CC BY
21МОЛЕКУЛЯРНАЯ МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
Н.И.Смирнова, Д.А.Агафонов, С.П.Заднова, А.В.Черкасов, В.В.Кутырев
АЛГОРИТМ ИДЕНТИФИКАЦИИ ТОКСИГЕННЫХ ГЕНЕТИЧЕСКИ ИЗМЕНЕННЫХ ШТАММОВ VIBRIO CHOLERAE БИОВАРА ЭЛЬ ТОР
Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов
Цель. Разработка алгоритма идентификации генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор, обеспечивающего установление серогруппы, серовара и биовара исследуемого изолята на основе фено- и генотипических свойств, выявление генетически измененных штаммов возбудителя холеры Эль Тор, их дифференциацию по эпидемическому потенциалу, а также оценку вариабельности ключевых генов патоген-ности. Материалы и методы. Комплексный анализ 28 природных штаммов V. cholerae проводили с помощью традиционных микробиологических методов, ПЦР и фрагментарного секвенирования. Результаты. Разработан алгоритм идентификации токсигенных генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, включающий 4 этапа: определение серогруппы, серовара и биовара на основе фенотипических свойств, подтверждение серогруппы и биовара на основе молекулярно-генетических свойств, определение принадлежности штаммов к генетически измененным, дифференциация генетически измененных штаммов по их эпидемическому потенциалу и выявление полиморфизма ключевых генов патогенности ctxB и tcpA. Алгоритм основан на использовании традиционных микробиологических методов, ПЦР и секвенирования фрагментов генов. Заключение. Применение разработанного алгоритма повысит эффективность выявления генетически измененных вариантов возбудителя холеры Эль Тор, их дифференциацию по эпидемическому потенциалу и обеспечит установление полиморфизма генов, кодирующих ключевые факторы патогенности, для выяснения источника происхождения штаммов и возможных путей заноса инфекции.
Журн. микробиол., 2014, № 2, С. 36—46
Ключевые слова: Vibrio cholerae, геноварианты, патогенность, эпидемический потенциал, алгоритм
N.I.Smirnova, D.A.Agafonov, S.P.Zadnova, A.V.Cherkasov, V.V.Kutyrev
ALGORITHM OF TOXIGENIC GENETICALLY ALTERED VIBRIO CHOLERAE EL TOR BIO-VAR STRAIN IDENTIFICATION
Russian Research Institute of Plague Control «Microb», Saratov, Russia
Aim. Development of an algorithm of genetically altered Vibrio cholerae biovar El Tor strain identification that ensures determination of serogroup, serovar and biovar of the studied isolate based on pheno- and genotypic properties, detection of genetically altered cholera El Tor causative agents, their differentiation by epidemic potential as well as evaluation of variability of key pathogenicity genes. Materials and methods. Complex analysis of 28 natural V. cholerae strains was carried out by using traditional microbiological methods, PCR and fragmentary sequencing. Results. An algorithm of toxigenic genetically altered V. cholerae biovar El Tor strain identification was developed that includes 4 stages: determination of serogroup, serovar and biovar based on pheno-typic properties, confirmation of serogroup and biovar based on molecular-genetic properties, determination of strains as genetically altered, differentiation of genetically altered strains by their
epidemic potential and detection of ctxB and tcpA key pathogenicity gene polymorphism. The algorithm is based on the use of traditional microbiological methods, PCR and sequencing of gene fragments. Conclusion. The use of the developed algorithm will increase the effectiveness of detection of genetically altered variants of the cholera El Tor causative agent, their differentiation by epidemic potential and will ensure establishment of polymorphism of genes that code key patho-genicity factors for determination of origins of the strains and possible routes of introduction of the infection.
Zh. Mikrobiol. (Moscow), 2014, No. 2, P. 36-46
Key words: Vibrio cholerae, genovariants, pathogenicity, epidemic potential, algorithm ВВЕДЕНИЕ
Современный этап текущей 7 пандемии холеры характеризуется глобальным распространением в мире атипичных или генетически измененных штаммов Vibrio cholerae биовара Эль Тор О1 серогруппы, серовара Огава или Инаба с повышенной вирулентностью и резистентностью к антибиотикам. За последние 10 лет (2003 — 2012 гг.) было зарегистрировано более 2 млн больных холерой в 109 странах. Генетически измененные штаммы (геноварианты) впервые были изолированы в 1991 — 1994 гг. в Бангладеш от больных холерой с тяжелым клиническим течением. К настоящему времени геноварианты широко распространились во многих странах Азии, Африки и Америки, став причиной многочисленных эпидемий и вспышек [10]. Высокий уровень вирулентности и повышенный эпидемический потенциал геновариантов по сравнению с типичными штаммами обусловлены генетическими изменениями последних, появившимися в результате эволюции возбудителя. Одно из основных отличий этих штаммов состоит в разной структуре профага СТХф, несущего гены ctxAB, кодирующего биосинтез холерного токсина (ХТ) — ключевого фактора вирулентности, который несет ответственность за развитие основного клинического симптома при холере — диареи. Различие выражается в разной нуклеотидной последовательности гена ctxB, определяющего продукцию В-субъединицы ХТ. У типичных вибрионов Эль Тор в нуклеотидной последовательности гена ctxB в позиции 115 и 203 присутствует тимин (Т), тогда как у геновариантов — цитозин (С). Вследствие этого аллель указанного гена у типичных штаммов обозначена как ctxBEl (или ctxB3), у геновариантов — ctxBClass (или ctxB1) [9].
