ТЕСТ-СИСТЕМА ДЛЯ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТИПИЧНЫХ И ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ВАРИАНТОВ ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ БИОВАРА ЭЛЬ ТОР МЕТОДОМ ПЦР В РЕЖИМЕ РЕАЛЬНОГО ВРЕМЕНИ Текст научной статьи по специальности «Биотехнологии в медицине»

DOI: 10.21055/0370-1069-2021-4-120-127

УДК 616.932:616-07

В.н. савельев1, А.н. куличенко1, и.В. савельева1, д.А. ковалев1, Т.В. Таран1, Е.и. Подопригора1,

В.В. сосунов2, Т.В. радаева2

тест-система для идентификации типичных и генетически измененных вариантов холерных вибрионов биовара эль тор методом пцр в режиме реального времени

'ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт», Ставрополь, Российская Федерация;

2ООО «ДНК-СИНТЕЗ», Москва, Российская Федерация

цель работы - анализ и оценка результатов ПЦР-тест-системы «Гены V. cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» для идентификации Vibrio cholerae O1 с дифференциацией на типичные токсигенные и генетически измененные варианты в мультиплексном формате с гибридизационно-флуоресцентным методом учета результатов в режиме реального времени. материалы и методы. Для достижения указанной цели в работе представлен набор реагентов ПЦР-тест-системы «Гены V. cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL», а также способ осуществления идентификации V. cholerae O1 с дифференциацией на типичные токсигенные и генетически измененные варианты. Изучены специфичность, специфическая активность и чувствительность разработанной тест-системы на 35 штаммах V. cholerae O1, 6 штаммах V. cholerae non O1, 5 гетерологичных штаммах (Shigella zonnei - 2 штамма, по одному штамму Salmonella typhimurium, S. enteritidis, Escherichia coli). результаты и обсуждение. Набор реагентов ПЦР-тест-системы «Гены V. cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» выявляет в геноме токсигенных V. cholerae 01 фрагменты ДНК генов ctxBcl, ctxBE1, rtxC (обладает специфической активностью, аналитическая чувствительность 1-103 ГЭ/мл) и не обнаруживает данные гены у нетоксигенных V. cholerae 01 и non O1, а также у гетерологичных штаммов микроорганизмов (показана специфичность 100 %). На ПЦР-тест-систему «Гены V. cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» получен патент РФ № 2732448, опубл. 24.08.2020, бюл. № 24. ПЦР-тест-система «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» может быть использована для повышения эффективности системы эпидемиологического надзора за холерой и проведения обоснованного объема противоэпидемических мероприятий в случае ее завоза на территорию Российской Федерации.

Ключевые слова: типичные токсигенные и генетически измененные варианты холерного вибриона биовара Эль Тор, ПЦР-тест-система для идентификации возбудителя холеры.

Корреспондирующий автор: Савельев Вилорий Николаевич, e-mail: stavnipchi@mail.ru.

Для цитирования: Савельев В.Н., Куличенко А.Н., Савельева И.В., Ковалев Д.А., Таран Т.В., Подопригора Е.И., Сосунов В.В., Радаева Т.В. Тест-система для идентификации типичных и генетически измененных вариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор методом ПЦР в режиме реального времени. Проблемы особо опасных инфекций. 2021; 4:120-127. DOI: 10.21055/0370-1069-2021-4-120-127

Поступила 08.04.2021. Отправлена на доработку 29.04.2021. Принята к публ. 19.05.2021.

V.N. Savel'ev1, A.N. Kulichenko1, I.V. Savel'eva1, D.A. Kovalev1, T.V. Taran1, E.I. Podoprigora1, V.V. Sosunov2, T.V. Radaeva2

Test-System for Identification of Typical and Genetically Altered Variants of Cholera Vibrios, Biovar El Tor, Using Real-Time PCR

'Stavropol Research Anti-Plague Institute, Stavropol, Russian Federation; 2 "DNK-SINTEZ" LLC, Moscow, Russian Federation

Abstract. The aim of the work was to analyze and assess the results of using PCR test-system " V. cholerae variant ctxB-rtxC FL genes" for identification of Vibrio cholerae O1 with differentiation between typical toxigenic and genetically modified variants in a multiplex format with a real-time hybridization-fluorescent recording of results. Materials and methods. To achieve this goal, a set of reagents for the PCR test-system "V. cholerae O1 variant ctxB-rtxC FL genes", as well as a method for identifying V. cholerae O1 with differentiation between typical toxigenic and genetically altered variants were utilized. The specificity, specific activity and sensitivity of the developed test-system by the example of 35 V. cholerae O1 strains, 6 V. cholerae non-O1 strains, 5 heterologous strains (Shigella zonnei - 2 strains, one Salmonella typhimurium strain, S. enteritidis, Escherichia coli) were investigated. Results and discussion. The panel of reagents for the PCR test system "V. cholerae variant ctxB-rtxC FL genes" detects DNA fragments of the ctxBC1, ctxBE1, rtxC genes in the genome of toxigenic V. cholerae 01 (has specific activity, analytical sensitivity 1103 GE/ml) and does not detect these genes in non-toxigenic V. cholerae O1 and non-O1, as well as in heterologous strains of microorganisms (100 % specificity). RF Patent No. 2732448 was granted for the PCR test-system "V. cholerae variant ctxB-rtxC FL genes". It can be used to increase the efficiency of the epidemiological surveillance system and to carry out a justified scope of anti-epidemic measures in the event of cholera importation into the territory of the Russian Federation.

