CC BY
111
БИОЛОГИЯ
УДК 577.15
О функциональной классификации ферментов
И.С. Мейланов
Дагестанский государственный университет, e-mail: meylanovis@mail.ru
Рассматриваются основы функциональной классификации ферментов.
Ключевые слова: энзимология, ферменты, классификация, физиология, биохимия.
Principles of functional classification of enzymes are discussed.
Keywords: enzymology, enzymes, classification, physiology, biochemistry.
«Быть способным познавать вещи - значит уметь различать их»
Сюнь-цзы
Жизнь возникла в результате химической эволюции. Качественный скачок произошёл тогда, когда возникли самореплицирующиеся молекулы. Можно сказать, что возникла молекулярная форма жизни. Смысл жизни заключался в репликации. Жизнь представляла собой химическую реакцию. Физиология отсутствовала. Возникновение клетки знаменовало второй качественный скачок. Возникла форма жизни, отличная от чисто химической. Появилась физиология, т. е. выживание стало зависеть не только от химических, но и от физических процессов. Смысл жизни теперь заключался в размножении клеток. Химические реакции должны были обеспечить этот процесс. Поэтому, начиная с клеточного уровня, химические процессы подчиняются физиологическим. Эволюция органического мира привела к возникновению многоклеточных организмов. Это, в свою очередь, привело к расширению класса физиологических процессов. Наряду с клеточной физиологией возникла физиология органов и организма в целом. Возникновение физиологии привело к тому, что субстратом отбора стали не химические реакции, а физиологические процессы (эпигенетика), т. к. именно они теперь стали определять выживаемость организма.
Несмотря на то, что в основе физиологических процессов лежат химические реакции, между теми и другими нет одно-однозначного соответствия. Один и тот же физиологический процесс может быть осуществлён на различных химических основах. Например, существует большое разнообразие химических синапсов, отличающихся друг от друга химической природой медиатора и механизмом его удаления из синаптической щели. Означает ли это, что характер физиологического процесса вообще никак не ограничивает пространство химических реакций, из которого отбор черпает свой материал? Такие ограничения неизбежны. Например, если физиологический процесс должен протекать быстро, то лежащие в его основе элементарные процессы должны быть быстрыми. Другой пример: низкомолеку-
лярные соединения способны лишь к элементарному физико-химическому взаимодействию, а для узнавания на молекулярном уровне необходимы специфические взаимодействия. Все ферменты - это макромолекулы, чья структура может быть достаточно сложной, чтобы обеспечить различение структурно весьма сходных субстратов.
Далее: кодирование на молекулярном уровне требует матричного синтеза. Поэтому у всех живых организмов механизмы наследственности в общих чертах одинаковы - информационные макромолекулы осуществляют хранение и реализацию генетической информации. Перечисление таких ограничений можно было бы продолжить. Нам эти рассуждения потребовались для того, чтобы сделать предположение: эволюция биохимических процессов в определённой степени направлялась уже сложившейся картиной физиологических процессов в организме. Но тогда между биохимическими реакциями и физиологическими процессами, в основе которых они лежат, должны быть корреляции.
Физиологический процесс складывается из множества взаимосвязанных элементарных химических и физических процессов, образующих единое целое. Отсюда следует, что кинетические характеристики этих отдельных стадий должны быть согласованы друг с другом. В этом и состоит ограничение, накладываемое физиологией на свойства биохимических систем. Следовательно, исходя из характеристик физиологического процесса можно предсказывать некие общие свойства биохимических систем, обеспечивающих этот процесс. Хорошим примером, иллюстрирующим такой подход, является выяснение механизма регуляции гликолиза в летательных мышцах насекомых.
Важнейшая биохимическая характеристика летательных мышц насекомых состоит в том, что скорость гликолиза при переходе от состояния покоя к полёту может возрастать за доли секунды в 100 и более раз. Значит, нужно было найти механизмы, обеспечивающие столь быстрые изменения скорости гликолитического потока. В рамках этой идеи велись исследования, которые в конечном итоге привели к построению удовлетворительной модели регуляции гликолиза в мышцах [1].
Биология - наука о пользе. Поэтому исходный пункт биологического исследования - это вопрос о том, зачем нужен тот или иной механизм, т. е. какая от него польза. Другими словами в основе биологического исследования лежит всегда какой-нибудь "бытовой" вопрос. Когда проблема приобретает количественные формы, она становится предметом биохимии, биофизики или физиологии. Поэтому, разрабатывая подходы к решению биологической проблемы, с самого начала нужно обсудить её "житейские" аспекты. Такое обсуждение неизбежно основано на понятиях "хорошо", "плохо", "функция", которые трудно формализовать и охарактеризовать количественно. Решить биологическую проблему - значит ответить на вопрос, сформулированный в этих качественных понятиях.