К настоящему времени стало известно, что геноварианты различаются между собой по структуре ключевых генов, связанных с вирулентностью или адаптацией к меняющимся условиям окружающей среды. Если в начале 90-х годов прошлого столетия характерным генетическим признаком геновариантов было наличие в геноме их профага гена ctxB1, приобретенного V. cholerae биовара Эль Тор от V. cholerae классического биовара через горизонтальный перенос, то в последнее десятилетие возникли новые варианты возбудителя холеры, содержащие дополнительные изменения в генах вирулентности и/или жизнеобеспечения [8]. Так, в 2007 г. были обнаружены геноварианты, несущие в гене ctxB1 дополнительную мутацию — замену цитозина на аденин в положении 58. Новый аллель гена ctxB был обозначен как ctxB7 [7]. Кроме того, начиная с 2001 г., стало известно о геновариантах, содержащих в гене tcpA, кодирующем основной белок токсин-корегулируемых пилей или ТКП (второго ключевого фактора вирулентности, определяющего способность вибрионов колонизировать тонкий кишечник человека), одну нуклеотидную замену, а именно в положении 266 аденин был заменен на гаунин (A/G). Новый аллель гена tcpA был обозначен как tcpETCIRS [6]. И, наконец, в 2004 — 2011 гг. были описаны генетически измененные штаммы, имею-
щие протяженную делецию в острове пандемичности \БР-П, который, видимо, обеспечивает высокий уровень адаптации вибрионов к меняющимся условиям окружающей среды [11]. Следует особо отметить тот факт, что новые геновари-анты, содержащие протяженную делецию в \БР-П, к настоящему времени вытеснили ранее возникшие генетически измененные штаммы во многих эндемичных по холере очагах, что указывает на снижение эпидемического потенциала последних. Глобальное распространение новых геновариантов в странах Южной Азии (Шри-Ланка, Пакистан, Индия, Непал, Афганистан), Африки (Камерун, Нигерия, Южная Африка) и Америки (Гаити) свидетельствует об их высоком эпидемическом потенциале [10]. Характерными генетическими признаками таких штаммов является наличие в их Л^Р-П делеции протяженностью 13105 п.н., захватывающей сегмент ДНК, включающий 21 ген из 30 известных, что отличает эти изоляты от геновариантов, обнаруженных в более ранний период (1991 — 2001 гг.). В этой связи, дифференциация штаммов геновариантов, различающихся по эпидемическому потенциалу, представляет важную задачу.
Все типы геновариантов вызывают более тяжелое клиническое течение инфекции по сравнению с типичными изолятами, что связано с повышенной продукцией ими ХТ, характерного для V. еИо1егае классического биовара [8]. Вместе с тем, не исключено, что изменение у новых геновариантов аминокислотной последовательности В-субъединицы ХТ и ТКП (вследствие замен в нуклеотидных последовательностях генов е1хВ и 1ерА), непосредственно взаимодействующих с определенными рецепторами чувствительных эукариотических клеток, также могут влиять на вирулентность холерных вибрионов. Следовательно, выявление полиморфизма генов, обусловленного нуклеотидными заменами и приводящего к изменению структуры функционально значимых факторов патогенности, может иметь прогностическое значение, позволяющее определять риск развития тяжелого течения инфекции. Более того, указанная нуклеотидная замена в гене 1ерА, характерная для новых вариантов, может быть использована в качестве дополнительного генетического маркера таких штаммов.
