CC BY
22
УДК 577.15
СРАВНЕНИЕ ТЕРМОСТАБИЛЬНОСТИ НОВЫХ ФОРМИАТДЕГИДРОГЕНАЗ С ПОМОЩЬЮ ДИФФЕРЕНЦИАЛЬНОЙ СКАНИРУЮЩЕЙ КАЛОРИМЕТРИИ
А.А. Пометун1,2, С.Ю. Клейменов1,4, С.А. Зарубина2,3, И.С. Каргов1,2,3, П.Д. Паршин2,3, Э.Г. Садыхов1, С.С. Савин2,3, В.И. Тишков1,2,3
(1 Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН; 2ООО «Инновации и высокие технологии МГУ»; Зхимический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова; Институт биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН; *e-mail: [email protected])
В нашей лаборатории проводятся систематические исследования формиатдегидро-геназ (ФДГ) из разных источников. За последние несколько лет были клонированы и экспрессированы в клетках E. coli новые гены четырех ФДГ из патогенных бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH), метилотрофных термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha (OpaFDH), дрожжей Saccharomyces cerevisiae (SceFDH) и мха Physcomitrella patens (PpaFDH). С помощью дифференциальной сканирующей калориметрии проведен сравнительный анализ температурной стабильности новых рекомбинантных формиатдегидрогеназ и ряда ФДГ из других источников. Показано, что два новых фермента - SauFDH и OpaFDH - по своей стабильности сравнимы с ФДГ из бактерий Pseudomonas sp. 101. Наименее стабильной среди описанных ФДГ оказалась SceFDH.
Ключевые слова: термостабильность, формиатдегидрогеназа, дифференциальная сканирующая калориметрия.
Список сокращений: ДСК - дифференциальная сканирующая калориметрия, SauFDH, PseFDH, OpaFDH, CboFDH, SceFDH, AthFDH, SoyFDH и PpaFDH - рекомбинантные формиатдегидрогеназы из бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas sp. 101, метилотрофных дрожжей Ogataea parapolymorpha и Candida boidinii, пекарских дрожжей, растения A. thaliana, сои Glycine max и мха Physcomitrella patens соответственно.
Формиатдегидрогеназы (ФДГ, КФ 1.2.1.2.) из разных источников изучаются в нашей лаборатории в течение многих лет [1-3]. ФДГ присутствует в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также высших и низших растениях. Важность исследования этого фермента обусловлена следующими факторами: ФДГ активно применяется на практике в качестве биокатализатора для регенерации кофактора [4], а также играет важную роль в жизнедеятельности различных организмов [1, 3]. Для того чтобы оценить возможность использования формиатде-гидрогеназы в качестве биокатализатора, необходимо обладать информацией о кинетических параметрах и стабильности этого фермента.
Гены, кодирующие ФДГ в разных организмах, были успешно клонированы в E. coli во многих лабораториях мира. Создание эффективных экс-прессирующих векторов позволило получить рекомбинантные ФДГ в активной и растворимой формах. В нашей лаборатории имеется самая большая в мире коллекция клонированных ге-
нов ФДГ. В эту коллекцию входят гены из бактерий Pseudomonas sp. 101 (PseFDH), Moraxella sp. C-1, Mycobacterium vaccae N10, метилотрофных дрожжей Candida boidinii (CboFDH), растений Arabidopsis thaliana (AthFDH) и сои Gycine max (SoyFDH). В течение последних лет нами были клонированы и экспрессированы в активной форме новые гены ФДГ из патогенных бактерий Staphylococcus aureus (SauFDH), метилотрофных термотолерантных дрожжей Ogataea parapolymorpha (OpaFDH), пекарских дрожжей (SceFDH) и мха Physcomitrella patens (PpaFDH).
Исследование температурной стабильности ФДГ представляет собой важную задачу, так как многие биокаталитические процессы проводят в течение длительного времени при повышенной температуре. Как правило, температурную стабильность формиадегидрогеназ изучают двумя методами - по кинетике инактивации и методом дифференциальной сканирующей калориметрии (ДСК). В данной работе нами было проведено
сравнительное исследование термостабильности четырех новых и некоторых ранее полученных рекомбинантных ФДГ методом ДСК.
