусом бешенства. В результате ОТ-ПЦР-РВ выявили, что из 245 положительных проб 244 идентифицированы как положительные, 1 - в качестве отрицательной (титр инфекци-онности 1,25 lg ККИД50/мл). Из 110 отрицательных суспензий все были подтверждены как отрицательные. Исходя из этих данных определены диагностические показатели данной тест-системы с разработанным в данной статье положительным контролем: диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,59 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 97,76-99,99 %), диагностическая специфичность (DSp) - 100 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 96,70-100,0 %), k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,993, прогностичность положительного результата (PPV) - 100 %, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,10 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 93,96-99,87 %), диагностическая точность (DAc) - 99,72 % (в 95 %-ном доверительном интервале: 98,4499,99 %).
Заключение
Сконструирован вектор назначения на основе плазмиды pAGM 1251, таргетных участков ДНК вируса ящура pD-ген - 7932.. .8088 п.н.) и вируса бешенства (G-ген -4186.4279 п.н.) с применением технологии высокопро-цессивного клонирования Golden Gate и эн-донуклеазы рестрикции класса II S - BsaI. В ПЦР с применением модифицированных праймеров получены ампликоны, содержащие требуемые адапторы. Проведена рестрикция по сайтам узнавания с формированием «липких» концов с последующим простым лигированием по принципу ком-плементарности.
Проведен анализ полученного вектора ввода in silico с помощью рестриктазы Hae II с получением фрагментов ДНК ожидаемого размера: 828, 722, 430, 370, 149 п.н.
Выявили, что для тест-системы по определению титра инфекционной активности вируса ящура диагностическая чувствительность
(DSe) составила 99,68 %, диагностическая специфичность (DSp) - 100 %, k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,994, прогностичность положительного результата (PPV) -100 %, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,17 %, диагностическая точность (DAc) - 99,77 %.
Доказали, что для тест-системы по определению титра инфекционной активности вируса бешенства диагностическая чувствительность (DSe) составила 99,59 %, диагностическая специфичность (DSp) - 100 %, k-критерий (индекс Каппа Коэна) - 0,993, прогностичность положительного результата (PPV) - 100 %, прогностичность отрицательного результата (NPV) - 99,10 %, диагностическая точность (DAc) - 99,72 %.
Список литературы
1. Васильева Л. А. Статистические методы в биологии, медицине и сельском хозяйстве: учеб. пособие / Л. А. Васильева. Новосибирск.: Институт цитологии и генетики СО РАН, 2007. 124 с.
2. A modular cloning system for standardized assembly of multigene constructs. / Weber E., Engler C., Gruetzner R., Werner S., Marillonnet S. // PLoS One. 2011 Feb 18;6(2):e16765. doi: 10.1371/journal.pone.0016765. 10.1371/journal.pone.0016765.
3. Dryden D. T. (September 2001). Nucleoside triphosphate-dependent restriction enzymes. / D. T. Dryden, N. E. Murray, D. N. Rao // Nucleic Acids Research. 29 (18): 3728-41. doi:10.1093/nar/29.18.3728. PMC 55918.
4. GeneBank. [Электронный ресурс] / URL: http:// www.ncbi.nlm.nih.gov. (Дата обращения: 02.07.2021).
5. Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals 2019 (OIE). Rabies. 2019. Ch. 3.1.17. P. 578-612.
6. Massey A. (2001). Recombinant DNA and Biotechnology: A Guide for Students. / A. Massey, H. Kreuzer. Washington, D. C: ASM Press. ISBN 1-55581176-0.
7. Mierzejewska K. (July 2014). Structural basis of the methylation specificity of R.DpnI. / K. Mierzejewska, W. Siwek, H. Czapinska, M. Kaus-Drobek, M. Radlinska, K. Skowronek et al. // Nucleic Acids Research. 42 (13): 8745-54. doi:10.1093/nar/gku546. PMC 4117772. PMID 2496635.
8. Ninfa J. P. (2010). Fundamental Laboratory Approaches for Biochemistry and Biotechnology. / J. P. Ninfa, D. P. Balou, M. Benore. Hoboken, N. J.: John Wiley & Sons. p. 341. ISBN 978-0-470-08766-4.
9. OIE. Manual of diagnostic tests and vaccines for terrestrial animals. 7th ed. Paris, 2018. Vol. 1, Chap. 2.1.8.
10. Revolutionizing Biotechnology with Artificial Restriction Enzymes. Genetic Engineering and Biotechnology News. 10 February 2017. Retrieved 27 May 2021. (reporting on Programmable DNA-Guided Artificial Restriction Enzymes).
11. Roberts R. J. (April 2005). How restriction enzymes became the workhorses of molecular biology. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (17): 5905-8. doi:10.1073/ pnas.0500923102. PMC 1087929. PMID 15840723.
12. Roberts R. J. (January 2007). REBASE-enzymes and genes for DNA restriction and modification. / R. J. Roberts, T. Vincze, J. Posfai, D. Macelis // Nucleic Acids Research. 35 (Database issue): D269-70. doi:10.1093/nar/gkl891. PMC 1899104. PMID 17202163.
DOI 10.24412/2074-5036-2021-4-20-27 УДК 619:616
Ключевые слова: хроническая почечная недостаточность, кошки, редокс-гомеостаз, гепаторенальная система.
Key words: chronic renal failure, cats, redox homeostasis, hepatorenal system.
хУшакова Т. М., 2Дерезина Т. Н.
КОРРЕЛЯЦИЯ МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫХ РАССТРОЙСТВ ГЕПАТОРЕНАЛЬНОЙ СИСТЕМЫ И УРОВНЯ РЕДОКС-ГОМЕОСТАЗА ПРИ ХРОНИЧЕСКОЙ ПОЧЕЧНОЙ НЕДОСТАТОЧНОСТИ У КОШЕК
CORRELATION OFMORPHOFUNCTIONAL DISORDERS OF THE HEPATORENAL SYSTEM AND THE LEVEL OF REDOX HOMEOSTASIS IN CHRONIC RENAL FAILURE IN CATS
'ФГБОУ ВО «Донской государственный аграрный университет». Адрес: 346493, Россия, Ростовская обл., Октябрьский р-он, п. Персиановский, ул. Кривошлыкова, д. 24.
Don State Agrarian University. Address: 346493, Russia, Rostov Region, Oktyabrsky District, village Persianovsky, Krivoshlykova street, house 24. 2ФГБОУ ВО «Донской государственный технический университет». Адрес: 344000, Россия, г. Ростов-на-Дону, пл. Гагарина, д. 1.
Don State Technical University. Address: 344000, Russia, Rostov-on-Don, Gagarina Square, 1.