Существующая комплексная система лабораторной диагностики холеры базируется на морфологических, биохимических, серологических и генетических свойствах типичных штаммов V. еИо1егае. Не утратив своего значения в настоящее время, эта система не позволяет: 1) идентифицировать генетически измененные штаммы V. еИо1егае биовара Эль Тор; 2) дифференцировать геноварианты по их эпидемическому потенциалу; 3) оценивать внутривидовую вариабельность ключевых генов патогенности е1хВ и 1ерА, которая может влиять на тяжесть клинических проявлений инфекции; 4) определять генетические связи между природными изолятами геновариантов, выделенными на разных территориях, для выяснения источника их происхождения. В этой связи, представляется актуальным разработка алгоритма идентификации генетически измененных штаммов V. еИо1егае биовара Эль Тор. Использование единого алгоритма работы обеспечит надежность идентификации выделенных штаммов возбудителя холеры, установления их эпидемического потенциала для выявления источника этих изолятов и определения путей заноса инфекции на основе их фенотипических и молекулярно-генетических особенностей. Представленный в работе алгоритм идентификации геновариантов возбудителя холеры основан на использовании простых и эффективных методов, включающих традиционные микробиологические тесты, разработанные нами ранее мультилокусные ПЦР тест-системы, а также мультилокусное секвенирование фрагментов генома исследуемых штаммов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В работе использовано 28 клинических штаммов V. сИо1егае (4 изолята относились к V. сИо1егае классического биовара, 10 — к типичным штаммам V. сИо1егае биовара Эль Тор и 14 — к генетически измененным штаммам V. сИо1егае биовара Эль Тор), выделенных в Российской Федерации и сопредельных странах в разные годы (табл. 1). Все работы, связанные с культурами V. сИо1егае, проводили в соответствии с СП 1.3.1285-03 «Безопасность работы с микроорганизмами I — II групп патогенности (опасности)». Штаммы выращивали на агаре LB (рН 7,2) при 37 °С. Выделение ДНК осуществляли методом нуклеосорбции на силикагеле в присутствии гуанидинтиоцианата с использованием коммерческого набора «ДНК-сорб В».
Таблица 1. Результаты идентификации штаммов V. Ло1егае О1 биовара Эль Тор согласно 1 и 2 этапам алгоритма
Штаммы V. сИо1егае (согласно 1 этапу алгоритма)
Год выделения
Реакционная смесь № 1 Реакционная смесь № 2
сж3 с1хВ1 гйЮ ГхС с1хВ3
415 п.н. 189 п.н. 638 п.н. 265 п.н. 189 п.н.
Штаммы V. сИо1егае (согласно 2 этапу алгоритма)
* 569В Инаба 1950 + + + — — * V. сИо1егае О1
* Дакка 35 Огава 1958 + + + — — * V. сИо1егае О1
* J-89 Инаба 1958 + + + — — * V. сИо1егае О1
* М-29 Огава 1942 + + + — — * V. сИо1егае О1
М-1259 Огава 1990 — — + + + Т V. сИо1егае О1
С-402 Огава 1990 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-736 Инаба 1970 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-1013 Инаба 1972 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-641 Инаба 1975 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-1261 Огава 1993 — — + + + Т V. сИо1егае О1
С-447 Огава 1990 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-818 Инаба 1970 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-890 Инаба 1970 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-738 Инаба 1970 — — + + + Т V. сИо1егае О1
М-1264 Огава 1993 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1266 Огава 1993 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1293 Огава 1994 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1272 Огава 1993 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1326 Огава 1998 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1269 Огава 1994 — + + + — И V. сИо1егае О1
Р-15384 Огава 1991 — + + + — И V. сИо1егае О1
Р-18899 Инаба 2006 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1429 Инаба 2004 — + + + — И V. сИо1егае О1
М-1430 Инаба 2005 — + + + — И V. сИо1егае О1
Л3225 Огава 2010 — + + + — И V. сИо1егае О1
Л3226 Огава 2010 — + + + — И V. сИо1егае О1
Л4150 Огава 2010 — + + + — И V. сИо1егае О1
301 Инаба 2011 — + + + — И V. сИо1егае О1
Примечание. + Наличие гена, — отсутствие. * Классический биовар, без * Эль Тор биовар, Т — типичный штамм, И — измененный штамм. Использован набор «Ген V. сИо1егае вариант йхВ РЭФ».
ПЦР для второго этапа алгоритма проводили в объеме 25 мкл в двух реакционных смесях; реакционная смесь Class содержала: 9,7 мкл ПЦР-смеси-3 (10х ПЦР-буфер, рН 8,4, содержащий BSA, 25мМ раствор MgCl2, H2O), 5 мкл пЦр-смеси-olass (2 мМ дНТФ, смесь праймеров rfbO-F, rfbO-R, cas3-F, cas3-R, Fw-con и Rv-class, H2O), 0,3 мкл Taq-полимеразы; реакционная смесь Eltor содержала: 9,7 мкл ПЦР-смеси-3 (10х ПЦР-буфер, содержащий BSA (рН 8,4), 25 мМ раствор MgCl2, H2O), 5 мкл ПЦР-смеси-eltor (2 мМ дНТФ, смесь праймеров rfbO-F, rfbO-R, rtxC-F, rtxC-R, Fw-con и Rv-eltor, H2O), 0,3 мкл Taq-полимеразы. ПЦР для третьего этапа алгоритма проводили в объеме 25 мкл; реакционная смесь содержала 2,5 мкл 10х пЦР-буфера (рН 8,4), 2,5 мкл 2 мМ дНТФ, 2,5 мкл 25мМ MgCl2, по 6 пмоль праймеров, 0,3 мкл Taq-полимеразы, деионизованной воды до конечного объема 15 мкл в расчете на одну реакцию. Полученные ПЦР продукты анализировали в 2% агарозном геле с добавлением 0,5 мкг/мл бромида этидия при напряжении 10 В/см.