Любая достаточно развитая область знания базируется на классификации объектов, с которыми она имеет дело. Взгляды на классификацию как на мыслительный инструмент постоянно изменяются по мере развития науки. Это связано с изменением характера проблем, которые приходится решать исследователям в разное время. На начальных этапах развития той или иной области знания функция классификации в основном описательная. Она даёт возможность систематизировать объекты исследования и более или менее чётко идентифицировать их. Накопление экспериментальных фактов на этом этапе происходит в рамках описательной классификации. Когда объём экспериментального материала достигает некоторой критической массы, наступает период обобщений. Описательная стадия сменяемся теоретической. И тогда может выясниться, что всё множество экспериментальных фактов, структурированное в рамках описательной классификации, следует перегруппировать в соответствии с требованиями теории. В этом случае может возникнуть потребность в новой классификации, основанной на иных принципах. Теперь функция классификации должна состоять не только в описании, но и в объяснении. Но тогда классификация должна быть «нагружена биологическими интерпретациями» [2].
Сказанное выше в полной мере относится и к энзимологии. На первых этапах развития этой науки шёл интенсивный процесс накопления сведений о разнообразии каталитических процессов в клетке, и поэтому «...возникла настоятельная необходимость в какой-либо систематизированной классификации и номенклатуре ферментов, при помощи которой любой фермент можно было бы точно идентифицировать» [3]. Для построения такого рода описательной классификации потребовался соответствующий признак. В качестве классифицирующего признака был «естественно и логично» [3] выбран тип катализируемой реакции. Несмотря на некоторую неопределённость, возникающую при отнесении того или иного фермента к соответствующему классу, этот признак достаточно хорошо работает при идентификации фермента, и поэтому именно химическая классификация стала основой описательной энзимологии.
В настоящее время описательный период развития энзимологии (как и самой биохимии) в основном завершён. Энзимология из описательной науки превратилась в физиологическую. Теперь центр тяжести проблем, решаемых энзимологией, лежит в области объяснения молекулярных механизмов физиологических процессов. Но огромный фактический материал о механизмах катализа и регуляции активности ферментов, накопленный в последние годы, распределён в соответствии с химической классификацией ферментов. Например, выделяют семейства сериновых протеиназ, тирозин-киназ, АТФаз, ГТФаз, ДНК-метилтрансфераз и т. д. Внутри семейства выясняют степени гомологичности первичных структур, выявляют эволюционные связи между членами семейства, но в основу объединения ферментов в семейство кладут химическую классификацию.
Однако принадлежность фермента тому или иному химическому классу мало что говорит о функции этого фермента, т. е. о том, в каком именно физиологическом процессе он играет важную роль. Между тем именно функция определяет регуляторные свойства фермента, и именно регулятор-ные свойства фермента имеют биологическое значение. Поэтому исследование регуляторных свойств ферментов, их кинетических характеристик должно начинаться с анализа выполняемой ими функции. Это позволит избежать неэффективных или бессмысленных исследований влияния различных факторов на активность того или иного фермента. Сходные по функции ферменты могут иметь сходные механизмы регуляции, что также может служить путеводной нитью в научном исследовании.
Разным этапам развития энзимологии соответствуют различные научные подходы, методологии исследования. На первых этапах становления энзимологии исследовались структура ферментных молекул, специфичность их действия, количественные закономерности влияния различных веществ и физико-химических параметров среды (температура, ионная сила, рН, диэлектрическая проницаемость и т. д.) на активность ферментов. На современном этапе главные вопросы энзимологии связаны с биологической функцией ферментов. Физико-химические и кинетические характеристики ферментов теперь должны быть оценены с точки зрения биологической целесообразности. Именно поэтому функциональная классификация становится методологическим принципом современной энзимологии.
Функциональная классификация ферментов идёт стихийным образом уже давно. Например, говорят о транспортных АТФазах, сигнальных транс-феразах и фосфатазах, ферментах антирадикальной защиты, репаративных ферментах, ферментах реструктуризации белков и т. д. Объём информации об особенностях участия ферментов в различных физиологических процессах стремительно растёт. Можно задаться, например, таким вопросом: почему транспорт веществ осуществляется именно АТФазами? Ведь и окислительно-восстановительные реакции, например, тоже могут служить источником свободной энергии. Может быть, есть что-то такое в гидролазной реакции, что делает её особенно пригодной к использованию химической энергии для транслокации веществ? Однако выяснение механизма транслокации ионов натриевым насосом показало, что на первой стадии происходит трансферазная реакция, т. к. остаток фосфорной кислоты переносится на ас-партильный остаток белка. Оставаясь в рамках чисто химических концепций, ответить на первый из поставленных вопросов невозможно.
Построение классификации - длительный процесс, который может продолжаться десятки лет. Поэтому с самого начала необходимо обсудить некоторые фундаментальные вопросы, связанные с её созданием. Прежде всего, это вопрос о демаркации границ между классами, в данном случае -между функциональными классами.
Термин «функция» имеет довольно расплывчатый смысл и поэтому очень часто используется в научной литературе при описании физиологи-
ческих процессов. Сплошь и рядом говорят о функциях молекул, клеток, органов и т. д. Между тем для классификации, особенно инвентаризирующей объекты, требуется по возможности более чёткий классифицирующий признак, чтобы границы классов были резкими и позволяли уверенно классифицировать объекты. Именно поэтому функция фермента плохо подходит в качестве классифицирующего признака. Это понятие создано для биологической классификации. Гибкость понятия «функция» позволяет использовать его на всех уровнях организации живого. Это понятие несёт мощный эвристический заряд. Проигрывая в точности, выигрываешь в генерации идей. Функциональная классификация не заменяет химическую, а представляет собой инструмент познания, предоставляющий новые возможности.