Экспериментальная часть
Экспрессия рекомбинантных формиатде-гидрогеназ. Экспрессию генов, кодирующих целевую формиатдегидрогеназу, проводили в клетках E. coli BL21(DE3)CodonPlus/pLysS. Культивирование штаммов-продуцентов рекомбинантных ФДГ осуществляли по следующей методике. Музейную культуру клеток высевали в питательную среду 2YT (16 г/л триптона, 10 г/л дрожжевого экстракта, 1 г/л хлорида натрия, 1,5 г/л одноза-мещенного фосфата натрия, 1 г/л двузамещен-ного фосфата калия; рН 7,0) и инкубировали в течение ночи (37 °С, 180 об/мин) в присутствии антибиотиков (150 мкг/мл Amp для PseFDH, SauFDH, CboFDH, SceFDH, AthFDH, SoyFDH и 30 мкг/мл Kan для PpaFDH, OpaFDH) и хлорам-феникола (25 мкг/мл). На следующем этапе ночную культуру пересевали в аналогичную свежую питательную среду с такой же концентрацией антибиотиков и культивировали при 30 °С в специальных колбах с отбойниками объемом 250 мл или 1 л. Объем посевного материала составлял 10-15% от общего объема среды (20% от объема колбы). Далее по достижении поглощения суспензии клеток при 600 нм (А600) 0,6-0,8 в среду добавляли индуктор биосинтеза ФДГ лактозу до конечной концентрации 20 мг/мл. Затем клетки культивировали при максимальной аэрации в течение ночи при температуре 20 °С для SoyFDH, 25 °С для CboFDH, SauFDH, PpaFDH и 30 °С для остальных ферментов. Клетки осаждали на центрифуге «Beckman J-21» (США) при 6000 об/мин в течение 20 мин при 4 °С.
Очистка рекомбинантных ферментов. Ферменты, экспрессированные в клетках E. coli, очищали согласно методике, разработанной для рекомбинатной ФДГ из Pseudomonas sp. 101 [5]. Процесс очистки фермента включал разрушение клеток (суспензия 2 г биомассы в 10 мл 0,1 М натрий-фосфатного буфера, 0,01 M ЭДТА; рН 8,0) при 0 °С на ультразвуковом дезинтеграторе «BraunSonic» (Германия), термообработку в течение 10 мин (при 55 °С для PseFDH, SauFDH и при 50 °С для OpaFDH), высаживание балластных белков сульфатом аммония (35% от насыщения). Для SoyFDH и PpaFDH проводили дополнительное высаживание при концентрации сульфата аммония 85% от насыщения и последующее перерастворение в растворе сульфата аммония (35% от насыщения) в 0,1 М фос-
фатном буфере, рН 7,0 (раствор А). Далее проводили гидрофобную хроматографию на «Phenyl Sepharose Fast Flow» («Amersham») в нисходящем градиенте концентрации сульфата аммония (35-0% от насыщения) и гель-фильтрацию на колонке с Сефакрил S-200. Чистоту полученных препаратов контролировали с помощью аналитического электрофореза в 12%-м полиакрила-мидном геле в присутствии 0,1%-го додециль-сульфата натрия (аппаратура для электрофореза фирмы «BioRad»). Полученные препараты были не менее 98% степени чистоты.
Определение температурной стабильности методом дифференциальной сканирующей калориметрии. Исследование температурной стабильности проводили на дифференциальном адиабатическом сканирующем микрокалориметре «Nano DSC». Рабочий объем капиллярных калориметрических ячеек из платины составлял 300 мкл. Для предотвращения образования пузырьков и закипания растворов при повышении температуры в ячейках калориметра поддерживалось избыточное давление 3 aтм. Перед проведением эксперимента определяли инструментальную базовую линию. При измерениях в контрольную ячейку помещали буферный раствор, а в рабочую - раствор исследуемой ФДГ в том же буферном растворе. Концентрация ферментов составляла 1-2 мг/мл, а скорость прогрева - 1 °С/мин.