Нуклеотидную последовательность генов определяли на генетическом анализаторе «CEQ 8000» (Beckman Coulter) по методике производителя. Расчет праймеров проводили с помощью программы Oligo 6.0, сравнительный анализ ну-клеотидных последовательностей осуществляли с использованием базы данных NCBI GenBank.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Разработанный нами алгоритм включает два этапа идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор, их дифференциацию по эпидемическому потенциалу и выявление полиморфизма ключевых генов патогенности.
Первый этап — определение серогруппы, серовара и биовара выделенного изолята на основе его фенотипических свойств (табл. 1).
Для определения серогруппы и серовара используют объемную реакцию агглютинации с холерными диагностическими антисыворотками О1, Огава, Инаба, РО, а также с холерной диагностической антисывороткой О139. При агглютинации не менее чем до 1/2 диагностического титра с О1 антисывороткой и одной из двух серовароспецифических антисывороток Инаба или Огава выделенный изо-лят идентифицируют как V. cholerae О1 серогруппы Инаба или Огава серовара [1].
Биовар изолята определяют, используя четыре традиционных микробиологических теста: реакцию агглютинации с куриными эритроцитами, реакцию Фогес-Проскауэра (образование ацетилметилкарбинола), определение чувствительности к полимиксину (50 ед./мл) и выявление чувствительности к холерным диагностическим бактериофагам классическому и Эль Тор [1]. Если регистрируются положительные реакции гемагглютинации и Фогес-Проскауэра и клетки штамма резистентны к полимиксину, но чувствительны к бактериофагу Эль Тор, то тестируемый изолят принадлежит к биовару Эль Тор.
Таким образом, на первом этапе идентификации по фенотипическим свойствам определяется принадлежность штамма V. cholerae к О1 серогруппе, серова-ру Инаба или Огава и биовару Эль Тор. Используются традиционные микробиологические методы.
Второй этап — подтверждение серогруппы и биовара изолята и определение его принадлежности к генетически измененным штаммам V. cholerae биовара Эль Тор посредством мультилокусной ПЦР (табл. 1).
В связи с изменчивостью фенотипических дифференциальных признаков принадлежность штамма к О1 серогруппе и Эль Тор биовару подтверждают методом мультилокусной ПЦР. В качестве мишени для амплификации в ПЦР в двух
реакционных смесях используют фрагмент гена О1 антигена rfbO, встречающегося у V. cholerae только O1 серогруппы, a также фрагменты двух биоварспецифи-ческих генов cas3 и rstC. Ген cas3 (CRISPR — associated gene), кодирующий хели-казу и входящий в состав CRISPR (Clusterd Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)-системы, имеется только у холерных вибрионов классического биовара, тогда как ген rtxC, участвующий в биосинтезе RTX-токсина, встречается лишь у возбудителя холеры Эль Тор [3]. Если в ПЦР образуются два фрагмента размером 638 п.н. и 265 п.н., соответствующие генам rfbO и rtxC, но отсутствует ампликон гена cas3 (415 п.н.), то тестируемый штамм действительно относится к О1 серо-группе и Эль Тор биовару [2, 3]. Эта же мультилокусная ПЦР обеспечивает выявление генетического варианта возбудителя холеры Эль Тор на основе идентификации нуклеотидной замены в гене ctxB (T/C в положении 203) при амплификации с аллель-специфичными праймерами, содержащими и не содержащими указанную замену. Образование в результате ПЦР с праймером, содержащим нуклеотидную замену, фрагмента размером 189 п.н., соответствующего мутантному аллелю гена ctxB, а именно аллелю ctxBClass (ctxB1), характерному для V. cholerae классического биовара, указывает на принадлежность исследуемого изолята к геновариантам возбудителя. Использованные специфические прайме-ры приведены в табл. 2.
Таким образом, использование мультилокусной ПЦР обеспечивает надежное определение серогруппы и биовара исследуемого штамма. По размерам образуемых в ПЦР фрагментов генов rfbO, характерных только для О1 серогруппы, а также биовароспецифических генов cas3 и rtxC подтверждается принадлежность штаммов к О1 серогруппе и биовару Эль Тор.
Третий этап — дифференциация геновариантов с различным эпидемическим потенциалом.
