CC BY
16Тикра М.Х., Джафарова А.М.,. Кличханов Н.К, Мейланов И.С. Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояния
УДК 577.15
М.Х. Тикра, А.М. Джафарова, Н.К. Кличханов, И.С. Мейланов
Исследование кинетических характеристик ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях
Дагестанский государственный университет, meylanovis@mail.ru
Исследованы кинетические характеристики ацетилхолинэстеразы синаптических мембран мозга крыс при гипотермических состояниях. Гипотермия приводит к увеличению максимальной скорости и константы Михаэлиса фермента.
Ключевые слова: ацетилхолинэстераза, крыса, мозг, гипотермия, синаптические мембраны.
Kinetic characteristics of acetylcholinesterase in synaptic membranes of rat brain during hypothermal states were investigated. Hypothermia increases the maximum velocity and Michaelis constant of the enzyme.
Key words: acetylcholinesterase, rat, brain, hypothermia, synaptic membranes.
Ацетилхолинэстераза (АХЭ) - фермент, выполняющий важную функцию в нервной системе млекопитающих [1]. Он непосредственно участвует в передаче информации между нервными клетками, а также своей активностью влияет на взаимодействие удалённых друг от друга нейронов [2]. При изменении физиологических условий в мозге, например, при гипотермии, ишемии или гипоксии активность ферментов может изменяться. Эти изменения могут отражать как проявление процессов адаптации к новым условиям, так и патологические процессы, вызванные действием экстремального фактора. Выяснение механизмов изменений активности АХЭ, этого важного физиологического фермента, при различных физиологических состояниях животного является актуальной проблемой молекулярной физиологии. В данной работе нами исследованы кинетические характеристики АХЭ синаптических мембран мозга крыс при различных гипотермических состояниях.
Материалы и методы
Животные. Опыты проведены на белых лабораторных крысах-самцах весом 180200 г.
Гипотермия. Гипотермию вызывали в камерах из плексигласа, в рубашке которой циркулировала холодная вода. Температуру тела измеряли ректально. По достижении необходимого гипотермического состояния животных декапитировали и брали мозг для исследования.
Выделение синаптических мембран. Синаптические мембраны из мозга крыс выделяли с помощью центрифугирования в градиенте плотности сахарозы [3].
Определение кинетических характеристик АХЭ. Для определения кинетических характеристик АХЭ измеряли зависимость скорости гидролиза от концентрации ацети-лтиохолина (АТХ). Затем из экспериментальных данных методом наименьших квадратов находили соответствующие константы: максимальную скорость (Vm), константу Михаэлиса (Km), константу субстратного ингибирования (Ki).
Результаты и обсуждение
На рис. 1 приведены график концентрационной зависимости активности АХЭ синаптических мембран мозга крыс в контроле. Кривые имеют характерную колоколооб-разную форму, свидетельствующую о наличии субстратного ингибирования (СИ). Простейшая схема СИ с одним ингибиторным местом связывания имеет следующий вид
[4]
E + S ( k > ES k2 > E+P {1}
k_ 3U k3 5 SES
где E - фермент, S - субстрат, ES - фермент-субстратный комплекс, SES - двойной фермент-субстратный комплекс, P - продукт, а над стрелками указаны соответствующие константы скорости реакции.
Этой схеме соответствует кинетическое уравнение Холдейна
V =-(1)
Km+S+S2/Ki
где V- скорость реакции, Vm - максимальная скорость, Km - константа Михаэлиса, Ki -константа субстратного ингибирования.
Рис. 1 Концентрационная зависимость скорости гидролиза АТХ АХЭ синаптических мембран мозга крыс. Контроль и гипотермия 20 "С
Рис. 2 Концентрационная зависимость скорости гидролиза АТХ АХЭ синаптических мембран мозга крыс. Гипотермия 30 0C, 30 мин и 30 0C, 3 часа
Экспериментальные данные хорошо описываются кинетическим уравнением (1) (см. рис.1-2). Параметры уравнения были найдены методом наименьших квадратов с помощью пакета STATISTICA. Максимальная скорость равна произведению числа оборотов на количество молекул фермента. Поскольку точное количество молекул фермента в образце нам неизвестно, вычислить число оборотов (которое является константой, характеризующей каталитическую способность фермента) невозможно. Однако константы Кт и К не зависят от количества молекул фермента, поскольку являются физико-химическими характеристиками этих молекул.
При изменении физиологического состояния животного кинетические константы АХЭ изменяются (см. табл.). Анализ показывает, что изменения максимальной скорости и константы Михаэлиса однонаправлены - увеличение максимальной скорости сопровождается увеличением константы Михаэлиса (см. рис. 3).
