CC BY
14
УДК 577.15.02
ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗА ПЕКАРСКИХ ДРОЖЖЕЙ: НЕОБЫЧНЫЙ МЕХАНИЗМ ТЕРМОИНАКТИВАЦИИ И СТАБИЛИЗАЦИЯ ИОННОЙ СИЛОЙ И КОФАКТОРОМ
А.Е. Серов, В.И. Тишков
(кафедра химической энзимологии; e-mail: vit@enz. chem.msu.ru)
Формиатдегидрогеназа пекарских дрожжей (8ееФДГ) имеет уникальный для NAD+'зависимых ФДГ механизм термоинактивации. Процесс включает в себя две стадии, первая из которых обратима, тогда как тепловая денатурация остальных ФДГ протекает в соответствии с кинетикой необратимой реакции первого порядка. Необычный механизм инактивации и низкая термостабильность 8ееФДГ, по всей видимости, связаны с повышенной гибкостью полипептидной цепи этого фермента. В присутствии кофактора и высоких концентраций солей наблюдается чрезвычайно сильная стабилизация ^ееФДГ.
N A +-зависимая формиатдегидрогеназа (ФДГ; КФ 1.2.1.2) — фермент, наиболее подходящий для регенерации восстановленного кофактора в биотехнологических процессах синтеза оптически активных соединений [1]. ФДГ состоит из двух идентичных субъединиц с молекулярной массой 40—44 кДа, каждая из которых имеет независимый активный центр [2]. Гены ФДГ обнаружены в различных прокариотичес-ких и эукариотических источниках: в метилотроф-ных бактериях [3—5] и дрожжах [6—8], пекарских дрожжах [9], низших грибах [10, 11] и высших растениях [12—15]. ФДГ является высококонсервативным белком. При сравнении ферментов бактерий Pseudomonas sp.101, дрожжей H. polymorpha и митохондрий картофеля наблюдается 40—50%-й уровень полной гомологии. Все аминокислотные остатки, имеющие значение для катализа и связывания субстрата и ко-фермента, строго консервативны.
Особенности первичной структуры ФДГ из S. cerevisiae (БееФДГ) позволяют выделить этот фермент среди остальных ФДГ. БееФДГ характеризуется повышенной гибкостьюполипептидной цепи,втом числе и в районе активного центра. Ряд консервативных остатков пролина в БееФДГ заменен на другие аминокислоты. Так, ФДГ из бактерий Pseudomonas sp.101 (РзеФДГ) содержит 24 остатка пролина, ФДГ из дрожжей Candida boidinii (СЬоФДГ) и Candida methylica (СтеФДГ) - по 14 остатков пролина, а БееФДГ — всего 12.
На основе анализа первичной структуры БееФДГ можно сделать предположение, что данный фермент обладает необычным для формиатдегидрогеназ поведением при тепловой денатурации. Цель данной работы — изучение механизма термоинактивации
БееФДГ и поиск путей стабилизации этого белка. Ранее ген БееФДГ был клонирован и экспрессирован в клетках E. coliв активной растворимой форме.
Методы исследования
В кинетических экспериментах использовали N A + (99% чистоты, "Sigma"), формиат натрия и сульфат аммония марки "analytical grade" ("Merck").
Рекомбинантную ФДГ пекарских дрожжей дикого типа, экспрессированную в клетках E. coli, выделяли и очищали по стандартной методике, разработанной для бактериальной ФДГ [16]. Полученные препараты фермента имели чистоту не менее 95% согласно данным аналитического электрофореза в 12%-м полиак-риламидном геле в присутствии додецильсульфата натрия. Активность ФДГ определяли спектрофотомет-рически по накоплению NAH при длине волны 340 нм (е340 = 6 2 2 0 М-1см-1) на спектрофотометре "Schimadzu UV 1601PC"при 25°Св 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0). Концентрация NA+ и формиата натрия в кювете составляла 1,5 мМ и 0,3 М соответственно.
