CC BY
8УДК 577.3
М.Х. Тикра, А.М. Джафарова, Н.К. Кличханов, И.С. Мейланов
Тепловая денатурация ацетилхолинэстеразы синаптических мембран
из мозга крыс
Дагестанский государственный университет, meylanovis@mail. ru
Исследована кинетика тепловой денатурации ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс. Кинетика соответствует двум экспоненциальным стадиям, которые отличаются по энергиям активации. Глицерин в концентрации 2 % повышает термостабильность фермента и увеличивает относительный вклад медленной стадии.
Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, синаптические мембраны, мозг, тепловая денатурация, глицерин.
The kinetics of thermal denaturation of acetylcholinesterase of synaptic membranes of rat brain was investigated. Kinetics corresponds to the two exponential stages, which differ in the activation energy. Glycerol concentration of 2 % increases the thermal stability of the enzyme and increases the relative contribution of slow phase.
Keywords: acetylcholinesterase, synaptic membranes, brain, thermodenaturation, glycerol.
Температурная стабильность белков - классический предмет исследований молекулярной биофизики [1]. Изменения первичной структуры, химическая модификация, взаимодействия с лигандами и с надмолекулярными структурами влияют на термостабильность биополимеров, и поэтому количественные характеристики термостабильности белков широко используются для выяснения механизмов их функционирования.
Ацетилхолинэстераза (АХЭ) нейронов головного мозга - синаптический фермент, расположенный на внешней поверхности постсинаптической мембраны холинэргических синапсов и регулирующий временной профиль концентрации медиатора ацетилхолина в си-наптической щели. АХЭ играет важную роль в поддержании многих функций головного мозга и является мишенью при лечении различных заболеваний мозга [2]. В работе Shin с сотр. [3] было показано, что липосомы из смеси димиристоилфосфатидилхолина и дансилфосфатидилэтаноламина катализируют тепловую денатурацию солюбилизирован-ной формы АХЭ из яда змеи Bungarus fasciatus. Это означает, что взаимодействие АХЭ с липосомами дестабилизирует структуру фермента. Как влияет взаимодействие АХЭ с мембраной на термостабильность фермента in vivo? В данной работе нами исследована кинетика тепловой денатурации АХЭ в близком к физиологическому контексте - в синап-тических мембранах из мозга крыс. Исследовано также влияние глицерина на кинетику денатурации фермента. Денатурация регистрировалась по снижению каталитической активности АХЭ в процессе инкубации препарата при высоких температурах.
Материалы и методы
Опыты проведены на беспородных белых крысах-самцах массой 170-200 г. Синапти-ческие мембраны из коры больших полушарий головного мозга крыс получали по методу Хайеша [4]. Для определения термостабильности АХЭ суспензию мембран синаптосом инкубировали в 0.1 М фосфатном буфере рН 8.0 при 42, 44, 46, 48 и 52 °С в отсутствии и в присутствии 2 % глицерина. Через заданные интервалы времени из суспензии отбирали пробы для определения активности АХЭ. Активность АХЭ определяли методом Эллмана с сотр. [5] с ацетилтиохолином в качестве субстрата при температуре инкубации 37 оС в 0.1 М фосфатном буфере рН 8.0. Время инкубации при определении активности фермента составляет 10 минут. При температуре 37 0С зависимость концентрации образующегося в результате гидролиза тиохолина от времени линейна, что свидетельствует о постоянстве скорости реакции, то есть отсутствии заметной денатурации фермента за время определения активности. Белок во фракции синаптических мембран определяли по методу Лоури [6]. Активность выражалась в мкМ/(мг белка-час). Каждая кривая кинетики денатурации фермента есть среднее из 4-5 независимых измерений (разные животные). Математиче-
ская обработка кинетических кривых проведена с помощью пакета СТАТИСТИКА. Параметры математической модели находили методом наименьших квадратов. Энергии активации двух стадий термоденатурации находили из Аррениусовских графиков констант скорости денатурации.
Результаты и обсуждение
На рис. 1 и 2 приведены кинетические кривые тепловой денатурации АХЭ при различных температурах инкубации в контроле и при добавлении глицерина в концентрации 2 % в координатах [(А/Ао) - t], где Ao - исходная активность фермента, At - активность фермента в данный момент времени, t - время инкубации.
Рис. 1. Кинетические кривые термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при разных температурах инкубации. Контроль
Рис. 2. Кинетические кривые термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс при разных температурах инкубации в присутствии 2 % глицерина
Видно, что кинетика денатурации состоит из двух участков - начального - быстрого и второго - медленного. Кинетика термоденатурации в координатах [1§(А0/Аг) - 1]
(не показано) нелинейна, что указывает на сложную кинетику процесса денатурации. Нелинейность кинетики денатурации в данном случае может быть обусловлена двух-стадийностью процесса денатурации белка:
N —U X D,
где N, Х и D - нативная, промежуточное состояние и денатурированная формы фермента, k1 и к2 - константы скорости денатурации быстрой и медленной стадий соответственно.