Key words: typical toxigenic and genetically modified variants of Vibrio cholerae biovar El Tor, PCR test-system for identification of the causative agent of cholera.

Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.

Corresponding author: Vilory N. Savel'ev, e-mail: stavnipchi@mail.ru.

Citation: Savel'ev V.N., Kulichenko A.N., Savel'eva I.V., Kovalev D.A., Taran T.V., Podoprigora E.I., Sosunov V.V., Radaeva T.V. Test-System for Identification of Typical and Genetically Altered Variants of Cholera Vibrios, Biovar El Tor, Using Real-Time PCR. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2021; 4:120-127. (In Russian). DOI: 10.21055/0370-1069-2021-4-120-127 Received 08.04.2021. Revised 29.04.2021. Accepted 19.05.2021.

Savel'ev V.N., ORCID: https://orcid.org/0000-0001-6458-3725 Kulichenko A.N., ORCID: https:// orcid.org/0000-000-9362-39 Savel'eva I.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-1254-2259

Типичные токсигенные холерные вибрионы биовара Эль Тор (Vibrio cholerae O1 biotype El Tor, Hly-, ctxA+) за счет присутствия в геноме дополнительных блоков генов, обеспечивающих высокий уровень адаптации к меняющимся условиям окружающей среды (островов патогенности (VPI-I, II) и пан-демичности (VSP-I, II)) [1-3], явились этиологическим фактором холеры в Азии (1961-1969 гг.), Азии, Африке, Европе, США, Океании (1970-1980 гг.), Азии, Африке, Европе, США, Океании, Австралии (1981-1990 гг.) [4-11].

В начале 90-х гг. прошлого столетия появились штаммы холерного вибриона О1 серологической группы с фено- и генотипическими признаками классического и Эль Тор биоваров, получивших название «генетически измененные» (геноварианты) или «гибридные» варианты холерных вибрионов биовара Эль Тор [12, 13], и они являются доминантными этиологическими агентами современного этапа развития седьмой пандемии холеры Эль Тор, начавшегося в 1990-е гг., а в первые два десятилетия XXI в. получили глобальное распространение.

Эволюционные преобразования типичного ток-сигенного биовара Эль Тор в гибридный вариант сопровождались изменениями структуры генов коровой области профагов СТХа и RS1a. В результате горизонтального переноса генов образовались генотипы с различными комбинациями генов патогенно-сти типичного Эль Тор и классического биовара. При этом геномы названных вариантов биовара Эль Тор обязательно содержат ген ctxBCl, кодирующий биосинтез энтеротоксина классического типа (СТ1) [14]. Вместе с тем эволюционные преобразования в гибридный вариант не затронули гены «домашнего хозяйства», в частности ген rtxC, специфичный для типичного токсигенного биовара Эль Тор. При этом в реакции полимеразной цепной реакции типичные токсигенные штаммы биовара Эль Тор образуют ам-пликоны к генам ctxBEl и rtxC, а генетически измененные варианты биовара Эль Тор образуют ампли-коны к генам ctxBCl и rtxC.

Учитывая генетические особенности гибридных вариантов Эль Тор, специалисты РосНИПЧИ «Микроб» разработали «набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cholerae О1 классического и Эль Тор биоваров и дифференциации Эль Тор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофорезным учетом результатов (Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ)» [15, 16].

Цель работы - анализ и оценка результатов ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae О1 вариант

Kovalev D.A., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-9366-5647 Taran T.V., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-8070-0706 Podoprigora E.I., ORCID: https://orcid.org/0000-0002-4549-9701

ctxB-rtxC, FL» для идентификации V. cholerae O1 с дифференциацией на типичные токсигенные и генетически измененные варианты в мультиплексном формате с гибридизационно-флуоресцентным методом учета результатов в режиме реального времени.

Материалы и методы

В работе использовали набор реагентов ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL», предназначенный для идентификации V. cholerae о1 с определением биовара и дифференциацией вибрионов биовара Эль Тор на типичные штаммы и генетически измененные (гибридные) варианты методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов, состоящий из следующих ингредиентов (табл. 1).

Для изучения специфичности, специфической активности и чувствительности разработанной тест-системы использованы гомологичные штаммы: штаммы V. cholerae O1 стандартного образца ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» СО 002-9388-2010 «Набор штаммов для контроля качества МИБП для диагностики холеры» - 35 штаммов, V. cholerae non O1 - 6 штаммов, гетерологич-ные штаммы - 5 штаммов (Shigella zonnei (2 штамма), Salmonella typhimurium, S. enteritidis, Escherichia coli).

