CC BY
18© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2015
И.В.Савельева, К.Х.Хацуков, Е.И.Савельева, С.И.Москвитина, Д.А.Ковалев, В.Н.Савельев, А.Н.Куличенко, А.Д.Антоненко, Б.В.Бабенышев
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ ХОЛЕРЫ, ОБУСЛОВЛЕННОЙ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫМИ (ГИБРИДНЫМИ) ВАРИАНТАМИ ХОЛЕРНОГО ВИБРИОНА БИОВАРА ЭЛЬ ТОР
Ставропольский противочумный институт
Цель. Совершенствование лабораторной диагностики холеры с учетом появления в 90-е годы ХХ столетия гибридных вариантов холерного вибриона биовара Эль Тор. Материалы и методы. Исследованы фенотипические и молекулярно-генетические свойства типичных токсигенных (151 штамм) и гибридных (102 штамма) вариантов холерных вибрионов биовара Эль Тор, выделенных на Кавказе соответственно в 1970 — 1990 гг. и в 1993 — 1998 гг. Детекцию фрагментов ДНК генов токсигенности, присущих биоварам Эль Тор или классическому, осуществляли с помощью разработанного нами набора реагентов «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ». Результаты. Предложено использовать для лабораторной диагностики холеры при исследовании материала от людей или из объектов окружающей среды и для идентификации Vibrio cholerae O1 на уровне генома в ПЦР-анализе набор реагентов «Гены V. cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» в качестве необходимого дополнения к классической схеме бактериологического анализа. Заключение. Лабораторная диагностика холеры, обусловленной генетически измененными (гибридными) вариантами холерного вибриона биовара Эль Тор, должна основываться на комплексном исследовании материала от людей или из объектов окружающей среды рутинным бактериологическим и методом ПЦР-анализа с целью детекции в исследуемом материале фрагментов ДНК генов, определяющих биовар (классический или Эль ^р), идентификации штаммов V. cholerae О1 с дифференциацией Эль Тор вибрионов на типичные и измененные, а также определения типа энтеротоксина, продуцируемого конкретным штаммом холерного вибриона (по наличии фрагментов ДНК генов ctxBEl или ctxBa, кодирующих, соответственно, биосинтез СТ- 2 или СТ-1).
Журн. микробиол., 2015, № 1, С. 46—51
Ключевые слова: лабораторная диагностика холеры, детекция и идентификация типичных токсигенных и гибридные вариантов биовара Эль Тор
I.V.Savelieva, K.Kh.Khatsukov, E.I.Savelieva, S.I.Moskvitina, D.A.Kovalev, V.N.Saveliev, A.N.Kulichenko, A.D.Antonenko, B.V.Babenyshev
IMPROVEMENT OF LABORATORY DIAGNOSTICS OF CHOLERA DUE TO GENETICALLY ALTERED (HYBRID) VARIANTS OF CHOLERA VIBRIO BIOVAR EL TOR
Stavropol Institute of Plague Control, Russia
Aim. Improvement of laboratory diagnostics of cholera taking into the account appearance of hybrid variants of cholera vibrio El Tor biovar in the 1990s. Materials and methods. Phenotypic and molecular-genetic properties of typical toxigenic (151 strains) and hybrid (102 strains) variants of El Tor biovar cholera vibrios, isolated in the Caucuses in 1970 — 1990 and 1993 — 1998, respectively, were studied. Toxigenicity gene DNA fragments, inherent to El Tor biovars or classic, were detected by using a reagent kit «Genes of Vibrio cholerae variant ctxB-rstR-rstC, REF» developed by us. Results. Reagent kit «Genes of V. cholerae variant ctxB-rstR-rstC, REF» is proposed to be used for laboratory diagnostics of cholera during study of material from humans or environmental objects and for identification of V. cholerae O1 on genome level in PCR-analysis as a necessary addition to the classic scheme of bacteriological analysis. Conclusion. Laboratory diagnostics of cholera due to genetically altered (hybrid) variants of cholera vibrio El Tor biovar is based on a complex study of material from humans and environmental objects by routine bacteriologic and PCR-analysis methods with the aim of detection of gene DNA fragments in the studied material,
that determine biovar (classic or El Tor), identification of V. cholerae О1 strains with differentiation of El Tor vibrios into typical and altered, as well as determination of enterotoxin, produced by the specific cholera vibrio strain (by the presence ctxBEl or ctxBcl gene DNA fragment, coding biosynthesis of CT-2 or CT-1, respectively).