Результаты и их обсуждение
Сравнителный анализ первичной структуры ферментов одного семейства, как правило, позволяет понять взаимосвязь между свойствами конкретных ферментов и наличием/отсутствием определенных аминокислотных остатков в их последовательностях. На рис. 1 представлено выравнивание аминокислотных последовательностей формиатдегидрогеназ из разных источников, для которых было проведено изучение температурной стабильности. Звездочками выделены консервативные аминокислотные остатки. Из рис. 1 видно, что на N-конце у растительных ферментов находится специфическая последовательность, называемая сигнальным пептидом (у AthFDH и SoyFDH выделены курсивом). Практически все растительные про-ФДГ, имеющие сигнальный пептид, неактивны. Из литературы известно, что этот фрагмент отщепляется после транспорта ФДГ из цитоплазмы в митохондрии. Фермент из мха (PpaFDH) имеет один из самых длинных сигнальных пептидов по сравнению с другими ФДГ растений [3]. Кроме того,
Cn Cn
OpaFDH --------------------------------------------------------MGKWLVLYDAGKHAQDEERL-----------------------------YGCTENALGIRDWLEKQ
CboFDH ---------------------------------------------------------MKIVLVLYDAGKHAADEEKL-----------------------------YGCTENKLGIANWLKDQ
SceFDH ------------------------------------------------------MS KGKVL L VL У E GGKHAE E QE KL-----------------------------LGCIENELGIRNF IE EQ
SauFDH ------------------------------------------------------ MSNGAVFFVIFLKQATCHTYFKEVKIYHLGEMDMKIVALFPEAVEGQENQLLNTKKA-IGLKT FLEER
PseFDH --------------------------------------------------------MAKVLC VL YDD PVD G Y PKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTP KAID FT PGQLLGSVSGELGLRKYLE SN
SoyFDH -----------MLNF TLKMSDP TLAQPHLVKVHTTLETWTTHNHNHKP SINÄS GEKKKIVGVF Y KGNEYA-----------------------------KLNPNFVGCVEGALGIREWLESQ
AthFDH ----------------------MAMRQAAKA Г ГЛАС SSSSSSGYFARR QFNA SS GD S KKIVGVFY KANEYА-----------------------------TKNPNFLGCVENALGIRDWLESQ
PpaFDH ----MASRRIGGVLLAGSRALSRQHGLTGASAADSQILQRHLQFSRFS YSSAAGGES KKILGVFFAAHE YA------------------------------KNPEFLGC VEN ALGIRE WLE S К
OpaFDH GHELVVTSKEGE-NSVLEKNIPDADVI ISTPFHPAYITKERIDKAKKLKLLWAGVGSDHID№YINQSGRD^
CboFDH GHELI TT S KEGE - T SELDKHIPD AD IIITTPFH PAYITKERLDKAKNIKLVWAGVGSDH IDLDYINQT GKKISVLEVTG SNWS VAEHWMTMLVLVRNFV РАНЕ Q11NHDWEVAAIAKD AY
SceFDH G YEL VTTI KD РЕ PT ST VDRE LKD AEIVITTPFF PAY IS RNRIAEAPNL KLC VT AG VGSD EiVD LEAANE—RKITVTE VTG SNWS VAE HVMATILVLIRNYNGGHQQAINGEWDI AG VAKNE Y
SauFDH GHEFIILANGED----LDKHLPDMDVIISAPFYPAYMTRERIEKAPNLKLAITAGVGSDHVDLAAASE--HNIGWEVTGSNTVSVAEHAVMDLLILLRNYEEGHRQSVEGEWNLSQVGNHAH
PseFDH GHTLWTSKDGP-DSVFERELVDADWISQPFWPAYLTPERIAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQS
SoyFDH GHQYIVTDKEGP-DSELEKHIPDAHVIISTPFHPAYVTAERIKKAKNLELLLTAGIGSDHVDLKAAAA--AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILMI^FLPGYHQAWG
AthFDH GHQYIVTDKEGF-DCELEKHIPDLHVLISTPFHPAYVTAERIKKAKNLKLLLTAGIGSDHIDLQAAAA--AGLTVAEVTGSNVVSVM
PpaFDH GHKYWTSKDGP-DSELDKELADAHILITTPFHPAYOTKERLAKAK^ELLVTAGVGS
* * ick *** ie к к к kick kkkk kk к kkk к kkkk к
OpaFDH DIE G KVT AT IG AGRIGRVL E RLVAFN PKELLYYDYQSL SRE AE EKVGAR------------RVH DIKE LVAQADI VT I NC PLHAG S KG L VN AE L LKHFKKGAWLVNTARGAI CVAED VAAAVK