Штаммы указанных микроорганизмов получены из коллекции патогенных микроорганизмов Ставропольского противочумного института, где холерные вибрионы хранились в 0,4 % агаре Хоттингера при температуре 20-25 °С, а шигеллы, сальмонеллы и кишечные палочки - в 0,4 % агаре хоттингера при 4-6 °С.

подготовку проб проводили согласно МУ 1.3.2569-09 «Организация работы лабораторий, использующих методы амплификации нуклеиновых кислот при работе с материалом, содержащим микроорганизмы I-IV групп патогенности».

выделение днк осуществляли с использованием комплекта реагентов для экстракции ДНК «АмплиПрайм ДНК-сорб-АМ» (ООО «ИнтерЛабСервис», Россия).

Аллельспецифические праймеры для амплификации смеси генов F+R ctxB (ctxBcl+ctxBEl) и rtxC методом полимеразной цепной реакции в мультиплексном формате c гибризационно-флуоресцентным учетом результатов на амплификаторе Rotor Gene Q5 синтезировали в ООО «ДНК-Синтез». Полимеразную цепную реакцию двух реакционных смесей различ-

l2l

Таблица 1 / Table 1

Состав набора реагентов ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» Composition of the set of reagents for the PCR test system " Vibrio cholerae O1 variant ctxB-rtxC, FL"

Компонент Component Списание Description Oбъем, мкл Volume, Кол-во (пробирка) Qty (test tube)

ПЦР-смесь 1: (F+R) праймеры ctxBC1 (10 мкМ) GREEN ctxBE1 (10 мкМ) YELLOW PCR mixture 1: (F+R) ctxBC1 primers (10 цМ) GREEN ctxBE1 (10 цМ) YELLOW Лиофильно высушенный порошок, при растворении -прозрачная бесцветная жидкость, содержащая праймеры к генам В1 и В3 Freeze-dried powder, when dissolved - a clear colorless liquid containing primers for B1 and B3 genes i3G i

Зонд G-FAM (10 мкМ) GREEN G-FAM probe (10 цМ) GREEN Лиофильно высушенный порошок. Выявляет ген B1 на канале Green Freeze-dried powder. Identifies B1 gene on the Green channel 55 i

Зонд - A-VIC (10 мкМ) YELLOW Probe - A-VIC (10 цМ) YELLOW Лиофильно высушенный порошок. Выявляет ген B3 на канале Yellow Freeze-dried powder. Identifies the B3 gene on the Yellow channel 55 i

ПЦР-смесь 2: (F+R) праймеры rtxC (10 мкМ) ORANGE PCR-mixture 2: (F+R) rtxC primers (10цМ) ORANGE Лиофильно высушенный порошок, при растворении -прозрачная бесцветная жидкость, содержащая праймеры к гену rtxC Freeze-dried powder, when dissolved - a clear colorless liquid containing primers to the rtxC gene i3G i

Зонд для выявления гена rtxC на канале ORANGE Probe for detecting rtxC gene on the ORANGE channel Лиофильно высушенный порошок. Выявляет ген rtxC на канале ORANGE Freeze-dried powder. Identifies the rtxC gene on the ORANGE channel 55 i

Смесь дНТР 10х (5 мМ) dNTP Mixture 10x (5 шМ) Прозрачная бесцветная жидкость Transparent colorless liquid 55 i

10х буфер для TaqPol+MgCl2 10x Buffer for TaqPo^gC^ Прозрачная бесцветная жидкость Transparent colorless liquid i3G i

Taq-полимераза (5 ед/мкл) Taq polymerase (5 units/^l) Прозрачная бесцветная жидкость Transparent colorless liquid 30 i

К - (H2O или РНК-элюент) К - (H2O or RNA eluent) Вода очищенная - прозрачная бесцветная жидкость Purified water - transparent colorless liquid i2GG i

ПКО+Class (ДНК, 569В) PCS+Class (DNA, 569B) Прозрачная бесцветная жидкость - водный раствор ДНК V cholerae O1 классического биовара Transparent colorless liquid - aqueous solution of V cholerae O1 DNA of classic biovar 55 i

ПКО+El Tor (ДНК, 484Ст) PCS+El Tor (DNA, 484St) Прозрачная бесцветная жидкость - водный раствор ДНК V cholerae O1 биовара Эль Тор Transparent colorless liquid - aqueous solution of V cholerae O1 biovar El Tor 55 i

Примечание: набор реагентов «Гены Vibrio cholerae О1 вариант ctxB-rtxC, FL» рассчитан на 50 определений с учетом положительных и отрицательных контролей. ПКО - положительный контрольный образец.

Note : the set of reagents "Vibrio cholerae O1 variant ctxB-rtxC FL genes" is designed for 50 runs, taking into account positive and negative controls. PCS - positive control sample.