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2015, No. 1, P. 46-51
Key words: laboratory diagnostics of cholera, detection and identification of typical toxigenic and hybrid variants of El Tor biovar
ВВЕДЕНИЕ
Эволюция возбудителя VII пандемии холеры за более чем 50-летний период привела к возникновению в 90-е годы прошлого столетия его генетически измененных вариантов, в геноме которых помимо генов биовара Эль Тор (ctxBEl, rstREl, rstC) содержатся гены классического биовара —профага CTXClphi - ctxBCl и rstRCl, о чем стало известно лишь в 2002 — 2007 гг. [5, 6, 8, 9, 11, 13]. К настоящему времени эти геноварианты биовара Эль Тор стали доминирующими возбудителями холеры в странах Африки и Азии [7, 10, 13, 15], а в октябре 2010 г., вследствии выноса инфекции из Азии в страны Карибского бассейна, вызвали на Гаити крупную по охвату территории и числу заболевших и умерших эпидемию холеры в мире, сравнимую с эпидемией холеры в странах Латинской Америки в 1991 г. [16]. В Российской Федерации подобная эпидемия зарегистрирована в Республике Дагестан в 1994 г., вспышка 1998 г., возбудитель которой в момент выделения был идентифицирован как V. cholerae O1 biotype El Tor, Ogawa (ctx+), а в 2010 г. — как гибридный вариант биовара Эль Тор [2].
Лабораторная диагностика холеры преследует цель выделить возбудитель в чистой культуре и идентифицировать по морфологическим, биохимическим, серологическим тестам, определяющим принадлежность к семейству Vibrionaceae, роду Vibrio, виду Vibrio сholerae О1 или О139 серогрупп, к классическому или Эль Тор биовару, сероварам Ogawa, Inaba, Hikoshima. Определяется антибиотикограм-ма и токсигенность (эпидемичность) по наличию в геноме возбудителя холеры гена ctxA, кодирующего биосинтез энтеротоксина. Однако данный алгоритм лабораторной диагностики холеры, направленный на выделение и идентификацию типичного токсигенного холерного вибриона биовара Эль Тор, обусловившего эпидемиологические осложнения по холере в шестидесятые — начале девяностых годов ХХ столетия, оказался в настоящее время несовершенным в плане дифференциации типичных токсигенных и появившихся генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, морфологические, биохимические и серологические свойства которых, определяющие семейство, род, вид, серогруп-пу, идентичны типичным токсигенным холерным вибрионам Эль Тор [3].
Цель работы — разработка диагностических подходов для идентификации типичных токсигенных и гибридных вариантов биовара Эль Тор, совершенствование лабораторной диагностики современной холеры.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использован 151 штамм типичных токсигенных холерных вибрионов Эль Тор, выделенных от людей в Азербайджане (1970 — 1989 гг.), Грузии (1970 г.), Дагестане (1970 — 1973 гг.), Ставропольском крае (1970 — 1990 гг.), и 102 клинических изолята генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, выделенных в Дагестане (1993, 1994, 1998 гг.) и в Ставропольском крае (1994 г.). Морфологические, биохимические, серологические свойства, гемолитическую активность, подвижность данных штаммов холерных вибрионов изучали общепринятыми методами [1]. Детекцию фрагментов ДНК генов токсигенности и
генов, присущих биоварам Эль Тор или классическому, осуществляли соответственно в ПЦР тест-системе «Ген хол ctxA» (Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб») и с помощью разработанного нами набора реагентов для детекции V. cholerae O1 c определением Эль Тор или классического биовара и дифференциации на типичные токсигенные и генетически измененные Эль Тор биовары методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электорофорезным учетом результатов («Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ»).