Математическая модель, соответствующая этой схеме, имеет вид [7]
Al = exp(-k t) | (expMpQ-expMiO),
Ao 1 k k2
где в - относительная активность промежуточной формы по сравнению с нативной.
Таблица 1. Кинетические характеристики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга крыс без глицерина и в присутствие 2 % глицерина
At , , , P-kx(exp(-k2t)-exp(-k1t))
в соответствии с уравнением = exp(-k^t) + ■
0 ki - k2
Условия денатурации Константы Температура инкубации (°С)
42 44 46 48 52
Контроль ki (мин- ) 0.4530 0.4840 0.5680 0.6740 0.7020
Глицерин (2 %) 0.1260 0.2340 0.2190 0.5270 0.7460
Контроль k2 1 (мин ) 0.0177 0.0201 0.0268 0.0501 0.0897
Глицерин (2 %) 0.0072 0.0127 0.0217 0.0266 0.0930
Контроль в 0.7820 0.6590 0.6350 0.5500 0.4370
Глицерин (2 %) 0.5860 0.5970 0.7090 0.7220 0.4690
Экспериментальные данные хорошо согласуются с этой моделью. В таблице 1 приведены кинетические характеристики термоденатурации АХЭ синаптических мембран.
На рис. 3-6 приведены Аррениусовские графики температурной зависимости констант скорости денатурации АХЭ в контроле и при добавлении глицерина.
Контроль
-1,2 -----------
3,06 3,08 3,10 3,12 3,14 3,16 3,18
1000 Т
Рис. 3. Аррениусовский график температурной зависимости константы скорости денатурации быстрой стадии. Контроль
Контроль
1000/Т
Рис. 4. Аррениусовский график температурной зависимости константы скорости денатурации медленной стадии. Контроль
глицерин
100 0.<Т
Рис. 5. Аррениусовский график температурной зависимости константы скорости денатурации быстрой стадии. Глицерин
глицерин
1000 т
Рис. 6. Аррениусовский график температурной зависимости константы скорости денатурации медленной стадии. Глицерин
Основные результаты сводятся к следующему:
- кинетика тепловой денатурации хорошо описывается схемой 3-х состояний,
- константа скорости первой стадии на порядок больше, чем второй как в контроле, так и при добавлении глицерина,
- глицерин в концентрации 2 % существенно уменьшает константы скорости обеих стадий денатурации,
- энергия активации быстрой стадии примерно в 1,5 раза меньше, чем энергия активации медленной стадии,
- глицерин увеличивает энергии активации обеих стадий денатурации,
- при увеличении температуры инкубации параметр в в контроле уменьшается, в то время как константа скорости второй стадии увеличивается,
- при добавлении глицерина параметр в при увеличении температуры инкубации сначала увеличивается, но при 52 °С уменьшается.
Увеличение констант скорости денатурации при увеличении температуры инкубации говорит о том, что скорости перехода из нативного состояния в промежуточное и из промежуточного в денатурированное увеличиваются.
Почему параметр в зависит от температуры инкубации? Самое простое объяснение состоит в предположении, что при разных температурах инкубации структура промежуточного состояния разная. Т. е. траектория от нативного состояния до денатурированного зависит от температуры. Естественно ожидать, что при более высоких температурах стабилизируется менее компактная конформация промежуточного состояния, которая обладает меньшей удельной активностью.
В присутствии глицерина, осмолита, который повышает термостабильность белка, повышение температуры инкубации в диапазоне температур 42-48 °С приводит к увеличению параметра в (табл. 1). Лишь при 52 °С параметр в уменьшается. Вообще, при температуре инкубации 52 °С кинетические параметры денатурации АХЭ в контроле и в присутствие глицерина очень близки. Другими словами, глицерин оказал стабилизирующий эффект при температурах, не превышающих 48 °С. Следует отметить, что добавление глицерина никак не повлияло на начальную активность фермента. Т. е. исходная активность фермента была такой же, как и в контроле. Это говорит о том, что остатки глицерина, присутствующие в пробе при определении активности фермента, не влияют существенно на активность фермента, и, следовательно, данные отражают влияние глицерина именно на кинетику термоденатурации АХЭ.