ного состава с гибридизационно-флуоресцентной детекцией в режиме реального времени проводили в объеме 25 мкл (табл. 2).

Режим амплификации: 1 цикл 95 °С - 3 мин; 40 циклов 95 °С - 20 с; 57 °С - 30 с; 72 °С - 20 с. Накопление продукта амплификации только c зондом, специфичного к гену ctxBcl (G-FAM) в канале Green, свидетельствует о наличии в пробе ctxBcl (В1). накопление продукта амплификации только с зондом, специфичного к гену ctxBE1 (A-VIC) в канале HEX/VIC (Yellow), - о наличии в пробе гена ctxBE1 (В3).

Накопление продукта амплификации с двумя зондами одновременно (в двух каналах) свидетельствует о наличии в пробе ДНК двух генов одновременно. Накопление продукта амплификации только с зондом ROX, специфичного к гену rtxC в канале Orange, свидетельствует о наличии в пробе ДНК гена rtxC. Анализ и интерпретация результатов: а) анализ результатов амплификации ДНК исследуемых штаммов микроорганизмов с ПЦР-смесью № 1: анализируют кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам:

Таблица 2 / Table 2

состав реакционных смесей The composition of the reaction mixtures

Смесь № 1 Mix No. 1 Смесь № 2 Mix No. 2

10х буфер для TaqPol, 2,5 мкл 10x TaqPol buffer, 2.5 ц1 10х буфер для TaqPol, 2,5 мкл 10x TaqPol buffer, 2.5 ц1

MgC12 (50 мкМ), 2,0 мкл MgCl2 (50 цМ), 2.0 ц1 MgC12 (50 мкМ), 2,0 мкл MgC12 (50 цМ), 2.0 ц1

(F+R ctxB) праймеры (10 мкМ), 2,5 мкл (F+R ctxB) primers (10 цМ), 2.5 ц1 (F+R rtxC) праймеры (10 мкМ), 2,5 мкл (F+R rtxC) primers (10 цМ), 2.5 ц1

Зонд G-FAM (10 мкМ), Green, 1 мкл G-FAM probe (10 Green, 1 ц1 Зонд на rtxC (10 мкМ), Orange, 1 мкл

Зонд A-VIC (10 мкМ), Yellow, 1 мкл Probe A-VIC (10 Yellow, 1 ц1 Probe for rtxC (10 цМ), Orange, 1 ц1

Смесь dNTPs (5 мкМ), 4 мкл dNTPs mixture (5 4 ц1 Смесь dNTPs (5 мкМ), 4 мкл DNTPs mixture (5 цМ), 4 ц1

TaqPol (5 ед/мкл), 1 мкл TaqPol (5 и/ц1), 1 ц1 TaqPo1 (5 ед/мкл), 1 мкл TaqPo1 (5 и/ц1), 1 ц1

Вода до 25 мкл Water up to 25 ц1 Вода до 25 мкл Water up to 25 ц1

Контроли: Controls: Контроли: Contro1s:

К - (Н20) - отрицательный, 2,0 мкл К - (Н20) - negative control, 2.0 ц1 К - (Н20) - отрицательный, 2,0 мкл К - (Н20) - negative contro1, 2.0 ц1

ПКО+Эль Тор: ДНК V. cholerae El Tor PCS +E1 Tor: DNA V cholerae El Tor ПКО+Эль Тор: ДНК V. cholerae E1 Tor PKO+E1 Tor: DNA V. cholerae E1 Tor

484Ст (10 нг/мкл), 2 мкл 484St (10 ng/цО, 2 ц1 484Ст (10 нг/мкл), 2 мкл 484St (10 ng/ц!), 2 ц1

ПКО+Classical: ДНК V cholerae Classical PCS +Classical: DNA V. cholerae Classical n^+aassicaf ДНК V cholerae C1assica1 PKO+C1assica1: DNA V. cholerae C1assica1

569B(10 нг/мкл), 2 мкл 569B (10 ng/цО, 2 ц1 569B(10 нг/мкл), 2 мкл 569B (10 ng/цО, 2 ц1

ДНК (10 нг/мкл) изучаемая, 2 мкл DNA (10 ng/ц!) studied, 2 ц1 ДНК (10 нг/мкл) изучаемая, 2 мкл DNA (10 ng/цО studied, 2 ц1

- по каналу для флуорофлора G-FAM регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК гена ctxBCl (B1) на канале Green;

- по каналу для флуорофлора A-VIC регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента Днк гена ctxBE1(B3) на канале Yellow;

б) анализ результатов амплификации ДНК исследуемых штаммов микроорганизмов с ПЦР-смесью № 2: по каналу для флуорофлора ROX регистрируется сигнал, свидетельствующий о накоплении продукта амплификации фрагмента ДНК гена rtxC на канале Orange.