РЕЗУЛЬТАТЫ
Из полученных данных следовало, что независимо от места и времени изоляции штаммы микроорганизмов, выделенные на Кавказе, являются грамотри-цательными, аспорогенными, полиморфными прямыми или слегка изогнутыми палочками, активно подвижными с одним полярно расположенным жгутиком, индофенолоксидазоположительными, ферментирующими глюкозу в аэробных и анаэробных условиях до кислоты (без газа), расщепляющими маннозу, сахарозу, маннит, не активными в отношении лактозы, арабинозы, дульцита, инозита, декарбоксилирующие лизин и орнитин, не обладающими аргининдегидролазой, агглютинирующимися холерной сывороткой О1 серогруппы и О-типовой Ogawa. И, таким образом, таксономически относятся к роду Vibrio семейства Vibrionaceae, виду Vibrio choleraе О1 серологической группы серовару Ogawа.
Вместе с тем, оказалось, что, если типичные токсигенные холерные вибрионы О1 серологической группы (выделенные в 1970 — 1990 гг.) фенотипически относились к биовару Эль Тор (устойчивы к 50 ЕД полимиксина В, агглютинировали эритроциты морской свинки, образовывали ацетилметилкарбинол в реакции Фогес-Проскауэра, лизировались диагностическим монофагом Эльтор II), то часть генетически измененных вариантов имели смешанные фенотипические свойства биовара Эль Тор и классического (табл. 1).
Из данных, представленных в табл. 1, следует, что гибридные штаммы холерных вибрионов Эль Тор по фенотипическим свойствам, определяющим биовар, подразделяются на варианты с типичными фенотипическими свойствами биовара (40 штаммов, или 41,3%) и варианты с атипичными по тому или иному фе-нотипическому признаку биовара (58 штаммов, или 48,7%).
В настоящее время в лабораторной диагностике холеры все определеннее приобретают вес молекулярно-генетические методы исследования, в частности, ПЦР, позволяющая детектировать фрагменты ДНК ключевых генов патогенности
Таблица 1. Фенотипические свойства, определяющие биовар, у токсигенных типичных и гибридных вариантов Эль Тор
Год, место выделения штаммов Vibrio сholerae O1 (n) Фенотипические тесты Биовар Эль Тор % штаммов
PB ЭМС VP Э11 C
1970—1989, Азербайджан (50) R + + + — типичный 100
1970, Грузия (10) R + + + — типичный 100
1970—1973, Дагестан (35) R + + + — типичный 100
1970—1975, Ставропольский край (56) R + + + — типичный 100
1993, 1994, 1998, Дагестан (98)
из них: (40) R + + + — типичный 41,3
(58) RS + — + — — — смешанный 48,7
Пакистан (5) S — — — + классический 100
Примечание. РВ — полимиксин В, 50 ЕД; ЭМС — эритроциты морской свинки, 2,5%; УР— реакция Фогес-Проскауэра; Э11 — диагностический бактериофаг эльтор II в ДРТ; С — диагностический бактериофаг классический в ДРТ.
Таблица 2. Результаты ПЦР-анализа при использовании набора реагентов «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» штаммов V. cholrae O1, выделенных от больных холерой на Кавказе с 1970 по 1998 гг.
Год, место выделения штаммов Vibrio с^1егае O1 (n) Реакционная смесь Результат
№ 1 № 2 Вариант Генотип
ctxBE1 186 п.н. rstRE1 501 п.н. rstC 224 п.н. ctxBa 186 п.н. rstRC1 501 п.н.