Термостабильность ФДГ измеряли в 0,1 М калий-фосфатном буфере (рН 7,0). Для каждой формы ФДГ готовили серию пластиковых пробирок объемом 1,5 мл, содержащих по 100 мкл раствора фермента (0,2 мг/мл). Пробирки помещали в предварительно прогретый до необходимой температуры водный термостат (точность термостатирования ±0,1°С). В моменты отбора проб пробирки с ферментными препаратами переносили в лед на 5 мин. Для реактивации препаратов ФДГ пробирки помещали на 200 мин в прогретый до 30°С водный термостат. Остаточную активность ФДГ измеряли, как описано выше. Кине-
тику реактивации изучали при комнатной температуре (22°C).
Анализ кинетических данных проводили в программе Sigma plot 2000.
Результаты экспериментов
Бактериальные ФДГ более устойчивы к тепловой денатурации, чем их аналоги из метилотрофных дрожжей. При 57°С период полуинактивации (t1/2) реком-бинантной ФДГ из метилотрофных дрожжей C. boidinii (СЬоФДГ) составляет 20 мин [17], а фермент из бактерий Pseudomonas sp.101 (РвеФДГ) остается стабильным в течение нескольких дней [18]. Мы обнаружили, что ФДГ пекарских дрожжей ^ееФДГ) обладает необычно низкой термостабильностью даже по сравнению с другими дрожжевыми ФДГ. Инкубация препаратов фермента в течение 20 мин при 45°С приводит к полной потере активности.
Теоретически возможны несколько различных механизмов инактивации SceФДГ. Потеря активности бактериальной ФДГ при 4—37°С связана с окислением сульфгидрильных групп [19]. Процесс протекает в несколько стадий, и кривая инактивации имеет S-образную форму. При температуре выше 50°С инактивация РзеФДГ обусловлена термоденатурацией и описывается кинетикой реакции первого порядка [18, 19]. Инактивация ФДГ из метилотрофных дрожжей протекает по механизму тепловой денатурации как при низких, так и при высоких температурах [17, 20, 21]. Кривые инактивации этих ферментов также представляют собой простые экспоненты.
В связи с низкой термостабильностью SceФДГ кинетику инактивации фермента пекарских дрожжей изучали в диапазоне температур 37—50°С. Оказалось, что при 37°С SceФДГ теряет лишь около 50% активности. Это позволяет предположить, что процесс является обратимым:
N ^
->
[NL
где [Ы]0 — концентрация активного фермента, [N1^ — концентрация активного фермента после достижения равновесия. Экспериментальные данные линеаризуются в координатах 1п([М]-[М]^)—У (рис. 1).
Последующая инкубация препаратов фермента при 20—30°С приводит к восстановлению активности до исходного уровня. Реактивация при 22°С представляет собой необратимую реакцию первого порядка:
к
-1
■>N.
Эту кинетическую схему описывает уравнение:
И = Ио+(Имакс-Ио)х (1-е -1 ), где ^]0 — исходная концентрация активного фермента после денатурации при 37°С, [^макс — концентрация активного фермента после завершения процесса реактивации. Зависимость активности от времени представляет собой прямую в координатах
МОТмакс- [N1) -/ (рис. 1).
При 45°С полной реактивации БсеФДГ не наблюдается, что указывает на наличие при этой температуре второй (необратимой) стадии инактивации белка. Зависимость суммарной концентрации активной БсеФДГ и промежуточного продукта, выраженной в единицах активности, от времени инактивации при 45°С можно получить, измерив остаточную активность БсеФДГ после реактивации препаратов фермента при 30°С (рис. 2). Если из данной кривой вычесть кривую инактивации, можно получить кинетическую кривую для промежуточного продукта.
Таким образом, термоинактивация БсеФДГ протекает в две стадии, первая из которых обратима. Это означает, что ФДГ пекарских дрожжей принципиально отличается от всех известных на сегодняшний день формиатдегидрогеназ по механизму тепловой денатурации.
Зависимость остаточной активности от времени описывается уравнением:
-(к+кУ
= X (1-е -1 1 ).