Уровень пороговой линии (порог) на всех каналах учета - 0,05. Величина порогового цикла для положительных проб составила: Ct не >25. Корректировка уклона выявленных кривых обязательна, процент устранения выбросов - 15-20 %. Амплификацию осуществляли на приборе RotorGeneQ 5plex (QiaGen, ФРГ).

результаты и обсуждение

Результаты ПЦР-анализа ДНК штаммов V. cholerae при использовании тест-системы «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» представлены в табл. 3 и на рисунке.

Примеры результатов ПЦР-анализа ДНК генетически измененных штаммов V. cholerae O1 представлены на рисунке.

Таким образом, набор реагентов ПЦР-тест-системы «гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rtxC, FL» выявляет в геноме токсигенных V. cholerae 01 фрагменты ДНК генов ctxBcl, ctxBEl, rtxC (обладает специфической активностью) и не обнаруживает данные гены у нетоксигенных V. cholerae 01 и non O1, а также у гетерологичных штаммов микроорганизмов: S. zonnei 20, 76; S. typhimurium 160; S. enteriti-dis 165; E. coli 406-1 (обладает специфичностью).

Образцы набора реагентов ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» для идентификации штаммов V. cholerae 01 с определе-

Таблица 3 / Table 3

Протокол учета результатов ПЦР-анализа ДНК штаммов V. cholerae O1, non O1/139 и гетерологичных при использовании тест-системы «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rtxC, FL»

Protocol for recording the results of PCR assay of V. cholerae O1, non O1/139 and heterologous strain DNA, using the test system " Vibrio cholerae variant ctxB-rtxC FL genes"

ПЦР-смеси праймеров № 1, 2 V. cholerae O1

ДНК штаммов V. cholerae O1 DNA of V. cholerae O1 strains PCR primer mixtures No. 1, 2 V. cholerae O1 результат / Resu1t (Биовар / Biovar)

Каналы учета выявляемых генов в режиме реального времени Channe1s for registering the detected genes in rea1-time mode

Green: (Bl) Yellow: (B3) Orange: rtxC

К - (Н,О) / K - (H2O) - - - -

ПКО+Ckss / PCS + C1ass + - - БК / BC

ПКО+Е1 Tor / PCS + E1 Tor - + + БЭТ / BET

ДНК Эль Тор / DNA E1 Tor + - + ГИЭ/GME

Дагестан, 1993 г. / Dagestan, 1993

1. V. cholerae O1, 64 + - + ГИЭ/GME

2. V. cholerae O1, 169 + - + ГИЭ / GME

3. V. cholerae O1, 1045 + - + ГИЭ/GME

4. V. cholerae O1, 1308 + - + ГИЭ / GME

5. V. cholerae O1, 1726 + - + ГИЭ / GME

Дагестан, 1994 г. / Dagestan, 1994

6. V. cholerae O1, 489 + - + ГИЭ/GME

7. V. cholerae O1, 549 + - + ГИЭ / GME

8. V. cholerae O1, 1095 + - + ГИЭ/GME

9. V. cholerae O1, 1105 + - + ГИЭ/GME

10. V. cholerae O1, 1120 + - + ГИЭ / GME

11. V. cholerae, 1641 + - + ГИЭ / GME

Дагестан, 1998 г. / Dagestan, 1998

12 V cholerae O1, 6К + - + ГИЭ/GME

13. V. cholerae O1, 8К + - + ГИЭ / GME

14. V. cholerae O1, 13К + - + ГИЭ/GME

15. V. cholerae 1720к + - + ГИЭ/GME

16. V. cholerae 1, 17280 + - + ГИЭ / GME

17. V. cholerae O1, 17390 + - + ГИЭ / GME

Украина, Мариуполь (1994, 1995, 1998 гг.) / Ukraine, Mariupol (1994, 1995, 1998)

18. V cholerae O1, 12К + - + ГИЭ/GME

19. V. cholerae O1, 31К + - + ГИЭ / GME

20. V. cholerae O1, 39К + - + ГИЭ/GME

21. V. cholerae O1, 43К + - + ГИЭ/GME

22. V. cholerae O1, 56К + - + ГИЭ / GME

23. V. cholerae O1, 80К + - + ГИЭ / GME

Азербайджан, 1985 г.; Ставрополь, 1990 г. / Azerbaijan, 1985; Stavropol, 1990

24. V cholerae O1, 350Аз - + + БЭТ / BET

25. V. cholerae O1, 351Аз - + + БЭТ / BET

26. V cholerae О1, 363Аз - + + БЭТ / BET

27. V. cholerae O1, 431Ст - + + БЭТ / BET

28. V. cholerae O1, 454Ст - + + БЭТ / BET

29. V. cholerae O1, 477Ст - + + БЭТ / BET

Сочи, 2015 г. / Sochi, 2015 (sampling with traps)