ОК —
ПК +классика — — — + + БК I (ctxBC1, rstRC1)
ПК +Эль Тор + + + — — БЭТ II (ctxBE1, rstRE1, rstC)
1970—1989, Азербайджан (50) + + + — — »—« II (ctxBE1, rstRE1, rstC)
1970, Грузия (10) + + + — — »—« II (ctxBE1, rstRE1, rstC)
1970—1973, Дагестан (35) + + + — — »—« II (ctxBE1, rstRE1, rstC)
1970—1990, Ставроп. край (56) + + + — — »—« II (ctxBE1, rstRE1, rstC)
1993, 1994, 1998, Дагестан (102)
из них: (77) — — + + + БЭГ III (ctxBC1, rstRC1, rstRE1, rstC)
(11) — — + + — »—« IV (ctxBC1, rstRE1, rstC)
(5) — — + + + »—« V (ctxBC1, rstRC1, rstC)
(9) — — — + + »—« VI (ctxBC1, rstRC1, rstRE1)
Примечание. БК — биовар классический, БЭТ — биовар Эль Тор типичный, БЭГ — биовар Эль
Тор гибридный.
типичного или гибридного варианта холерного вибриона в биоматериале больного или в объектах окружающей среды и охарактеризовывать (идентифицировать) выделенный микроорганизм на уровне генома. Эволюционные преобразования типичного токсигенного биовара Эль Тор в гибридный вариант сопровождались изменениями структуры генов коровой области профага CTXphi и профага RS1. В одном случае в геноме типичного биовара Эль Тор произошла замена гена ctxBE1 на ctxBc1 и появилась новая аллель гена rstR-rstRC1 при сохранении генов rstRE1 и rstC. Так появился вариант биовара эльтор, геном которого имеет профаги СТХиры и СТХс1ры. В другом случае в структуре СТХЕ1ры произошла замена ctxBE1 на ctxBc1 при сохранении генов rstRE1 и rstC или замена ctxBE1 на ctxBC1 при сохранении гена rstC, что свидетельствует об образовании варианта биовара Эль Тор с гибридным профагом СТХЕ1ры. Так образовались генотипы с различными комбинациями генов патогенности типичного Эль Тор и классического биоваров: rstRE1, rstC, ctxBa, rstRC1(III генотип); rstRE1, rstC, ctxBa (IV генотип); rstC, ctxBa,rstRC1 (V генотип); ctxBa, rstRC1, rstRE1 (VI генотип). Следует отметить, что геномы названных вариантов биовара Эль Тор обязательно содержат ген ctxBC1, кодирующий биосинтез энтеротоксина классического типа (СТ-1), что подтверждается результатами секвенирования: нуклеотидная последовательность этого гена в положениях 115 и 203 содержит цитозин, а аминокислотная последовательность В субъединицы энтеротоксина в положениях 39 и 68 содержит, соответственно, гистидин и треонин. Учитывая вышеизложенное, мы провели ПЦР-анализ штаммов V. cho1еrae O1, выделенных от больных холерой на Кавказе с 1970 по 1998 гг. с использованием набора реагентов «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ», результаты которого представлены в табл. 2.
Из данных табл. 2 следует, что штаммы изучаемых микроорганизмов, выделенные в 1970 — 1990 годах на Кавказе, в геноме содержат только гены ctxBE1, rstRE1, rstC, то есть являются типичными токсигенными холерными вибрионами биовара Эль Тор генотип II, а выделенные в 1993,1994 и 1998 гг. в Дагестане содержат в своем геноме гены биовара Эль Тор и классического биовара, то есть являются генетически измененными (гибридными) вариантами биовара Эль Тор (генотипы III, IV, V, VI).