CboFDH DIEGKTIATIG AGR IGRVL ERLLPFNPKELLYYDY Q AL PKE AE EKVGAR------------RVE NIE E L VAQAD I VT VNA PL HAG T KG LIN KE L LS KF KKGA WL VN TARG AI CVAED VAAALE
SceFDH DLEDKIISTVGAGRIGRVLERLVAFNPKKLLYYDYQELPAEAINRLNEASKLFNGRGDIVQRVEKLEDMVAQSDVVTINCPLHKDSRGLFNKKLISHMKDGAYLVNTARGAICVAEDVAEAVK
SauFDH E LQHKT IG IFGFGRIGLVAERLAPFNVT LQHYDPINQQDHKLS К------------------FVSFDELVSSSDAITIHAPLTPETDNLFDKDVLSRMKKHSYLVNTARGKIVNRDALVEALA
PseFDH D LE АМН VG T VAAGRIGAVL RRL AP FD VH - L HYTDRHRL PE S VE KE LNL T------------WHAT RE DM Y PVCDWT LNC PLH РЕ ТЕ HM INDE T LKLFKRGA YIVNTARGKLCD RD AVARALE
SoyFDH D LE GKT VGT VGAGRIGLLL QRLKF FNCN - LLYYDRLRMNTD LE KE IGAK------------FEE D LD AML PKCDVI VI NMPLTEQTRGLFD KNRIAKC KKGWIVNNARGAIMDTQAI ADAC S
AthFDH DLEGKTIGTVGAGRrGLLLQRLKPFGCW-LLYHDRLQMAPELEKETGAK-------------FVEDLNEMLPKCDVI VI NMPLTEKTRGMFNKE LIGKLKKGVLIVNNARGAIMERQAWD AVE
PpaFDH DL IDRT VGT VGGGR IGE LMKRLKGFGLKEMLYYDRN SLGAEREKE L GCK------------RE TD LD TML SKCDWWNT PLTDQTRG L FKKER IAKMKKGAYLVNNARGAIADTEAVKEACE
* * * * * ** +* *
OpaFDH CboFDH SceFDH SauFDH PseFDH SoyFDH AthFDH PpaFDH
SGQLRGYGGD' SGQLRGYGGD' SGKLAGYGGD' SEHLQGYAGD' SGRLAGYAGD SGHVAGYGGD SGHIGGYSGDVW
SGHLGGYGGD'
* ***
PKDHPRSMANKYGAGNAMTPHYSGSVIDAQVRYAQGTKNILESFFTQKFDYRPQDIILLNGKYKTKSYG-ADK-----------------
PKDHPRDMRNKYGAGNAMTFHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQDIILLNGEYVTKAYGKHDKK----------------
PKD HF RTMDNKDHVGNAMTVHIS GTSLHAQKRYAQGVKNILNSYFSKKFDYRPQD11VQNGSYATRAYG-QKK-----------------
PADHPRTMPR-----NAMTVHYSGMTLEAQKRIE DGVKDILERFFNHE-PFQDKDIIVASGRIASKSYTAK-------------------
PKDHPRTMPY-----NGMTPHISGTTLTAQARYAAGTREILECFFEGR-PIRDEYLIVQGGALAGTGAHSYSKGNATGGSЕЕAAKFKKAV
PKDHPRYMPN-----HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRHFKGE-DFPEQN YIVKEGQLASQYR----------------------
PKDHPRYMPN-----QAMTPHTSGTTIDAQLRYAAGTKDMLERYFKGE-DFPTENYIVKDGELAPQYR----------------------
GKDHPRYMPN-----HAMTPHISGTTLDAQKRFAAGTKDMIDRWLKHE-AFPEQNYIVREGKLASQYL----------------------
**** * ** * ** ** *
Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей формиатдегидрогена из разных источников. OpaFDH - О. parapolvmorpha, CboFDH - Candida boidinii, SceFDH - Saccharomyces cerevisiae, SauFDH - S. aureus, SauFDH, PseFDH - Pseudomonas sp. 101, SoyFDH - Glycine max (soya), AthFDH — Arabidopsis thaliana, PpaFDH - Physcomitrellapatens (мох). Звездочками выделены консервативные аминокислотные остатки. Курсивом выделены подтвержденные последовательности сигнальных пептидов в AthFDH и SoyFDH. Светло- и темно-серым выделены консервативные участки соответственно в кофермент-связывающем
и каталитическом доменах ФДГ
PpaFDH - единственное известное на настоящий момент исключение. Это первый в мире пример среди ФДГ, когда полноразмерный фор-миатдегидрогеназный профермент из растений активен и с неотщепленным сигнальным пептидом. Частичная делеция сигнального пептида очень слабо влияет на каталитические параметры (данные в печати), однако выход активного фермента зависит от длины отщепляемой последовательности. На рис. 1 показано, что ФДГ из S. aureus имеет в первичной структуре существенные отличия от других ферментов. Степень гомологии у SauFDH с другими бактериальными ФДГ (и с PseFDH) составляет менее 40%.