Идея функциональной классификации основана на очевидном (?) факте: в одном и том же физиологическом процессе обычно участвует множество ферментов, но их роль в этом процессе неодинакова. Это различие и есть основание для классификации. Например, можно сказать, что ферменты транскрипции и трансляции генетической информации участвуют во всех физиологических процессах, т. к. любой физиологический процесс, в конечном счёте, осуществляется белками. Но возьмём, например, такой физиологический процесс, как активный транспорт ионов. Для его осуществления нужны мембрана, АТФ, насос, наконец, сами ионы и т. д. Всё это обеспечивается соответствующими ферментами. И всё же роль одного из них, а именно №+-К+-АТФазы, в этом процессе поистине выдающаяся. Именно этот фермент транслоцирует ионы через мембрану, используя энергию АТФ. Можно сказать, что №+-К -АТФаза непосредственно участвует в активном транспорте ионов. «Расстояние» от до физиологического процесса невелико. Поэтому сам этот процесс может оказывать непосредственное влияние на активность этого фермента. Например, известно, что активный транспорт ионов №+ и К+ создаёт на мембране разность электрических потенциалов. Другими словами, продуктом реакции, катализируемой этим ферментом, являются не только АДФ и Рi , но и мембранный потенциал.
Обычно регуляция активности ферментов, осуществляется субстратами или продуктами реакции. И действительно, величина мембранного потенциала влияет на активность №+-К+-АТФазы. А именно: увеличение потенциала уменьшает активность фермента [5]. Как бы имеет место ингибиро-вание продуктом, т. е. отрицательная обратная связь. Но величина мембранного потенциала не оказывает никакого влияния на ферменты энергетического обмена: ферменты гликолиза, цикла Кребса, поставляющих необходимый для транспорта АТФ. Почему? Потому что их роль в активном транспорте ионов косвенная. Это не значит, что интенсивность откачки ионов никак не сказывается на активности ферментов энергетического обмена. Эта связь существует. При интенсивном транспорте расходуются значительные количества АТФ, и поэтому концентрация продуктов его распада - АДФ и Рi - увеличивается, а это сказывается на активности соот-
ветствующих ферментов. Влияние АДФ и на ферменты гликолиза, конечно, намного существенней, чем на активность №+-К+-АТФазы. И это совершенно понятно: данные ферменты, участвуя в одном и том же процессе, выполняют разную роль. Константа Михаэлиса для №+-К+-АТФазы для АТФ составляет примерно 0.1 мМ, в то время как в цитозоле концентрация АТФ равна нескольким миллимолям. Это значит, что изменения концентрации АТФ в клетке даже в несколько раз окажут слабое влияние на активность №+-К+-АТФазы. Скорость же гликолитического потока существенно зависит от концентрации АТФ в миллимолярном диапазоне [1]. Можно сказать, что гликолитические ферменты реагируют на химические сигналы, а Ш+-К+-АТФаза реагирует на физиологические изменения.
Разбирая так подробно хорошо известные факты, мы хотим показать, что регуляция активности ферментов (важнейший для физиологии процесс), занимающих разное положение в череде элементарных событий, из которых складывается сложное, различна. Те, что «ближе» к физиологии, регулируются физико-химическими сигналами: конформациями макромолекул (мышечное сокращение), напряжённостью электрическою поля (био-электрогенез), рН (секреция), температурой, ионной силой и т. д. Другие, что «подальше» от физиологии, обычно реагируют на химические сигналы, т. е. на изменения концентраций метаболитов.
Другой пример: НАДФН-оксидаза фагоцитов. Этот фермент локализован на плазматической мембране фагоцита и, окисляя НАДФН, производит супероксидные радикалы. Активность фермента стимулируется контактом фагоцита с чужеродной клеткой. НАДФН находится внутри фагоцита, а супероксидный радикал нужен на внешней стороне, чтобы поражать чужеродную клетку. Поэтому электрон от НАДФН переносится ферментом с внутренней стороны на внешнюю, где и восстанавливает кислород до супероксида, т. е. реакция идёт трансмембранно. При этом через мембрану переносится заряд, что приводит к деполяризации мембраны. Чтобы компенсировать этот электронный ток, вслед за электроном переносится и протон. Для этого фермент имеет специальный канал [6]. Таким образом, активность фермента электрогенна. Это значит, что она зависит от мембранного потенциала. Кроме того, активность НАДФН-оксидазы связана с транслокацией протонов через плазматическую мембрану, следовательно, ДрН на мембране может регулировать активность фермента.
Контакт фагоцита с чужеродной клеткой - явление дискретное. Он наступает лишь тогда, когда такая клетка появляется в крови. Следовательно, НАДФН-оксидаза работает время от времени. Это значит, что о стационарном состоянии говорить в данном случае не приходится. В то же время фермент не является участником метаболического пути - он катализирует изолированную реакцию. Ингибирование НАДФН-оксидазы никак не может повлиять на концентрации метаболитов в клетке, единственный результат - фагоцит перестанет выполнять свою разрушительную функцию. Сразу можно предположить, что активность НАДФН-оксидазы не зависит
от концентрации метаболитов в цитозоле (если только кроме фагоцитарной функции она не играет ещё какой-либо роли).