4. ЖМЭИ 1 № 11
49
ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ фенотипических свойств генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, выделенных на Кавказе, показал, что гибридные варианты биовара Эль Тор по своим морфологическим, биохимическим, серологическим и гемолитическим свойствам не отличимы от таковых у типичных холерных вибрионов биовара Эль Тор, обусловивших эпидемиологические осложнения по холере в шестидесятые — начале девяностых годов ХХ столетия. Вместе с тем, у части гибридных штаммов фенотипические свойства, определяющие биовар, являются смешанными, т.е. характерными для биовара Эль Тор и классического, что делает невозможным отнести изучаемые штаммы холерных вибрионов ни к одному из них. Подобные штаммы с неопределенным биоваром обнаруживали в Индии и Бангладеш [12], Тайланде [9]. Таким образом, фенотипические тесты, традиционно применяющиеся для дифференциации V. cholerae O1 на классический или Эль Тор биовары, не позволяют идентифицировать штаммы гибридных вариантов биовара Эль Тор.
С учетом генетических особенностей и гибридных вариантов Эль Тор специалистами Российского научно-исследовательского противочумного института «Микроб» предложен набор реагентов для идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О1 классического и Эль Тор биоваров и дифференциации Эль Тор вибрионов на типичные и измененные методом мультилокусной полимеразной цепной реакции с электрофорезным учетом результатов «Ген Vibrio cholerae вариант ctxB-РЭФ» [4]. С помощью указанного набора при идентификации выделенной культуры холерного вибриона определяется О1 серогруппа (по гену rfbOl, 638 п.н.); биовар (классический по гену cas3, 415 п.н.; Эль Тор по гену rtxC, 265 п.н.); токсигенность (по генам rtxBCl , 189 п.н. или ctxBEl, 189 п.н.); типичность (типичный биовар Эль Тор — по сочетанию генов rfb01,638 п.н.+ rtxC, 265 п.н.+ ctxBEl, 189 п.н.); измененный биовар Эль Тор — rtxBCl , 189 п.н.+ rfb01,638 п.н.+ rtxC, 265 п.н.).
Таким образом, данная мультилокусная ПЦР обеспечивает определение серо-группы и дифференциацию биовара Эль Тор на типичные токсигенные и генетически измененные (гибридные) варианты. Однако тест-система лишь констатирует факт типичности или гибридности идентифицируемого штамма холерного вибриона, но никак не определяет генотип измененного варианта биовара Эль Тор, что снижает ее диагностическую ценность при эпидемиологическом отслеживании появления новых геновариантов в период течения эпидемии [4].
Наша разработка набора реагентов для выявления типичных токсигенных и гибридных вариантов биовара ЭльТор и генотипирования Vibrio cholerae O1 в биологическом и из объектов окружающей среды материале методом полимеразной цепной реакции «Гены Vibrio cholerae вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» основана на детекции фрагментов ДНК ключевых генов патогенности, специфичных для биовара Эль Тор — ctxBEl , кодирующего биосинтез СТ-2; rstREl (репрессор репликации фаговых частиц), rstC (антирепрессор rstR, генетический маркер биовара Эль Тор) и классического биовара (ctxBCl, кодирующего биосинтез СТ-1), rstRCl (репрессор репликации фаговых частиц), т.е. тех генов, которые претерпели изменения в процессе эволюционных преобразований генома типичного холерного вибриона биовара Эль Тор. С помощью этого набора впервые в России были обнаружены гибридные варианты биовара Эль Тор, явившиеся этиологическим фактором холеры Эль Тор в Дагестане в 1993, 1994, 1998 гг. [2]. Набор реагентов «Гены Vibrio cho1eraе вариант ctxB-rstR-rstC, РЭФ» позволяет не только констатировать типичность или гибридность холерных вибрионов, но и определять генотип измененного варианта биовара Эль Тор, что позволяет отслеживать динамику появления новых генотипов измененных вариантов биовара Эль Тор в период течения эпидемии холеры.