На рис. 2 представлены кривые плавления исследованных формиатдегидрогеназ. Кроме новых ФДГ приведены данные для ряда ферментов, которые считаются модельными для фор-миатдегидрогеназ из различных источников. Основным параметром, характеризующим стабильность ФДГ в случае ДСК, считается значение температуры максимума на этих кривых. Из рис. 2 видно, что самой высокой стабильностью обладают бактериальные формиатдегидроге-назы SauFDH и PseFDH. Следом идет ФДГ из термотолерантных дрожжей O. parapolymorpha (OpaFDH). Она сильно превосходит по этому параметру высокогомологичную ФДГ из мети-лотрофных дрожжей Candida boidinii (CboFDH),
которая в настоящее время широко применяется на практике. С учетом того, что и по каталитическим свойствам ОраРЭН превосходит СЬоРЭН, можно полагать, что в ближайшем будущем ОраРЭН также найдет применение на практике. Самой низкой стабильностью обладает ФДГ из дрожжей ^ cerevisiae (8сеРВН), которая вообще оказалась одной из самых нестабильных среди описанных формиатдегидрогеназ. Две ФДГ растений (8оуРЭН и новая РраРЭН) также обладают невысокой температурной стабильностью, однако ФДГ из A. ^Шт намного стабильнее и даже превосходит по стабильности дрожжевую СЬоРЭН.
Анализ выравнивания аминокислотных последовательностей позволяет выявить ряд закономерностей, которые и обусловливают различия исследованных формиатдегирогеназ по термостабильности. Высокая температурная стабильность в случае бактериальных форми-атдегидрогеназ частично обусловлена наличием дополнительной последовательности на Оконце (рис. 1). Эта дополнительная последовательность содержит до 7 остатков проли-на и, как было показано ранее [6], представляет собой неструктурированную жесткую петлю, которая отвечает за обеспечение стабильности в этом регионе белковой глобулы. Как уже отмечалось выше, ФДГ из золотистого стафи-
30 40 50 60 70 80
Т, X
Рис. 2. Кривые плавления для формиатдегидрогеназ дикого типа из разных источников. SauFDH, PseFDH, OpaFDH, CboFDH, SceFDH, AthFDH, SoyFDH и PpaFDH - рекомбинантные формиатдегидрогеназы из бактерий Staphylococcus aureus и Pseudomonas sp. 101, метило-трофных дрожжей Ogataea parapolymorpha и Candida boidinii, пекарских дрожжей, растения A. thaliana, сои G. max и мха Physcomitrella patens соответственно (0,1 М натрий-фосфатный буфер; pH 7,0; концентрация ферментов 1-2 мг/мл; скорость сканирования 1 град/мин)
лококка сильно отличается от всех остальных формиатдегидрогеназ по своей аминокислотной последовательности. Различия наблюдаются в том числе и в характерной последовательности Gly(Ala)XGlyXXGly (X - любой остаток) для аденинсвязывающего домена (так называемый «finger print», выделен серым фоном на рис. 1), причем остаток Gly в первом положении обеспечивает более оптимальные углы ф и у на карте Рамачандрана. Замена A198G в PseFDH (первый аминокислотный остаток в характеристической последовательности) приводит к повышению термостабильности [7].
Интересно также проанализировать влияние на стабильность ферментов состава полуконсервативной последовательности XP(A/K)QP (в нее входит каталитически важный остаток Gln [5]). У большинства формиатдегидрогеназ эта последовательность представляет собой XPQP, где Х - гидрофобные Phe или Tyr. Было показано, что гидрофилизация этого положения приводит к повышению стабильности. Например, замена остатка Phe190 в SoyFDH на отрицательно заряженные остатки Asp и Glu привела к повышению температурной стабильности более чем в 50 раз [8, 9]. Отметим, что в AthFDH дикого типа в этом положении уже изначально находится остаток Asp, в чем, вероятно, и заключается причина высокой стабильности природного фермента. У PpaFDH в этом положении находится остаток аспарагина, который по дан-
ным направленного мутагенеза SoyFDH не обеспечивает высокую стабильность в отличие от ФДГ сои дикого типа.
Последовательность XP(A/K)QP в SceFDH также имеет нестандартный состав - FKQP (рис. 1), т.е. в дополнение к гидрофобному остатку Phe вместо остатка Pro находится остаток Lys, чем можно объяснить низкую температурную стабильность этого фермента. Данные по стабильности для ферментов из бактерий и дрожжей также согласуются с данными о повышении стабильности при замене остатка фени-лаланина в положении X на остаток тирозина [10]. Ранее для SoyFDH [9] и для PseFDH [10] было показано, что замена F/Y в этом положении приводит к увеличению температурной стабильности PseFDH, CboFDH и SoyFDH. В этом положении в OpaFDH и SauFDH исходно находится остаток тирозина, чем и можно объяснить более высокую стабильность этих ферментов по сравнению с CboFDH и PseFDH соответственно, у которых в указанном положении стоит остаток фенилаланина.