Как указывалось выше, новые геноварианты V. cholerae биовара Эль Тор с высоким эпидемическим потенциалом отличаются от ранее возникших вариантов, к настоящему времени утративших такой эпидемический потенциал, присутствием протяженной делеции в центральном районе острова пандемичности VSP-II, определяющего, видимо, адаптацию возбудителя к меняющимся условиям окружающей среды. В этой связи, для дифференциации штаммов геновариантов с разным эпидемическим потенциалом используют вариабельность генома острова пандемичности VSP-II. У всех штаммов новых геновариантов, имеющих высокий эпидемический потенциал, VSP-II содержит делецию размером 13 105 п.н., включающую гены vc0495 — vc0512. У всех ранее возникших штаммов геновариантов с низким эпидемическим потенциалом эта делеция отсутствует. Для выявления протяженной делеции используют метод мультилокусной ПЦР с двумя парами праймеров, фланкирующими фрагменты генов vc0497 и vc0502, которые отсутствуют в VSP-II только новых вариантов, имеющих высокий эпидемический потенциал, а также с парой праймеров, комплементарных фрагменту сохранившегося гена vc0514, общего для всех типов этого острова пандемичности [5]. При образовании в ПЦР трех фрагментов размером 761 п.н., 604 п.н. и 320 п.н. тестируемый штамм идентифицируют как геновариант V. cholerae биовара Эль Тор с низким эпидемическим потенциалом. Образование только одного фрагмента размером 604 п.н., соответствующего общему гену vc0514, указывает на наличие в VSP-II протяженной делеции и позволяет идентифицировать штамм как новый геновариант V. cholerae биовара Эль Тор с высоким эпидемическим потенциалом. Использованные специфические праймеры приведены в табл. 2.
Таким образом, использование вариабельности острова пандемичности VSP-II обеспечивает дифференциацию исследуемых штаммов геновариантов по их эпидемическому потенциалу. Разделение штаммов V. cholerae с разным эпидеми-
ческим потенциалом проводится с помощью простого и быстрого метода — муль-тилокусной ПЦР. Использование трех ДНК-локусов (vc0497, vc0502, vc0514), расположенных в разных участках VSP-II, обеспечивает надежность дифференциации штаммов с высоким и низким эпидемическим потенциалом.
Четвертый этап — выявление полиморфизма генов ctxB и tcpA методом сек-венирования.
Для выявления полиморфизма ключевых генов патогенности ctxB и tcpA определяют их нуклеотидную последовательность и сравнивают с таковой референтных штаммов, представленной в базе данных GenBank. При обнаружении в последовательности гена ctxBl, кроме двух несинонимичных замен в положениях 115 (T/C) и 203 (T/C), характерных для холерного вибриона классического биовара и референтных генетически измененных штаммов холерных вибрионов Эль Тор, дополнительной замены нуклеотидного основания цитозина (C) на аде-нин (A) в позиции 58, тестируемый ген идентифицируют как ctxB7. В результате этой нуклеотидной замены в последовательности белка происходит аминокислотная замена аспарагина на гистидин в позиции 20.
Если в нуклеотидной последовательности гена tcpAEt имеется замена аденина на гуанин (A/G) в позиции 266, то изучаемый штамм несет аллель гена tcpA, обозначенный как tcpETCIRS [6]. Эта замена является также несинонимичной и приводит к замене аминокислотной последовательности белка TcpA (аспарагина на серин в позиции 89).
Таким образом, установление методом секвенирования нуклеотидных замен в ключевых генах патогенности ctxB и tcpA, участвующих в биосинтезе ХТ и ТКП, позволяет выявлять их полиморфизм, который может быть причиной более тяжелого клинического течения инфекции.
Для определения эффективности разработанного алгоритма было исследовано 28 клинических штаммов, из которых 4 изолята относились к V. cholerae классического биовара, 10 — к типичным штаммам V. cholerae биовара Эль Тор и 14 — к генетически измененным штаммам V. cholerae биовара Эль Тор.
Согласно результатам первого этапа исследований все взятые штаммы относились к О1 серогруппе, Огава или Инаба сероварам; 4 изолята были класси-
Таблица 2. Праймеры, использованные в мультилокусных ПЦР
Ген
Праймер
Нуклеотидная последовательность (5'—3')
Размер фрагмента
Источник литературы
cas3 cas3-F CAGCAGGTAAAAGGTGTAGTG 415 п.н. [3]
cas3-R CGCATTTCCTCGCTTATCATC
rfbO1 rfbO1-F CCCCGAAAACCTAATGTGAG 638 п.н. [5]
rfbO1-R TCTATGTGCTGCGATTGGTG
rtxC rtxC-F CGACGAAGATCATTGACGAC 265 п.н. [4]
rtxC-R CATCGTCGTTAATGTGGTTGC
ctxB Fw-con ACTATCTTCAGCATATGCACATGG 189 п.н. [8]
Rv-class CCTGGTACTTCTACTTGAAACG
Rv-eltor CCTGGTACTTCTACTTGAAACA
vc0497 VSPIIregF TGGAAAGAAGAGCGTTACTGC 320 п.н. [9]
VSPIIregR CCCTGTTGATGATGTGATTTG
vc0502 VSPIIpilinF CTGTGATTCGGGCTTTATCGG 761 п.н. [9]
VSPIIpilinR GCGTAAACTGAGCCAATAAGC
vc0514 VSPIIchemF CTTGATGGAGCGGAGAAAAC 604 п.н. рассчит.