В нейроэпителии лёгких НАДФН-оксидаза, возможно, является О2-сенсором [7]. И надо полагать, что механизм регуляции активности фермента в этом случае иной, хотя с химической точки зрения это всё та же оксидаза. Ясно, что кислород поступает в лёгкие непрерывно, и поэтому НАДФН-оксидаза может непрерывно восстанавливать его до супероксида, стационарная концентрация которого (или его продукта, например перекиси водорода) и есть результат «измерения» парциального давления кислорода во вдыхаемом воздухе.
Ацетилхолинэстераза (АХЭ) - фермент, широко распространённый в органическом мире. В мозге высших позвоночных АХЭ локализована на си-наптических мембранах и участвует в прекращении действия медиатора (ацетилхолина, АХ) на постсинаптические рецепторы. Передача информации в холинергических синапсах длится несколько миллисекунд. Объём ком-партмента (синаптической щели), в котором действует АХЭ, составляет примерно 5-10 см . Субстрат поступает в щель в значительных количествах только при синаптической передаче, инициируемой потенциалом действия (ПД). Поэтому концентрация субстрата в щели - величина переменная.
Временной профиль «концентрации» медиатора в щели играет важную роль в кодировании информации. АХЭ - эктофермент. Он находится в экстраклеточном пространстве и отделён от внутреннего содержимого нейронов плазматической мембраной. Поэтому регуляция активности АХЭ ин-термедиатами внутриклеточных метаболических процессов невозможна. Может быть, активность этого фермента вообще не регулируется? Напротив, АХЭ имеет ряд особенностей, которые, видимо, связаны с выполняемой им функцией. Во-первых, АХЭ ингибируется высокими (миллимоляр-ными) концентрациями субстрата. Во-вторых, субстратное ингибирование снимается миллимолярными концентрациями кальция. Оба свойства могут иметь важное биологическое значение. Потенциал действия, достигнув си-наптической терминали, приведёт к открытию потенциал-зависимых кальциевых каналов, локализованных в синаптической щели. Ионы кальция по градиенту концентрации устремятся в пресинаптичекую терминаль. Концентрация кальция в синаптической щели уменьшится. Вход кальция стимулирует выделение медиатора в щель.
Концентрация ацетилхолина в синаптическом пузырьке составляет примерно 200 мМ. Даже если концентрация ацетилхолина уменьшится в 10 раз, её величина составит 20 мМ, что соответствует существенному инги-бированию активности АХЭ. Ацетилхолин, связываясь с постсинаптиче-скими рецепторами, вытесняет ионы кальция из мест связывания. Соответственно концентрация кальция вблизи АХЭ возрастает. Кальций снимает субстратное ингибирование, и АХЭ начинает разлагать ацетилхолин. Когда его концентрация упадёт ниже примерно 10 мкМ, АХЭ перестанет катализировать распад ацетилхолина, т. к. ^ для ацетилхолина АХЭ составляет
примерно 100 мкМ. На этом цикл завершается и синапс возвращается в исходное состояние и будет готов к приёму следующего ПД. Все эти события происходят за несколько миллисекунд.
Фермент непосредственно участвует в быстром физиологическом процессе, имеющем импульсный характер. Временной профиль количества ацетилхолина в синаптической щели имеет важное значение для кодирования информации в синапсе.
Активность АХЭ существенно влияет на этот профиль. Но и концентрация ацетилхолина существенно влияет на активность АХЭ. Анализ каталитических свойств АХЭ в рамках представлений, адекватных функции обычных метаболических ферментов, не может дать ответ на вопрос о роли АХЭ в синаптической передаче. Приходится учитывать многие особенности: форму компартмента, его объём, коэффициент диффузии субстрата, время срабатывания фермента, константы связывания медиатора с рецепторами, напряжённость электрического поля на мембране и т. д.
АХЭ локализована также на внешней стороне мембраны эритроцитов. Функция эритроцитарной АХЭ неизвестна. Каталитические свойства АХЭ эритроцитов близки таковым АХЭ синаптических контактов. Молекулярные формы АХЭ в эритроцитах и синапсах различны. Поскольку каталитические свойства АХЭ эритроцитов и синаптических контактов практически одинаковы, можно предположить, что в эритроцитах функция АХЭ не связана с её каталитической активностью - ведь концентрация АХ в крови намного ниже, чем в синаптической щели при передаче сигнала.
Действительно, в последнее время накапливаются экспериментальные данные, свидетельствующие о структурной роли АХЭ [8]. АХЭ секретиру-ется в межклеточное пространство допаминовыми нейронами компактной зоны чёрной субстанции головного мозга [9]. Экзогенно добавленная к срезам чёрной субстанции АХЭ вызывает гиперполяризацию генерирующих вспышки потенциалов действия нейронов, влияя на АТФ-зависимые калиевые каналы [10]. Причём, это действие не связано с каталитической активностью АХЭ. АХЭ также секретируется нейронами при стимуляции мозжечка [11], вызывая ряд электрофизиологических эффектов. Эти эффекты тоже не связаны с каталитической активностью АХЭ.