30. V. cholerae O1, 3 л - - + -

31. V. cholerae O1, 5 л - - + -

32. V cholerae O1, 7 л - - + -

33. V. cholerae O1, 548 л - - + -

34. V cholerae O1, 647 л - + + БЭТ / BET

35. V. cholerae O1, 1013 л - - + -

Азербайджан, V. cholerae не O1 / Azerbaijan, V. cholerae non-O1

36. V. cholerae не O1, 1775Аз - - - -

37. V cholerae не O1, 2286Аз - - - -

38. V. cholerae не O1, 2603Аз - - - -

39. V. cholerae не O1, 5278Аз - - - -

40. V. cholerae не O1, 7007Аз - - - -

41. V. cholerae не O1, 161-168, коллекция Саказаки - - - -

Гетерологичные штаммы / Heterologous strains

42. S. zonnei, 20 - - - -

43. S. zonnei, 76 - - - -

44. S. enteritidis, 160 - - - -

45. E. coli, 406-1 - - - -

46. S. typhimurium, 165 - - - -

Примечание: БК - биовар классический; БЭТ - биовар Эль Тор типичный; ГИЭ - генетически измененный биовар Эль Тор. Note: BC - classic biovar; BET - biovar El Tor typical; GME - genetically modified El Tor.

l24

ьтр.: LTp i

Typical amplification curves in the analysis of DNA of V. cholerae O1 strains isolated in the Republic of Dagestan in 1993, 1994, 1998. Green channel (A); Yellow channel (B); Orange channel (C)

нием биовара и дифференциацией биовара Эль Тор на типичные токсигенные и генетически измененные (гибридные) варианты методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов (серии 1-18 и 2-18) соответствуют требованиям ТУ 21.10.60-52018977080-2019.

ПЦР-тест-система «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» позволяет выявлять генетически измененные штаммы холерных вибрионов биовара Эль Тор и соответствует результатам, полученным с помощью ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» (опытный

образец, Ставропольский противочумный институт) и ПЦР-тест-системы «Ген V. cholerae вариант ctxB-РЭФ», предназначенной для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae 01 серогруппы, определения биовара выделенного штамма, дифференциации Эль Тор вибрионов на типичные штаммы и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции с элек-трофоретическим учетом результатов (производство РосНИПЧИ «Микроб»).

Основное преимущество разработанной ПЦР-тест-системы «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» при сравнении с указанными выше

заключается в том, что идентификация штаммов V. cholerae 01 с определением биовара и дифференциацией биовара Эль Тор на типичные токси-генные и генетически измененные (гибридные) варианты осуществляется методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с гибридизационно-флуоресцентным учетом результатов в режиме реального времени. Воспроизводимость результатов, получаемых с помощью данной ПЦР-тест-системы, составляет 100 %. Чувствительность тест-системы составила 103 ГЭ/мл.

Представленная ПЦР тест-система «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» может быть использована для повышения эффективности системы эпидемиологического надзора за холерой и принятия обоснованного решения по объему противоэпидемических мероприятий в случае ее завоза на территорию Российской Федерации.

На ПЦР-тест-систему «Гены Vibrio cholerae 01 вариант ctxB-rtxC, FL» получен патент рФ на изобретение № 2732448 (опубл. 24.08.2020, бюл. № 24) [17].

Конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.

Список литературы

1. De Haan L., Hirst T.R. Cholera toxin: a paradigm for multifunctional engagement of cellular mechanisms. Mol. Membr. Biol. 2004; 21(2):77-92. DOI: 10.1080/09687680410001663267.

2. Dziejman M.E., Balon D., Boyd C.M., Fraser J.F., Heidelberg J.J., Mekalanos J.J. Comparative genomicanalysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and handemic disease. Proc. Natl Acad. Sci. USA. 2002; 99(3):1556-61. DOI: 0.1073/ pnas.042667999.

3. Pradhan S., Baidya A.K., Ghosh A., Paul K., Chowdhury R. The El Tor biotype of Vibrio cholerae exhibits Vibrio cholerae a growth advantage in the stationary phase in mixt cultures with the classical biotype. J. Bacteriol. 2010; 192(4):955-63. DOI: 10.1128/ JB.01180-09.

4. Смирнова Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.П., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, изолированных на территории России в современный период. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. 2011; 3:11-7.

5. Safa A., Sultana J., Cam P.D., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 eltor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 15(6):987-8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.

6. Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T., Choi S.Y., Hien N.T., AnhD.D., Lee H.R., Ansaruzzaman M., Endtz H.P., Chun J., Lopez A.L., Czerkinsky C., Clemens J.D., Kim D.W. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain produsing classical toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol. 2009; 47(5):1568-71. DOI: 10.1128/ JCM.02040-08.

7. Raychoudhuri A., Patra T., Ghosh K., Ramamurthy T., Nandy R.K., Takeda Y., Balakrish-Nair G., Mukhopadhyay A.K. Classical ctxB in Vibrio cholerae O1, Kalkata, India. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1):131-2. DOI: 10.3201/eid1501.080543.

8. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.

9. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor end classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283-6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.