Обычно считается, что осмолиты влияют на стабильность белков, дестабилизируя денатурированное состояние и смещая равновесие в сторону нативного состояния [8]. Физические механизмы действия осмолитов на термостабильность белков сложны и до сих пор не вполне ясны [9]. Будет ли осмолит стабилизировать белок или дестабилизировать его зависит как от самого белка, так и от многих физико-химических характеристик среды (рН, температура, давление и так далее). И в наших экспериментах это проявилось в довольно выраженной форме. Например, при низких температурах инкубации глицерин оказал стабилизирующее действие (константы скорости денатурации уменьшились). Однако при более высокой температуре, 52 °С, этот эффект отсутствует. Энергия активации первой стадии увеличивается в присутствие глицерина на 43 кДж/моль (табл. 2). Это соответствует одной дополнительной слабой связи, стабилизирующей исходное состояние. Энергия активации второй стадии увеличивается на 66 кДж/моль. Эта величина также находится в пределах энергий разрыва слабых связей. Близость изменений энергий активации двух стадий денатурации АХЭ говорит о том, что структуры нативного и промежуточного состояний близки друг к другу. Но они отличаются друг от друга каталитической активностью.
Относительно механизма стабилизации глицерином структуры АХЭ может быть предложено два варианта: «осмолитный» и ингибиторный. Первый механизм представляется менее вероятным, так как концентрация глицерина была всего 2 %. В работе [10] заметный осмофобный эффект глицерина наблюдался при концентрации 10 %. Глицерин является конкурентным ингибитором АХЭ [11, 12]. Известно, что конкурентные ингибиторы АХЭ стабилизируют структуру АХЭ при термоденатурации [13, 14]. Поэтому, скорее всего, глицерин стабилизирует АХЭ, связываясь в активном центре фермента.
Таблица 2. Энергии активации быстрой и медленной стадий кинетики денатурации АХЭ синаптических мембран в контроле и при 2%-ной концентрации глицерина
Условия денатурации Энергия активации, кДж/моль
быстрая стадия медленная стадия
Контроль (n = 4) 108 ± 31 144 ± 17
Глицерин (n = 4) 151 ± 27 210 ± 15 P < 0.01
Примечание: в скобках указано число животных в выборке, Р - достоверность различия между контролем и опытом.
Одним из важных вопросов, который возникает при анализе кинетики термоденатурации АХЭ синаптических мембран мозга, является природа промежуточного состояния. Поскольку оно является каталитически активным, переход из нативного состояния в промежуточное может быть одним из механизмов регуляции активности фермента in vivo. Тетрамерная структура синаптического фермента позволяет предположить, что промежуточное состояние представляет собой одну из конформаций тетрамера. Если же и мономерные формы АХЭ могут обладать двухэкспоненциальной кинетикой термоденатурации, то тогда нужно выяснить, как зависит энергетический ландшафт третичной структуры фермента от температуры. Из-за разной зависимости электростатических и гидрофобных взаимодействий от температуры энергетический ландшафт для молекулы фермента может существенно изменяться при изменении температуры. Для выяснения природы промежуточного состояния необходимо использование физических методов анализа структуры вещества. Например, если бы удалось закристаллизовать промежуточное состояние, то рент-геноструктурный анализ позволил бы воссоздать структуру переходного состояния.
Литература
1. Брандтс Дж. Ф. Конформационные переходы белков в воде и в смешанных водных растворителях // Структура и стабильность биологических макромолекул. - М.: Мир, 1973.
- С. 175-254.
2. Taylor P., Brown J.H. Acetylcholine // Basic Neurochemistry. Raven Press. - N.Y., 199в.
3. Shin I., Kreimer D., Silman I., Weiner L. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1997. V. 94. № 10.
- P. 2848-2852.
4. Hajos F. // Brain Res. 1975. V. 93. - P. 485.
5. Ellman Y.L., Courtney K.D., Andres V.J., Featherstone R.M. // Biochem. Pharmacol. 19в1. V. 7. - P. 88.
в. Lowry D.H., Rosebrough H.J., Farr A.L., RandallR.J. // J. Biol. Chem. 1951. V. 193. - P. 2в5.
7. Кантор Ч., Шиммел П. Биофизическая химия. Т. 3. - М.: Мир, 1985.
8. Timashef S.N. Biochemistry. 2002. V. 41. № 4в. - P. 13743-13782.
9. Schellman J.A. // Biophys. J. 2003. V. 85. № 1. - P. 108-125.
10. MengF-G., Hong Y.-K., He H.-W., Lyubarev A.E., Kurganov B.I., Yan Y.-B., Zhou H.-M. // Biophy. J. 2004. V. 87. № 4. - P. 2247-2254.
11. BazelyanskyM., Robey E., Kirsch J.F. // Biochemistry. 198в. V. 25. - P. 125-130.
12. Мейланов И.С., Кличханов Н.К., Джафарова A.M. Биофизика. 2008. Т. 53. № 4. - С. в13-в17.
13. Payne C.S., SaeedM., Wolfe A.D. // Biochem. et Biophys. Acta (BBA). 1989. V. 999. № 1. - P. 4в-51.
14. Perrin B., Rowland M., Wolfe M., Tsigelny I., Pezzementi L. // Invertebrate Neurosci. 2008. V. 8. - P. 147-155.
Поступила в редакцию 11 января 2011 г.