Возникают вопросы: если каталитическая активность АХЭ не нужна, то зачем секретировать именно АХЭ? Потому только, что у АХЭ есть на поверхности сигнатуры (термин Кастлера), способные вызывать необходимые физиологические эффекты? Но ведь можно было использовать молекулу, не обладающую ферментативной активностью. В биологии редко бывает, чтобы какая-либо особенность не имела смысла. Поэтому можно предположить, что АХЭ используется в перечисленных выше случаях не случайно. Две функции - каталитическая и структурная - совмещены пространственно (в одной молекуле), видимо, специально. Ответ на этот вопрос, возможно, будет получен из анализа конкретной структуры связей между
нейронами в соответствующей области мозга, мозаики нейромедиаторов, используемых для передачи информации.
Развивая идею функциональной классификации ферментов, я написал статью и отправил её в журнал «Биохимия». Статья вернулась с двумя неутешительными рецензиями. Оба рецензента рекомендовать к публикации статью не стали, однако в своих рецензиях они развернули довольно живую полемику. В той статье я предложил для начала классифицировать ферменты на метаболические и физиологические. Дал соответствущие определения. Конечно, не в том смысле, что одни из них участвуют только в метаболизме, а другие - только в физиологии. И даже много места уделил разъяснениям, чтобы такое понимание предотвратить. Однако сделал это, видимо, неубедительно, т. к. один из рецензентов счел такое деление нецелесообразным, ибо все ферменты (по его мнению) и метаболические, и физиологические. Другой рецензент сначала приветствовал идею функциональной классификации ферментов, но отметил, что всё это уже понятно из работ выдающегося физиолога А.М. Уголева, и сослался на его книгу «Эволюция пищеварения и принципы эволюции функций». Термин «физиологический фермент» второму рецензенту тоже не понравился. Интересно в связи с этим заметить, что А.М. Уголев, рассуждая по другому поводу, употребил в упомянутой выше книге в отношении липазы именно этот термин (не давая ему определение). А.М. Уголев не предлагал функциональной классификации ферментов, но он интуитивно почувствовал, что липаза, катализирующая синтез вторичного мессенджера, всё же как-то отличается от обычных метаболических ферментов, перерабатывающих значительные количества субстратов, используемых по многим направлениям, и назвал фермент физиологическим. Действительно, как сказал Стивен Роуз [12], «наименования чрезвычайно важны в науке».
Для любой классификации нужно сначала собрать в одно множество в некотором отношении одинаковые объекты, например ферменты. Все ферменты одинаковы в том отношении, что катализируют химические реакции (поэтому, наверное, рецензент считает всех их метаболическими). И все они одинаковы в том отношении, что катализируют реакции, имеющие биологический смысл (и потому все они физиологические). Но это только начало. Общее найдено. Теперь нужно искать различия. Иначе никакой классификации не получится. Различие в типе катализируемой реакции уже использовано для классификации ферментов. Теперь предлагается классифицировать по функциям. На уровне биологических наук такое различение сделано уже давно. Мы изучаем биохимию и физиологию. Хотя, конечно, трудно определить, где кончается биохимия и начинается физиология. Но выделение этих двух аспектов единого биологического знания в самостоятельные научные дисциплины многие, наверное, считают оправданным. Грубо говоря, биохимия отличается от физиологии тем, что выясняет роль химических превращений в живом, тогда как физиология изучает роль физических процессов. Цепочки химических процессов завершаются физиче-
ским процессом, который в живом уже называется физиологическим. Каждая химическая реакция катализируется ферментом. Продуктом последней в цепи реакции является не только химическое соединение, но и физический процесс. Этим и определяется особая роль последнего в этой цепи фермента. Его можно назвать физиологическим. Фермент непосредственно связан с физиологическим процессом.
Ферменты основных метаболических путей: гликолиза, ЦТК, биосинтеза жирных кислот, аминокислот и других основных «кирпичиков» - можно назвать метаболическими. Их назначение - обеспечить энергией и веществом разнообразные процессы в клетке. Обычно метаболические ферменты работают на большой по объёму компартмент и реагируют на химические сигналы. Такие понятия, как метаболический поток, стационарное состояние, стационарная концентрация, метаболический контроль, пункты перекреста, хорошо описывают работу именно метаболических ферментов [1]. Кинетические характеристики метаболических ферментов соответствуют стационарным концентрациям субстратов в компартменте. Например, константы Михаэлиса этих ферментов примерно равны стационарным концентрациям субстратов в компартменте [13]. Регуляция активности метаболических ферментов осуществляется, главным образом, посредством химических сигналов, т. е. изменений концентраций метаболитов. Исследуют метаболические ферменты традиционными методами, выделяя их в достаточно большом количестве из тканей в макроскопические объёмы при избытке субстрата, ингибитора или активатора. Соответствующие кинетические константы скорости являются, по существу, термодинамическими параметрами, т. е. средними величинами. Анализ работы фермента редко включает такие параметры, как, например, объём компартмента, его форма. Считается, что для описания кинетики реакций, катализируемых метаболическими ферментами in vivo, вполне применимо понятие концентрации, и закон действующих масс выполняется. И хотя образование продукта реакции есть результат последовательности нескольких элементарных событий, биологически значимым считается именно скорость образования продукта, т. е. конечный результат.