10. Grim C.J., Hasan N.A., Taviani E., Haley B., Chun J., Brettin T.S., Bruce D.C., Detter J.C., Han C.S., Chertkov O., Challacombe J., Huq A., Nair G.B., Colwell R.R. Genome sequence of hybrid Vibrio cholerae O1 MJ-1236, B-33, and CIRS101 and comparative genomics with V. cholerae. J. Bacteriol. 2010; 192(13):3524-33. DOI: 10.1128/JB.00040-10.

11. Siddique A.K., Nair G.B., Alam M., Sack D.A., Huq A., Nizam A., Longini I.M. Jr., Qadri F., Faruque S.M., Colwell R.R.,

Ahmed S., Iqbal A., Bhuiyan N.A., Sack R.B. El Tor cholera with severe disease: a new threat to Asia and beyond. Epidemiol. Infect. 2010; 138(3):347-52. DOI: 10.1017/S0950268809990550.

12. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M., Siddique A.K., Qadri F., Izumiya H., Nair G.B., Watanabe H. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCA assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52(6):314-7. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2008.00041.x.

13. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211-3. DOI: 10.1128/ JCM.01304-06.

14. Савельева И.В., Куличенко А.Н., Ковалев Д.А., Жиров А.М., Савельев В.Н. Эволюция генома холерного вибриона биовара Эль Тор и разработка ПЦР-тест-системы для идентификации штаммов возбудителя холеры. В кн.: Холера и патогенные для человека вибрионы: материалы Проблемной комиссии. Ростов н/Д; 2017. Вып. 30. С. 172-7.

15. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Шубина А.В., Заднова С.П., Кутырев В.В. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара Эль Тор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления. Патент РФ № 2458141, опубл. 10.08.2012. Бюл. № 22.

16. Шашкова А.В., Горяев А.А., Заднова С.П., Краснов Я.М., Смирнова Н.И., Кутырев В.В. Конструирование ПЦР-тест-системы для идентификации токсигенных штаммов Vibrio cho-lerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов Эль Тор вибрионов на типичные и измененные. Проблемы особо опасных инфекций. 2011; 4(110):49-52. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-49-52.

17. Савельев В.Н., Савельева И.В., Сосунов В.В, Ковалев Д.А., Подопригора Е.И., Васильева О.В., Гусева Л.В. Способ идентификации штаммов Vibrio cholerae O1, определения их токсигенности и биовара с дифференциацией биовара ЭльТор на типичные и генетически измененные варианты методом мультиплексной полимеразной цепной реакции и тест-система для его осуществления с учетом результатов в режиме «реального времени». Патент РФ № 2732448, опубл. 16.09.2020. Бюл. № 26.

References

1. De Haan L., Hirst T.R. Cholera toxin: a paradigm for multifunctional engagement of cellular mechanisms. Mol. Membr. Biol. 2004; 21(2):77-92. DOI: 10.1080/09687680410001663267.

2. Dziejman M.E., Balon D., Boyd C.M., Fraser J.F., Heidelberg J.J., Mekalanos J.J. Comparative genomicanalysis of Vibrio cholerae: genes that correlate with cholera endemic and handemic disease. Proc. NatlAcad. Sci. USA. 2002; 99(3):1556-61. DOI: 0.1073/ pnas.042667999.

3. Pradhan S., Baidya A.K., Ghosh A., Paul K., Chowdhury R. The El Tor biotype of Vibrio cholerae exhibits Vibrio cholerae a growth advantage in the stationary phase in mixt cultures with the classical biotype. J. Bacteriol. 2010; 192(4):955-63. DOI: 10.1128/ JB.01180-09.

4. Smirnova N.I., Zadnova S.P., Shashkova A.P., Kutyrev VV.JGenome variability of altered variants of Vibrio cholerae bio-var El Tor isolated on the territory of Russia in the modern period]. Molekulyarnaya Genetika, Mikrobiologiya i Virusologiya [Molecular Genetics, Microbiology and Virology]. 2011; 3:11-7.

5. Safa A., Sultana J., Cam PD., Mwansa J.C., Kong R.Y. Vibrio cholerae O1 eltor strains, Asia and Africa. Emerg. Infect. Dis. 2008; 15(6):987-8. DOI: 10.3201/eid1406.080129.

6. Nguyen B.M., Lee J.H., Cuong N.T., Choi S.Y., Hien N.T., Anh D.D., Lee H.R., Ansaruzzaman M., Endtz H.P., Chun J., Lopez A.L., Czerkinsky C., Clemens J.D., Kim D.W. Cholera outbreaks caused by an altered Vibrio cholerae O1 El Tor biotype strain produsing classical toxin B in Vietnam in 2007 to 2008. J. Clin. Microbiol. 2009; 47(5):1568-71. DOI: 10.1128/ JCM.02040-08.

7. Raychoudhuri A., Patra T., Ghosh K., Ramamurthy T., Nandy R.K., Takeda Y., Balakrish-Nair G., Mukhopadhyay A.K. Classical ctxB in Vibrio cholerae O1, Kalkata, India. Emerg. Infect. Dis. 2009; 15(1):131-2. DOI: 10.3201/eid1501.080543.

8. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010; 18(1):46-54. DOI: 10.1016/j.tim.2009.10.003.

9. Ghosh-Banerjee J., Senoh M., Takahashi T., Hamabata T., Barman S., Koley H., Mukhopadhyay A.K., Ramamurthy T., Chatterjee S., Asakura M., Yamasaki S., Nair G.B., Takeda Y. Cholera toxin production by the El Tor variant of Vibrio cholerae O1 compared to prototype El Tor end classical biotypes. J. Clin. Microbiol. 2010; 48(11):4283-6. DOI: 10.1128/JCM.00799-10.

10. Grim C.J., Hasan N.A., Taviani E., Haley B., Chun J., Brettin T.S., Bruce D.C., Detter J.C., Han C.S., Chertkov O., Challacombe J., Huq A., Nair G.B., Colwell R.R. Genome sequence of hybrid Vibrio cholerae Ol MJ-1236, B-33, and CIRS101 and comparative genomics with V. cholerae. J. Bacteriol. 2010; 192(13):3524-33. DOI: 10.1128/JB.00040-10.

11. Siddique A.K., Nair G.B., Alam M., Sack D.A., Huq A., Nizam A., Longini I.M. Jr., Qadri F., Faruque S.M., Colwell R.R., Ahmed S., Iqbal A., Bhuiyan N.A., Sack R.B. El Tor cholera with severe disease: a new threat to Asia and beyond. Epidemiol. Infect. 2010; 138(3):347-52. DOI: 10.1017/S0950268809990550.

12. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E., Bhuiyan N.A., Nusrin S., Alam M., Siddique A.K., Qadri F., Izumiya H., Nair G.B., Watanabe H. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCA assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008; 52(6):314-7. DOI: 10.1111/j.1348-0421.2008.00041.x.

13. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J., Safa A., Bhuiyan N.A., Ahmad Q.S., Faruque S.M., Faruque A.S., Takeda Y., Sack D.A. Cholera due to altered El Tor strains of Vibrio cholerae O1 in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2006; 44(11):4211-3. DOI: 10.1128/ JCM01304-06.

14. Savel'eva I.V., Kulichenko A.N., Kovalev D.A., Zhirov A.M., Savel'ev V.N. [Evolution of the genome of Vibrio cholerae biovar El Tor and the development of a PCR test-system for the identification of cholera pathogen strains]. In: [Cholera and Vibrios Pathogenic for Humans: Proceedings of the Problem Commission]. Rostov-on-Don; 2017. Vol. 30. P. 172-7.

15. Smirnova N.I., Goryaev A.A., Shubina A.V., Zadnova S.P., Kutyrev V.V. Method for identification of toxigenic V. cholerae O1 strains, determination of their biovar and differentiation of El Tor biovar strains into typical and modified by multiplex polymerase chain reaction and a test system for its implementation. RF patent No. 2458141, publ. 10.08.2012. Bul. No. 22.

16. Shashkova A.V., Goryaev A.A., Zadnova S.P., Krasnov Ya.M., Smirnova N.I., Kutyrev V.V. Construction of the PCR testsystem for the detection of Vibrio cholerae O1 toxigenic strains, for indication of their biovar and for differentiation between typical and altered El Tor-vibrio strains. Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2011; (4(110)):49— 52. DOI: 10.21055/0370-1069-2011-4(110)-49-52.

17. Savel'ev V.N., Savel'eva I.V., Sosunov V.V., Kovalev D.A., Podoprigora E.I., Vasil'eva O.V., Guseva L.V. Method for identification of Vibrio cholerae O1 strains, determination of their toxigenicity and biovar with differentiation of El Tor biovar into typical and genetically modified variants by multiplex polymerase chain reaction, and a test system for its implementation with registration of results in real-time mode. RF patent No. 2732448, publ. 16.09.2020. Bul. No. 26.

Authors:

Savel'ev V.N., Kulichenko A.N., Savel'eva I.V., Kovalev D.A., Taran T.V., Podoprigora E.I. Stavropol Research Anti-Plague Institute. 13-15, Sovetskaya St., Stavropol, 355035, Russian Federation. E-mail: stavnipchi@mail.ru.

Sosunov V.V., Radaeva T.V "DNK-SINTEZ" LLC. 9, Lokomotivny Avenue, Moscow, 127238, Russian Federation. E-mail: info@oligos.ru.

Об авторах:

Савельев В.Н., Куличенко А.Н., Савельева И.В., Ковалев ДА., Таран Т.В., Подопригора Е.И. Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт. Российская Федерация, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15. E-mail: stavnipchi@mail.ru.

Сосунов В.В., Радаева Т.В. 000 «ДНК-СИНТЕЗ». Российская Федерация, 127238, Москва, Локомотивный пр., 9. E-mail: info@oligos.ru.