VSPIIchemR CGATGAATAGCCTGTTGAAC авт.
Рис. 1. Электрофорез ПЦР продуктов генов г!Ю1, cas3, И:хС, ctxBEt и ctxBClass в 2 % агарозном геле.
1, 2 — V. еИо1егае Дакка 35; 3, 4 — V. еИо1егае М-1259; 5, 6 — V. еИо1егае М-1266; 7, 8 — V. еИо1егае Р-15384; 9, 10 — V. еИо1егае Р-18899; 11, 12 — V. еИо1егае 569В; 13, 14 — V. еИо1егае М818; 15 — отрицательный контроль.
ческого биовара, 24 — биовара Эль Тор. Принадлежность штаммов к О1 серо-группе, а также их биовар, определенный по фенотипическим свойствам, полностью подтверждены методом мультилокусной ПЦР (2 этап алгоритма). Список используемых праймеров и условия проведения этой ПЦР приведены в [2]. У всех исследуемых штаммов присутствует ампликон размером 638 п.н., свидетельствующий об их принадлежности к О1 серогруппе. Среди них 4 изолята относятся к классическому биовару, так как у них происходит амплификация фрагментов ДНК размером 415 п.н. в реакционной смеси №1, что свидетельствует о присутствии в их геноме специфического для этого биовара гена еав3 (табл.
2, рис. 1, дорожки 1, 11). Между тем у 24 штаммов V. еИо1егае при ПЦР-анализе наблюдалась иная картина. В их геноме присутствует специфический для биовара Эль Тор ген г1хС, выявляемый с помощью реакционной смеси №2, поскольку во всех случаях формировался ампликон размером 265 п.н., что указывает на их принадлежность к холерным вибрионам биовара Эль Тор (табл. 2, рис. 1, дорожки 4, 6, 8, 10, 14). При этом 10 изолятов относятся к типичным токсигенным штаммам V. еИо1егае О1 биовара Эль Тор, так как для них характерно наличие ампликона размером 189 п.н в реакционной смеси № 2, указывающего на присутствие в их геноме гена е1хВ3 (табл. 2, рис. 1, дорожки 2, 14). В то же время, у 14 изолятов обнаружено присутствие гена е1хВ классического типа (е1хВ1), о чем свидетельствует образование ампликона размером 189 п.н. со специфическими праймерами Fw-con и Rv-c1ass в реакционной смеси № 1 (табл. 2, рис. 1, дорожки 3, 5, 7, 9).
Таким образом, первые два этапа алгоритма, включающие комплекс простых и эффективных микробиологических и молекулярно-генетических методов, действительно позволяют надежно не только определить серогруппу, серовар и био-вар исследуемых штаммов, но и дифференцировать штаммы V. еИо1егае биовара Эль Тор на типичные и генетически измененные, несущие в профаге ген е1хВ классического типа (е1хВ1).
Результаты третьего этапа алгоритма, направленные на дифференциацию генетически измененных штаммов V. еИо1егае биовара Эль Тор по их эпидемическому потенциалу, представлены в табл. 3 и на рис. 2. Оказалось, что из 14 выявленных геновариантов 7 несут интактный VSP-П, так как при постановке мультилокусной ПЦР образуются три ампликона, соответствующие генам vc0497 (320 п.н.), vc0502 (761 п.н.) и vc0514 (604 п.н.). Таким образом, эти 7 штаммов относятся к ранее возникшим геновариантам холерных вибрионов биовара Эль Тор, которые к настоящему времени заметно снизили свой эпидемический потенциал. При исследовании других 7 штаммов образовывался один ампликон, соответ-
ствующий гену уе0514, что ука- Таблица 3. Результаты дифференциации генети-зывает на наличие протяженной чески измененных штаммов V. сЬо1е-
делеции в VSP-II и, соответ- гае О1 биоваРа Эль ТоР с Разным
ственно, на принадлежность ыт^ышм^тщьлш методом
мультилокусной ПЦР
этих штаммов к новым генова-риантам V. еИо-1егае биовара Эль Тор, имеющим высокий эпидемический потенциал.
Таким образом, на третьем этапе исследования по наличию или отсутствию протяженной делеции в острове пандемично-сти VSP-II были дифференцированы геноварианты V. еИо-1егае биовара Эль Тор, имеющие разный эпидемический потенциал.