_15 3
In vivo, однако, компартмент может иметь объём порядка 10 см . Если «концентрация» субстрата составляет 1 мкмоль, то среднее количество молекул в компартменте будет равно примерно 0.6. Каковы в этом случае по величине флуктуации числа молекул в компартменте? Каково время жизни флуктуации? Как оно соотносится с числом оборотов фермента? Можно ли пользоваться в этом случае таким понятием, как «концентрация»? Какова кинетика реакции, катализируемая этим ферментом? Войдёт ли в соответствующее кинетическое уравнение концентрация субстрата или придётся использовать временные характеристики отдельных стадий работы фермента и движения субстрата? В связи с этим следует отметить недавнюю работу. [14]. В ней рассмотрены кинетика реакции, катализируемая одной молекулой фермента, последовательность элементарных событий,
ведущих к преобразованию субстрата. Каждая стадия характеризуется соответствующим временем, в течение которого она длится. И хотя эти времена средние, сама постановка вопроса такова, что открывает новые возможности для анализа работы ферментов in vivo. Микроскопический подход к анализу ферментативной кинетики in vivo практически не применяется. И это только потому, что все ферменты обычно рассматриваются как однородная масса метаболических катализаторов, работающих при избытке субстрата на большой компартмент.
Недавно Хочачка [15] подошёл, по существу, к той же проблеме, но с несколько иной стороны. Он пишет, что сегодня сосуществуют два взгляда (парадигмы) на организацию биохимических процессов в клетке. Модель 1 рассматривает клетку как мешок, содержащий водный раствор ферментов и субстратов. Модель II рассматривает клетку как структуру, наполненную микрофиламентами, микротрубочками, мембранами, каналами, насосами, моторами. В первой модели субстраты доставляются к активным центрам ферментов посредством диффузии, во второй - важная роль отводится внутриклеточной конвекции и молекулярным моторам (кинезин, динеин), микротрубочкам и микрофиламентам. Хочачка приводит данные, согласующиеся со второй моделью. Но совершенно ясно, что во многих случаях реализуется первая модель.
Ясно также, что ферменты, работа которых соответствует модели II, -чаще всего физиологические. Уже давно формируется параллельная энзи-мология, имеющая дело, главным образом, с физиологическими ферментами и оперирующая при анализе работы фермента такими понятиями, как «мембрана», «деполяризация», «надмолекулярный комплекс», «метабо-лон», «ионный канал», «время диффузии», «цитоскелет», «адсорбция» и т. д. Эта энзимология учитывает многие обстоятельства, а не только концентрацию субстрата и сродство фермента к нему.
В последние годы популярными стали исследования метаболонов -комплексов ферментов, катализирующих цепочку превращений [16, 17]. В метаболоне существует вход для исходного субстрата метаболического пути и выход для конечного продукта. Интермедиаты цепочки не выходят в раствор, а туннелируют (не в квантовомеханическом смысле) от активного центра одного фермента к активному центру другого. Ясно, что для этих интермедиатов понятие концентрации неадекватно. Для чего нужен мета-болон? Для адресного снабжения конкретного физиологического процесса необходимыми веществами и энергией. Например, в глиальных клетках мозга обнаружен процесс, названный аэробным гликолизом [18]. При наличии кислорода превращение глюкозы происходит с образованием молочной кислоты, которая затем транспортируется из глии в нейроны.
Активация аэробного гликолиза в глии происходит следующим образом. При возбуждении нейронов в межклеточное пространство выделяется медиатор - глутамат. Глутамат активно захватывается глиальными клетками за счёт градиента ионов Na+. Вход ионов натрия в астроцит стимулирует
натриевый насос, что приводит к расходованию АТФ. Это, в свою очередь, стимулирует гликолиз. Ясно, что захват глутамата, а вместе с ним и ионов натрия, происходит в примембранном слое астроцита. Именно там локально возрастает концентрация ионов натрия и стимулируется активность №+-К+-АТФазы. Поэтому локально должен активироваться и гликолиз, чтобы обеспечить насос энергией. Конечно, можно было бы в этом случае привлечь к производству АТФ митохондрии. Но надо полагать, что этот процесс более инерционен, чем гликолиз. Кроме того, для локальной откачки ионов не требуется много энергии, ведь восстановить исходную концентрацию ионов нужно в малом по объёму компартменте. Надо полагать, что ферменты аэробного гликолиза локализованы вблизи плазматической мембраны и чувствительны к изменениям физико-химических условий (например, концентрации ионов натрия и мембранного потенциала). И, действительно, было обнаружено, что №^-АТФаза, АТФ-зависимые калиевые каналы и ферменты гликолиза образуют надмолекулярный комплекс на плазматической мембране нейронов [19]. АТФ-зависимые калиевые каналы во многих клетках являются метаболическими сенсорами и сопрягают физиологические процессы с энергетическими. Ферменты гликолиза могут регулировать активность этих каналов. В [19] показано, что активация гликоли-тических ферментов приводит к закрытию АТФ-зависимых калиевых каналов, предположительно за счёт увеличения концентрации АТФ в микро-компартменте этого надмолекулярного комплекса. Можно предположить, что ферменты анаэробного и аэробного гликолиза различаются регулятор-ными механизмами. Известно, что в скелетных мышцах многие ферменты гликолиза адсорбированы на микротрубочках мышечных клеток [20]. Поэтому АТФ, производимый гликолитически, более доступен использованию сократительным аппаратом мышц.