Отношение констант для прямой и обратной стадий может быть рассчитано по уравнению
Рис. 1. Инактивация БсеФДГ при 37°С (а) и реактивация при 22°С (б) в координатах \п(Х)-1; для 37°С X = [К] - для 22°С X = [М]^ - № 0,1 М калий-фосфатный буфер (рН 7,0)
-1
Рис. 2. Зависимость остаточной активности БсеФДГ от времени: инактивация при 45°С (а); при 45°С с реактивацией при 30°С (б); в - разность между б и а (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,0)
Ионная сила оказывает очень большое влияние на термостабильность БсеФДГ. Из литературы известно, что растворы солей стабилизируют другие бактериальные и дрожжевые ФДГ: РзеФДГ [22], СтеФДГ [20] и СЬоФДГ [17, 21]. Так, для нативной СтеФДГ в присутствии 0,3 М формиата или ацетата натрия значение 1у2 увеличивается в несколько раз при разных температурах. Влияние ионной силы на термостабильность БсеФДГ оказалось гораздо выше. Первоначально эффект наблюдали при очистке дрожжевого фермента. Первая стадия очистки БсеФДГ представляла собой осаждение балластных белков сульфатом аммония. Оказалось, что добавление 1 М сульфата аммония к препаратам белка, полученным из бесклеточного экстракта, повышает значение ¿1/2при 51°С с экспериментально не различимой величины до 20 мин. В присутствии 2 М сульфата аммония для очищенной БсеФДГ были получены кривые инактивации в диапазоне температур 53—57°С (рис. 3). Периоды полуинактивации фермента при 55 и 57°С составляют соответственно 90 и 5 мин. 2 М сульфат аммония стабилизирует БсеФДГ на 15°С — до уровня аналогов этого фермента, выделенных из метилотрофных дрожжей. Аналогичная стабилизация наблюдалась и в присутствии формиата натрия (данные не показаны), т.е. эффект не является специфическим.
Ферментативная реакция с участием БсеФДГ протекает согласно двухсубстратной упорядоченной схеме, где N А+ является первым связываемым субстратом [23]. Связывание кофактора приводит к дополнительной стабилизации БсеФДГ. Действительно, в присутствии 10 мМ МА+ значение ¿1/2 для БсеФДГ
при 42,5°С увеличивается в 36 раз и составляет около 90 мин. Благодаря специфической стабилизации кофактором и неспецифической стабилизации ионной силой, зависимость активности БсеФДГ от температуры представляет собой экспоненту в диапазоне температур 10—50°С (рис. 4).
Обсуждение результатов
Одной из основных причин низкой термостабильности ФДГ пекарских дрожжей может быть повышенная гибкость полипептидной цепи, благодаря чему нативная конформация этого белка является более "релаксированной". На это указывает достаточно легкий взаимный переход нативной и обратимо денатурированной форм БсеФДГ при 30—40°С. Наблюдаемая стабилизация фермента кофактором и
Рис. 3. Зависимость остаточной активности БсеФДГ от времени: инактивация БсеФДГ при 50°С (а) и при 50°С с реактивацией при 30°С (б); инактивация в присутствии 2 М сульфата аммония при температуре, °С: в - 53, г -55, д - 58 (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,0)
Рис. 4. Температурная зависимость активности БсеФДГ (0,1 М калий-фосфатный буфер, рН 7,0)
ионной силой также подтверждает данный вывод. Образование комплекса фермент-кофактор фиксирует активную конформацию белка, за счет чего наблюдается повышение устойчивости БсеФДГ к тепловой денатурации. Аналогичные примеры можно найти в литературе. Например, связывание NAP+ в районе контакта двух димеров глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы человека стабилизирует тетрамерную молекулу этого фермента [24]. Повышение ионной силы приводит к увеличению гидрофобных взаимодействий в БсеФДГ и снижает подвижность белковой глобулы. Для дальнейшей стабилизации ФДГ пекарских дрожжей большой интерес представляют методы белковой инженерии. Мы предполагаем, что введение в белковую глобулу остатков пролина по-
зволит дополнительно повысить жесткость полипептидной цепи БсеФДГ.
Функция ФДГ в клетках пекарских дрожжей до сих пор неизвестна. В метилотрофных организмах ФДГ играют ключевую роль в метаболизме, катализируя финальный шаг катаболизма С1-соединений [2]. Поскольку пекарские дрожжи не содержат алко-гольоксидазы, они не могут использовать в качестве питательного субстрата метанол [25]. Однако пекарские дрожжи имеют возможность для утилизации формальдегида до углекислого газа [9]. Вероятно, отличия в стабильности и механизмах термоинактивации ФДГ из метилотрофов и пекарских дрожжей обусловлены особыми биохимическими функциями БсеФДГ в клетке cerevisiae.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ (проект РФФИ а-05-04-49073).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. SeelbachK., RiebelB., Hummel W., Kula M.R., Tishkov V.I., Egorov
A.M., Wandrey C., Kragl U. II Tetrahedron Lett. 1996. 37. P. 1377.