Для выявления полиморфизма генов е1хВ и 1ерА, участвующих в биосинтезе ключевых факторов патогенности — ХТ и ТКП, было проведено их сек-венирование (четвертый этап алгоритма). В результате проведенного анализа нуклеотид-ной последовательности гена е1хВ у изучаемых геновариантов полученных данных в последовательности гена е1хВ у всех 14 изолятов обнаружены две ну-клеотидные замены тимина (Т) на цитозин (С) в положениях 115 и 203, что указывает на присутствие в их геноме е1хВс1а!® (е1хВ1). Вместе с тем, в последовательности гена е1хВ 3 штаммов была выявлена дополнительная однонуклеотидная замена: в положении 58 цитозин был заменен на аденин. Из этого следует, что в геноме профага этих штаммов присутствует аллель е1хВ7.
При определении нуклеотидной последовательности второго ключевого гена патогенности 1ерА у исследуемых геновариантов показано, что 9 штаммов несут последовательность 1ерА, идентичную таковой референтного штамма V. еИо1егае N16961 биовара эльтор. Однако у других 7 штаммов в гене 1ерА была обнаружена
Штамм Тестируемые гены УВР-Н Тип \ВР-П* Эпидемический потенциал**
уе0497 уе0502 уе0514
М-1264 + + + П Н
М-1266 + + + П Н
М-1293 + + + П Н
М-1272 + + + П Н
М-1326 + + + П Н
М-1269 + + + П Н
Р-15384 + + + П Н
Р-18899 — — + Д В
М-1429 — — + Д В
М-1430 — — + Д В
Л3225 — — + Д В
Л3226 — — + Д В
Л4150 — — + Д В
301 — — + Д В
Примечание. *П — прототипный, Д — с
протяженной делецией, + наличие гена , — отсут-
ствие; **Н — низкий, В - - высокий.
Рис. 2. Результаты определения типа VSP-II у различных генетически измененных штаммов V. сМегае О1 биовара Эль Тор, полученные с помощью мультиплексной ПЦР.
1 — V. еИо1егае М-1264, 2 — V. еИо1егае М-1266, 3 — V. еИо1егае М-1293, 4 — V. еИо1егае М-1272, 5 — V. еИо1егае М1326, 6 — V. еИо1егае М-1269, 7 — V. еИо1егае Р-15384, 8 — V. еИо1егае М-1429, 9 — V. еИо1егае М-1430, 10 — V. еИо1егае Р-18899, 11 — V. еИо1егае Л3225, 12 — V. еИо1егае Л3226, 13 — V. еИо1егае Л4150, 14 — V. еИо1егае 301.
однонуклеотидная замена аденина на гуанин (A/G) в позиции 266, что указывает о наличии в геноме этих штаммов аллеля topET^1^.
Таким образом, данные, полученные при выполнении этого этапа алгоритма, указывают на полиморфизм генов, участвующих в биосинтезе ключевых факторов патогенности.
ОБСУЖДЕНИЕ
К настоящему времени вполне очевидно, что основное событие на современном этапе эволюции возбудителя холеры — образование новых высокопатогенных геноварантов V. cholerae биовара Эль Тор и вытеснение ими типичных штаммов, вызывавших эпидемии холеры на протяжении 30 лет (1961 — 1991 гг.). Возникновение новых геновариантов связано в основном с приобретением типичными штаммами V. cholerae биовара Эль Тор отдельных генов (ctxB1) вирулентности от возбудителя азиатской холеры (V. cholerae классического биовара) за счет горизонтального переноса генетической информации. Более того, было обнаружено, что ранее возникшие геноварианты продолжают претерпевать различные генетические изменения. В последнее десятилетие сформировались различные типы геновариантов, несущих дополнительные мутации в ключевых генах вирулентности и/или жизнеобеспечения. При этом на многих эндемичных по холере территориях произошла замена ранее лидирующего геноварианта на недавно сформировавшийся геновариант с обновленной структурой генов вирулентности и жизнеобеспечения. В результате этих событий в современный период 7 пандемии холеры во многих эндемичных по холере очагах циркулируют различные геноварианты, отличающиеся друг от друга по структуре генов вирулентности и/ или жизнеобеспечения, а также по эпидемическому потенциалу. Такая ситуация указывает на необходимость не только идентификации геновариантов возбудителя холеры, но и определения эпидемического потенциала для прогнозирования эпидемического процесса.
Нами разработан алгоритм идентификации генетически измененных штаммов возбудителя холеры, включающий 4 этапа. Использование алгоритма позволяет: а) достоверно определять серогруппу, серовар и биовар выделенного изолята на основе фено- и генотипических свойств; б) идентифицировать генетически измененные штаммы методом ПЦР; в) выявлять геноварианты возбудителя с разным эпидемическим потенциалом с помощью мультилокусной ПЦР; г) выявлять полиморфизм ключевых генов патогенности ctxB и tcpA методом секвенирования.