О влиянии механических сил на активность гликолитических ферментов и других ферментов, участвующих в обеспечении движений, говорится в обзоре [21]. В 1982 году мы обнаружили [22], что гипотермия вызывает существенное изменение температурной зависимости активности глутаминазы из мозга крыс. Активность фермента при температуре инкубации 20 °С оказалась заметно выше, чем при 30 оС. Этот результат был интерпретирован как проявление температурной компенсации активности глутаминазы. Глу-таминаза в синаптических терминалях поставляет нейромедиатор глутамат. Поэтому можно было предположить, что обнаруженное при гипотермии изменение температурной активности этого фермента направлено на поддержание в мозге синаптической передачи при низких температурах тела.
Впоследствии было показано, что температурная компенсация активности глутаминазы при гипотермии наблюдается только в синаптосомальной фракции мозга [23]. В митохондриальной фракции такого изменения нет. Этот факт согласуется с предположением о том, что при глубокой гипотермии в мозге крыс адаптивное изменение затрагивает именно фермент, локализованный в синаптической области, и это изменение направлено на
поддержание синаптической передачи. Отсюда следует, что глутаминаза синаптических митохондрий должна отличаться по регуляторным свойствам от глутаминазы митохондрий перикариона. И причина этого - различие функций, а не только мест локализации.
Физиологические ферменты, для того чтобы реагировать на результат физиологического процесса, должны иметь третичные структуры, специально приспособленные к «измерению» температуры, рН, ионной силы, механического усилия, напряжённости электрического поля и т. д. Конечно, изменение одного из параметров в той или иной степени влияет на активность любого фермента. Число варьируемых параметров бесконечно. Что же нужно исследовать и какие изменения считать биологически значимыми? Ответы на эти вопросы даёт предварительный анализ возможных функций фермента.
Следует отметить, что в многоклеточном организме разные органы отличаются по степени своей «физиологичности». Например, мозг млекопитающего - это орган, управляющий всем организмом посредством электрических сигналов. Поэтому биохимия мозга направлена на обеспечение генерации и распространения биопотенциалов. Напротив, печень - это орган, в котором происходит переработка значительных количеств различных субстратов. Ни электрической, ни механической работы печень не производит. Можно сказать, что мозг - это физиологический орган, а печень - это биохимический орган. Не значит ли тогда, что механизмы регуляции одноименных ферментов в мозге и печени должны быть неодинаковыми? Вот почему сравнительное исследование биохимических процессов в мозге и печени при изменении физиологического состояния организма может быть весьма плодотворным.
Давно уже известно, что ферменты обычно имеют различные изофор-мы. В последние годы благодаря успехам молекулярной биологии и биохимии количество открытых изоформ растёт драматически, однако биологическое значение множественности изоформ ферментов не оценено по достоинству. Это разнообразие обусловлено не различием физико-химических условий функционирования фермента, а разнообразием выполняемых им функций. Многие ферменты имеют десятки различных изо-форм. По химической классификации все они - один вид фермента. Но функционально это могут быть различные ферменты.
Множественность изоформ ферментов в мозге весьма сходна с множественностью ионных каналов и рецепторов гормонов, медиаторов и других сигнальных молекул. Например, количество изоформ Са+-АТФазы превышает несколько десятков. Активность кальциевого насоса регулируется, кроме всего прочего, протеинкиназой С [24], которая фосфорилирует белок насоса. Протеинкиназа С сама имеет десятки различных изоформ [25]. Число различных типов кальциевых каналов тоже велико [26]. Трудно себе представить, что десятки различных кальциевых каналов работают на один и тот же компартмент (если только этот компартмент не играет роли про-
U \ 1—1 U с»
стеишего интегратора). Если же каждый тип каналов работает на свои специфический компартмент, то, скорее всего, функционально это разные каналы, а значит и ферменты, регулирующие активность этих каналов, тоже выполняют различные функции и, следовательно, имеют различные механизмы регуляции. Связь между каналами и ферментами настолько тесная, что в последнее время в большинстве работ параллельно проводят как измерения ферментативной активности, так и электрофизиологические измерения.
Колоссальный прогресс в исследовании молекулярных механизмов физиологических процессов значительно изменил многие парадигмы биохимии и энзимологии. Кинетические характеристики ферментов теперь рассматриваются в контексте системы ферментативных и физиологических процессов, к которой принадлежит данный фермент. Большое значение придаётся анатомии клетки. Представление о клетке как мембранном мешочке, содержащем раствор ферментов и их субстратов, сменяется картиной высокоорганизованной структурированной среды, в которой передвижение молекул и субклеточных структур происходит с помощью специальных механизмов, использующих энергию АТФ [27, 28]. Одна из важных проблем современной биохимии - это объяснение того, почему конкретный фермент имеет именно тот механизм регуляции активности, какой он имеет. Решение данной проблемы будет найдено в рамках функциональной классификации ферментов.