Проведенные исследования показали, что лабораторная диагностика холеры,
обусловленной генетически измененными (гибридными) вариантами холерного вибриона биовара Эль Тор, должна основываться на комплексном исследовании материала от людей или из объектов окружающей среды бактериологическим (в соответствие с действующей инструкцией) и генетическим методом с использованием ПЦР- анализа с целью детекции в биологическом материале и пробах из объектов окружающей среды фрагментов ДНК генов, определяющих биовар (классический или Эль Тор), идентификации токсигенных штаммов V. cholerae О1 с дифференциацией Эль Тор вибрионов на типичные и измененные, а также определения типа энтеротоксина, продуцируемого конкретным штаммом холерного вибриона (по наличии фрагменов ДНК генов ctxBEl или ctxBcl, кодирующих, соответственно, биосинтез СТ- 2 или СТ-1).
ЛИТЕРАТУРА
1. Лабораторная диагностика холеры. Методические указания. МУК 4.2.2218-07. М., 2007.
2. Савельев В.Н., Савельева И.В., Бабенышев Б.В. и др. Эволюция Vibrio cholerae eltor и обнаружение их гибридных вариантов на Кавказе. Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2011, 24: 86-92.
3. Савельева И.В., Савельева Е.И., Бабенышев Б.В. и др. Анализ фенотипических свойств генетически измененных (гибридных) вариантов биовара Эль Тор, выделенных на Кавказе. Холера и патогенные для человека вибрионы. Ростов-на-Дону, 2013, 26: 123129.
4. Смирнова Н.И., Агафонов Г.А., Заднова С.П. и др. Алгоритм идентификации токсигенных генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор. Журн. микро-биол. 2014, 2: 36-46.
5. Смирнова, Н.И., Заднова С.П., Шашкова А.П., Кутырев В.В. Вариабельность генома измененных вариантов Vibrio choleraе биовара Эль-Тор, изолированных на территории России в современный период. Молек. генетика, микробиол. и вирусол. 2011, 3: 1117.
6. Ansaruzzaman M., Bhuiyan N.A., Nair G.B. Cholera in Mozambique, variant of Vibrio cholerae. Emerg. Infect. Dis. 2004, 10: 2057-2059.
7. Grim C.J., Hasan N.A.,Taviani E. et al. Genome sequens of hybrid Vibrio cholera О1 MJ-1236, B-33, and CIRS 101 and cjmharative genomics with V. cholera. J. Bacteriol. 2010, 45: 29913000.
8. Das B., Halder K., Pal P, Bhadra R.K. Small chromosomal integration site ofclassical CTXprophage in Mozambique Vibrio cholerae O1 El Tor strain. Arch. Microbiol. 2007, 188: 677-683.
9. Na-Ubol M.. Srimanote P. et al. Hybrid El Tor variant biotypes ofVibrio cholera O1 in Thailand.
Indian. J. Med. Res. 2011, 133 (4): 387-394.
10. Nair G.B. New variants ofVibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes ofthe classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhes in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002, 40: 32963299.
11. Nair G.B., Qadri F., Holmgren J. et al. Vibrio cholera O1 hybrid El Tor strains Asia and Africa . J. Clin. Microbiol. 2006, 44: 3296-3299.
12. Raychoudhuri A., Patra T., Ramamurthy T. et al. Classical ctxB in Vibrio cholerae O1, Kalkata, India. Emerg. Infect. Dis. 2009, 15 (1): 131-132.
13. Safa A. Genomic relatedness of the new Matlab variants ofVibrio cholerae O1 to the classical and El Tor biotypes as determined by pulsed-field gel electrophoresis. J. Clin. Microbiol. 2005, 43: 1401-1404.
14. Safa A., Nair G.B., Kong R.Y.Q Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010, 18: 46-54
15. Siddique A.K., Nair G.B., Alam M. et al. Eltor cholera with severe disease a new threat to Asia and beuond. Epidemiol. Infect. 2010, 18: 46-54.
16. Weekly epidemiological record. 2011, 86 (31): 325-340.
Поступила 03.08.14
Контактная информация: Савельева Ирина Вилориевна, 355035, Ставрополь, ул. Советская, 13-15, р.т. (865-2) 26-48-19