2. Popov V.O., Lamzin V.S. IIBiochem. J. 1994. 301. P. 625.
3. Tishkov V.I., Galkin A.G., Marchenko G.N., Tsygankov Y.D.,
Egorov A.M. II Biotechnol. Appl. Biochem. 1993. 18. P. 201.
4. Galkin A., Kulakova L., Tishkov V., Esaki N., Soda K. II Appl.
Microbiol. Biotechnol. 1995. 44. P. 479.
5. Beja O, AravindL., Koonin E. V. et al. II Science. 2000. 289. P. 1902.
6. Allen S.J., Holbrook J.J. II Gene. 1995. 162. P. 99.
7. Sakai Y., Murdanoto A.P., Konishi T., Iwamatsu A., Kato N. II J.
Bacteriol. 1997. 179. P. 4480.
8. Hollenberg C.P., Janowicz Z. II European Patent Application. 1989.
9. van den Berg M.A., Steensma H. Y. II Yeast. 1997. 13. P. 551.
10. Chow C.M., RajBhandary U.L. II J. Bacteriol. 1993. 175. P. 3703.
11. Saleeba J.A., Cobbett C.S., Hynes M.J. II Mol. Gen. Genet. 1992. 235. P. 349.
12. Olson B.J.S.C., Skavdahl M., Ramberg H., Osterman J.C., Markwell J. II Plant Sci. 2000. 159. P. 205.
13. Colas d.F.-S., Ambard-Bretteville F., Small I.D., Remy R. II Plant Physiol. 1993. 102. P. 1171.
14. Shiraishi T., Fukusaki E., Kobayashi A. II J. Biosci. Bioeng. 2000. 89. P. 241.
15. Suzuki K., Itai R., Suzuki K. et al II Plant Physiol. 1998. 116. P. 725.
16. Tishkov V.I., Matorin A.D., Rojkova A.M. et al. II FEBS Lett. 1996. 390. P. 104.
17. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. II Eur. J. Biochem. 2000. 267. P. 1280.
18. Rojkova A.M., Galkin A.G., Kulakova L.B. et al. II FEBS Lett. 1999.
445. P. 183.
19. ДиковМ.М., Карулин А., ОсиповА.П., ЕгоровА.М. II Биоорган.
химия. 1979. 5(8). С. 1217.
20. Avilova T. V., Egorova O.A., Ioanesyan L.S., Egorov,A.M. II Eur. J.
Biochem. 1985. 152. P. 657.
21. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров А.М. II Биохимия. 1989. 54. C. 299.
22. ТишковВ.И., ПоповВ.О. II Биохимия. 2004. 69. C.1537
23. Серов А.Е., Попова А.С., Тишков В.И. II Докл. АН. 2002. 382. С. 401.
24. Au S. W., Gover S., Lam V. M., Adams M.J. II Structure Fold. Des. 2000. 8. P. 293.
25. DistelB, Veenhuis M., TabakH.F. II EMBO J. 1987. 6. P. 3111.
Поступила в редакцию 01.12.05
BAKING YEAST FORMATE DEHYDROGENASE: UNUSUAL MECHANISM OF THERMAL INACTIVATION AND STABILIZATION BY IONIC STRENGTH AND COFACTOR
A.E. Serov, V. I. Tishkov
(Division of Chemical Enzymology)
Mechanism of thermal inactivation of baker's yeast formate dehydrogenase (SceFDH) is uniquie for the family of NAD+-dependent FDHs. The enzyme inactivates in two stages with the first one being reversible, while the denaturation of other FDHs is described by non-reversible first-order kinetics. Unusual mechanism of inactivation and low thermal stability of SceFDH are most probably connected with the flexibility of its polypeptide chain. SceFDH is observed to be highly stabilyzied by ionic strength and cofactor.