Таблица. Кинетические параметры АХЭ мембран синаптосом коры мозга крысы в контроле, при гипотермии 30 0С, 30 мин, 30 0С, 3 часа и 20 0С (М ± т)
V max Km Ki
мкмоль/мг/мин мМ мМ
Контроль 63.25 ± 2.3 0.0342 ± 0.009 29.10 ± 2.6
Гипотермия, 30 0C,30 мин 99.26 ± 7.8* 0.0794 ± 0.005 10.51 ± 0.7
Гипотермия, 30 0C,3 ч. 130.91 ± 7.2* 0.2014 ± 0.038 10.675 ± 3.1
Гипотермия, 20 0C 101.20 ± 11.5* 0.1072 ± 0.038 32.13 ± 5.3
Примечание: * - означает достоверность различий при p < 0.05
0,28 0,26 0,24 0,22 0,20 0,18 0,16 0,14 0,12 0,10 0,08 0,06 0,04 0,02
60 70 80 90 100 110 120 130 140 150
Рис. 3. Корреляция между максимальной скоростью и константой Михаэлиса при различных физиологических состояниях крыс. По оси абсцисс - максимальная скорость, по оси ординат - константа Михаэлиса. Рядом с точками указаны состояния животного
Видно, что между максимальной скоростью и константой Михаэлиса имеет место пря-мопропорциональная зависимость (r = 0.955): увеличение максимальной скорости сопровождается увеличением константы Михаэлиса. Однако отношение максимальной скорости к константе Михаэлиса при гипотермических состояниях меньше, чем в контроле: Vm/Km равняется 1849, 1250, 650, 944 с-1 для контроля, при гипотермии 30 0С, гипотермии 30 0С пролонгированной в течение 3 часов и гипотермии 20 0С соответственно. Это говорит о том, что константа Михаэлиса увеличивается сильнее, чем максимальная скорость. В отсутствие суб-
стратного ингибирования при высоких концентрациях субстрата ([ATX] > Km) скорость реакции при гипотермии была бы выше, чем в контроле, но при низких концентрациях ([ATX] << Km) она была бы меньше. Какова возможная причина этой связи? Согласно схеме Розен-берри с сотрудниками [4] между каталитической константой и константой Михаэлиса имеет место следующее соотношение
^арр *-S + (2)
где Kapp - кажущаяся константа Михаэлиса, kcat - константа скорости образования продукта реакции, ks - константа скорости образования фермент-субстратного комплекса, k-s - константа скорости диссоциации фермент-субстратного комплекса, k2 - константа скорости образования ацилированной формы фермента.
Это соотношение можно переписать в виде
K kk (3)
К _ ^app^s"12
^ " k_s + k2
Отсюда видно, что каталитическая константа прямопропорциональна кажущейся константе Михаэлиса. Уменьшение отношения kcat/kapp означает, что другие константы тоже изменяются при гипотермических состояниях. АХЭ влияет не только на временной профиль АХ в синаптической щели при синаптической передаче, но и на стационарную концентрацию АХ в экстраклеточном пространстве. В синаптической щели концентрации АХ в импульсе могут достигать миллимолярных концентраций, а в экстраклеточном пространстве концентрация АХ на три порядка меньше [2]. Поэтому на концентрацию АХ в синаптической щели АХЭ при гипотермии будет влиять сильнее, а на экстраклеточную концентрацию меньше чем в контроле. Отсюда можно предположить, что изменение кинетических свойств АХЭ синаптических мембран при гипотермии имеет биологический смысл.
Что касается константы субстратного ингибирования, которая является мерой сродства субстрата к периферическому месту связывания, то между максимальной скоростью и константой Михаэлиса, с одной стороны, и константой субстратного ингибирования, с другой, связь может отсутствовать (что и проявляется в отсутствии корреляции между ними). С биофизической точки зрения это вполне возможно, так как это место связывания находится на периферии и никак не связано с активным центром и конформационной динамикой молекулы АХЭ. Однако изменение Ki при изменении физиологического состояния может иметь биологические последствия. Например, уменьшение Ki означает увеличение сродства субстрата к периферическому месту связывания. Следовательно, субстратное ингибирование будет наблюдаться при более низких концентрациях субстрата. Это значит, что действие АХ на постсинаптическую мембрану будет, при прочих равных условиях, более длительным. Соответственно эффективность синаптической передачи может возрасти.
Литература
1. Zimmerman G., Soreq H. Termination and beyond: acetylcholinesterase as a modulator of synaptic transmission // Cell Tissue Res. 2006. V. 326 - P. 655-669.
2. Lendvai B. and Vizi E.S. Nonsynaptic chemical transmission through nicotinic acetylcholine receptors // Physiol. Rev. 2008. V. 88. - P. 333-349.
3. Hajos F. An improved method for the preparation of synaptosomal fractions in high purity // Brain Res. 1975. V. 93, №. 3. - P. 485-489.
4. Szegletes T., Mallender W.D., Thomas P.J., Rosenberry T.L. Substrate binding to the peripheral site of acetylcholinesterase initiates enzymatic catalysis. Substrate inhibition arises as a secondary effect // Biochemistry. 1999. V. 38. - P. 122-133.
Поступила в редакцию 25 декабря 2010 г.