Литература
1. Ньюсхолм Э., Старт К. Регуляция метаболизма. - М.: Мир, 1977. -407 с.
2. Павлинов И.Я. // Журн. общ. биол. 1995. Т. 56. - Р. 411-424.
3. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. - М.: Мир, 1982. Т. 1.
4. Волькенштейн М.В. Энтропия и информация. - М.: Наука, 1986. -192 с.
5. Albers R.W., Siegel G.J., Stahl W.L. Membrane transport // Basic Neuro-chemistry. - N.Y.: 1994. Raven Press. - Р. 49-73.
6. De Coursey Т. Е., Cherny V.V., Zhou W., Thomas L.L. Simultaneous activation of NADFH oxidase-related proton and electron currents in human neutrophils // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 12. - Р. 6885-6889.
7. Xiao Wen Fu, Dashou Wang, Nurse C.A., Dinauer M.C., Cutz E. NADFH oxidase is an O2 sensor in airway chemoreceptors: Evidence from К+ current modulation in wild type and oxidase - deficient mice // Proc. Nac. Acad. Sci. USA. 2000. V. 97. № 8. - Р. 4374-4379.
8. Grisaru D., SternfeldM., Eldor A., Glick D., Soreq H. Structural roles of acetylcholinesterase variants in biology and pathology // Eur. J. Biochem. 1999. V. 264. - Р. 3672-86.
9. AppleyardВ., Greenfield S.A. Rat locomotion and release of acetylcholinesterase // Pharmacol. Biochem. & Behaviour. 1999. V. 62. № 1. - Р. 81-87.
10. Webb C.P., Greenfield S.A. Non-cholinergic effects of acetylcholinesterase in the substantia nigra: a possible role for ATP-sensitive potassium channel // Exp. Brain Res. 1992. V. 89. - Р. 149-158.
11. Appleyard M., Jahnsen H. Actions of acetylcholinesterase in the guinea-pig cerebellar cortex in vitro // Neuroscience. 1992. V. 47. - Р. 2291-2301.
12. Роуз С. Устройство памяти. - М.: Мир, 1995. - 384 с.
13. Hochachka P., Somero G. Biochemical adaptation. - Oxford University Press, 2002. - 560 p.
14. Gentry R., Liqiang Ye, Nemerson Yale. A microscopic model of enzyme kinetics // Biophys. J. 1995. V. 69. - Р. 356-361.
15. Hochachka P. W. The metabolic implications of intracellular circulation // Proc. Nat. Acad. Sci. USA. 1999. V. 96. № 22. - Р. 12233-12239.
16. Morgunov I. Srere P.A. Interaction between citrate synthase and malate dehydrogenase // J. Biol. Chem. 1998. V. 273. № 45. - P. 29540-29544.
17. McKennaM., Tildon J.T., Stevenson J.H., HuangXueli. New insights into the compartmentation of glutamate and glutamine in cultured rat brain astro-cytes // Dev. Neurosci. 1996. V. 18. - P. 380-390.
18. Pellerin L., Magistretti P.J. Exitatory amino acids stimulate aerobic gly-colysis in astrocytes via an activation of the Na+/K+ ATPase // Dev. Neurosci. 1996. V. 18. - P. 336-342.
19. Dhar-Choudhury P. et al. The glycolytic enzymes, glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, triose-phosphate isomerase, and pyruvate kinase are components of the KATP channel macromolecular complex and regulate its function // J. Biol. Chem. 2005. V. 280 (46). - P. 38464-38470.
20. Lloyd P.O., Hardin CD. Role of microtubules in the regulation of metabolism in isolated cerebral microvessels // Am. J. Physiol. Cell Physiol. 1999. V. 277. № 6. - P. 1250-1262.
21. Khan S., Sheetz M.P. Force effects on biochemical kinetics // Ann. Rev. Physiol. 1997. V. 66. - P. 785-805.
22. Эмирбеков Э.З., Мейланов И.С. Температурная зависимость активности глутаминазы из мозга крысы при гипотермии. Биохимия. 1982. Т. 47. № 9. - С. 1466-1469.
23. Мейланов И.С., Авшалумов М.В. Температурная компенсация у теплокровных животных // Рос. физиол. ж-л. 1997. № 9. - С. 102-106.
24. Verma А.К., Paszty К., Filoteo A.G., Penniston J.T., Eneyedi A. Protein kinase С phosphorylates plasma membrane Ca+ pump isoform 4a at its calmodulin domain // J. Biol. Chem. 1999. V. 274. № 1. - P. 527-531.
25. Iwamoto Y., Koide H., Ogita K., Nishizuka Y. The protein kinase С family for the regulation of cellular functions // Biol. med. rev. 1992. № 1. - Р. 1-6.
26. Waterman S.A. Voltage-gated calcium channels in autonomic neuroef-fector transmission // Progr. Neurobiol. 2000. V. 60. - Р. 181-210.
27. Kim S., Coulombe P.A. Emerging role for the cytoskeleton as an organizer and regulator of translation // Nature Mol. Cell Biol. 2010. V. 11. - P.75-81.
28. Mekhail K., Moazed D. The nuclear envelope in genome organization, expression and stability // Nature Rev. Mol. Cell Biol. 2010. V. 11. - P. 317-328.