Предлагаемый нами алгоритм был проверен на 28 штаммах V. cholerae классического и Эль Тор биоваров и показал высокую эффективность при идентификации генетически измененных вариантов биовара Эль Тор, дифференциации их по эпидемическому потенциалу и определении полиморфизма ключевых генов патогенности. Разработанный алгоритм обеспечивает получение стандартизированных молекулярно-генетических свойств штаммов холерных вибрионов, выделенных от больных холерой или из различных объектов окружающей среды на территории России. Его использование повысит эффективность анализа эпидемических вспышек или отдельных случаев инфекции с установлением происхождения штамма и возможных путей заноса инфекции.
Алгоритм идентификации генетически измененных штаммов V. cholerae биовара Эль Тор предназначен для специалистов референс-центра по мониторингу за возбудителем холеры, Национальных центров верификации диагностической деятельности, а также государственных коллекций Роспотребнадзора, проводящих молекулярно-генетический и молекулярно-эпидемиологический анализ штаммов V. cholerae. Этот алгоритм также может быть использован исследователями, занимающимися проблемами эволюции возбудителя холеры и выявлением
молекулярно-генетических особенностей клинических штаммов, завезенных на территорию России, а также штаммов, выделенных из объектов окружающей среды.
Работа выполнена в рамках Гранта РФФИ№12-04-00285 и по ГК№53-Д от 04.06.2012 г. в рамках реализации ФЦП «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009 — 2013 г.)».
Л ИТЕРАТУРА
1. Методические указания «Лабораторная диагностика холеры». МУК 4.2.2218-07. М., Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007.
2. Смирнова Н.И., Горяев А.А., Шубина А.В. и др. Способ идентификации токсигенных штаммов V. cholerae O1, определения их биовара и дифференциации штаммов биовара эльтор на типичные и измененные методом мультиплексной полимеразной цепной реакции, и тест-система для его осуществления. Патент РФ №2458141, опубликован 05.03.2012.
3. Шашкова А.В., Горяев А.А., Смирнова Н.И. Строение и функциональная роль CRISPR-системы бактерий. Проблемы особо опасных инфекций. 2011, 2 (108): 49-52.
4. Chow K.H., Ng T.K., Yuen K.Y, Yam WC. Detection of RTX toxin gene in Vibrio cholerae by PCR. J. Clin. Microbiol. 2001, 39: 2594-2597.
5. Goel A.K., Ponmariappan S., Kamboj D.V., Singh L. Single multiplex polymerase chain reaction for environmental surveillance of toxigenic-pathogenic O1 and non-O1 Vibrio cholerae. Folia Microbiol. (Praha). 2007, 52: 81-85.
6. Grim C.J., Hasan N.A., Taviani E. et al. Genome Sequence of Hybrid Vibrio cholera O1 MJ-1236, B-33, and CIRS101 and comparative genomics with V. cholerae. J. Bacteriol. 2010, 192 (13): 3524-3533.
7. Kumar P., Jain M., Goel A.K. et al. A large cholera outbreak due to a new cholera toxin variant of the Vibrio cholerae O1 El Tor biotype in Orissa, Eastern India. J. Med. Microbiol. 2009, 58: 234-238.
8. Morita M., Ohnishi M., Arakawa E. et al. Development and validation of a mismatch amplification mutation PCR assay to monitor the dissemination of an emerging variant of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor. Microbiol. Immunol. 2008, 52: 314-317.
9. Nair G.B., Faruque S.M., Bhuiyan N.A. et al. New Variants of Vibrio cholerae O1 biotype El Tor with attributes of the classical biotype from hospitalized patients with acute diarrhea in Bangladesh. J. Clin. Microbiol. 2002, 40 (9): 3296-3299.
10. Safa A., Nair G.B., Kong R.YC. Evolution of new variants of Vibrio cholerae O1. Trends Microbiol. 2010, 18: 46-54.
11. Taviani E., Grim C.J., Choi J. et al. Discovery of novel Vibrio cholerae VSP-II genomic islands using comparative genomic analysis. FEMS Microbiol Lett. 2010, 308 (2): 130-137.
Поступила 18.06.13
Контактная информация: Смирнова Нина Ивановна, д.б.н., проф., 410005, Саратов, Университетская,46, р.т. (8452)26-47-23
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014
А.С.Водопьянов, А.Б.Мазрухо, С.О.Водопьянов, Б.Н.Мишанькин, В.Д.Кругликов, И.В.Архангельская, И.П.Олейников, Д.А.Зубкова, Е.В.Монахова, Л.В.Григоренко
VNTR-ГЕНОТИПИРОВАНИЕ штаммов vibrio cholerae, выделенных из ОБЪЕКТОВ ВНЕШНЕЙ СРЕДЫ НА ТЕРРИТОРИИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ В 2012 ГОДУ
Ростовский научно-исследовательский противочумный институт, Ростов-на-Дону
Цель. VNTR-типирование штаммов холерных вибрионов, выделенных на территории Российской Федерации в 2012 году. Материалы и методы. В работе использован 71 штамм Vibrio cholerae O1 и 3 штамма V. cholerae не O1/O139. Генотипирование проводили при