В заключение хотелось бы отметить, что данные ДСК по стабильности новых ферментов хорошо согласуются с ранее опубликованными результатами по изучению стабильности других ФДГ [8-12], а также с данными по термостабильности, полученными при изучении кинетики термоинактивации при разных значениях температуры.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда (проект № 16-14-00043) и Российского фонда фундаментальных исследований
(проект № 17-04-01469а).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Тишков В.И., Попов В.О. // Биохимия. 2004. Т. 69. № 11. С. 1537.
2. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006. Vol. 23. N 2-3. P. 89.
3. Алексеева А.А., Савин С.С., Тишков В.И. // Acta Naturae. 2011. Т. 3. № 11. С. 40.
4. Hummel W.; Kula M.R. // Eur. J. Biochem. 1989. Vol. 184. N 1. P. 1.
5. Tishkov V.I., Matorin A.D., Rojkova A.M., Fedorchuk V.V. Savitsky A.P., Dementieva L.A., Lamzin VS., Me-zentzev A.V, Popov V.O. // FEBS Lett. 1996. Vol. 390. N 1. P. 104.
6. Федорчук В.В., Галкин А.Г., Ясный И.Е., Кулакова Л.Б., Рожкова А.М., Филиппова А.А., Тишков В.И. // Биохимия. 2002. Т. 67. N 10. С. 1385.
7. Алексеева А.А., Федорчук В.В., Зарубина С.А.,
Садыхов Э.Г., Маторин А.Д, Савин С. С., Тишков В.И. // Acta Naturae. 2015. Vol. 7. N 1(24). С. 64.
8. Alekseeva A.A., Serenko A.A., Kargov I.S., Savin S.S., Kleymenov S.Yu., Tishkov V.I. // PEDS. 2012. Vol. 25. N 11. P. 781.
9. Kargov, I.S., Kleymenov, S.Y., Savin, S.S., Tishkov, V.I., Alekseeva, A.A. // PEDS. 2015. Vol. 28. N 6. P. 171.
10. Tishkov V.I., Goncharenko K.V., Alekseeva A.A., Kleymenov S.Yu., Savin S.S. // Biochemistry (Moscow). 2015. Vol. 80. N 13. P. 1690.
11. Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Войнова Н.С., Угланова С.В., Петров А. С., Алексеева А.А., Клейменов С.Ю., Попов В.О., Тишков В.И. // Прикл. биохимия микробиол. 2006. Т. 42. № 3. C. 269.
12. Алексеева А.А., Каргов И.С., Клейменов С.Ю., Савин С.С., Тишков В.И. // Acta Naturae. 2015. Vol. 7. N 3(26). С. 61.
Поступила в редакцию 27.11.2017
COMPARISON OF THERMAL STABILITY OF NEW FORMATE DEHYDROGENASES WITH DIFFERENTIAL SCANNING CALORIMETRY
A.A. Pometun12, S.Yu. Kleymenov 14, S.A. Zarubina2,3, I.S. Kargov1'2'3, P.D. Parshin2,3, E.G. Sadykhov1, S.S. Savin2,3, V.I. Tishkov1,2,3*
(lA.N. Bach Institute of Biochemistry, Federal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology» of the RAS; 2Innovations and High Technologies MSU Ltd.; 3 Department of Chemistry, M.V. Lomonosov Moscow State University; 4Koltzov Institute of Developmental Biology; e-mail: [email protected])
Systematic study of formate dehydrogenases (FDH) from different sources are carried out in our laboratory. Recently, new genes encoded FDH from pathogenic bacterium Staphylococcus aureus (SauFDH), methylotrophic thermotolerant yeast Ogataea parapolymorpha (OpaFDH), yeast Saccharomyces cerevisiae (SceFDH) and moss Physcomitrella patens (PpaFDH) were cloned and expressed in our laboratory. The comparative analysis of thermal stability for new recombinant formate dehydrogenases was made with differential scanning calorimetry. It was shown that two new enzymes -SauFDH and OpaFDH were comparable in stability to FDH from bacterium Pseudomonas sp 101. SceFDH showed the lowest thermalstability compare to all described formate dehydrogenases.
Key words: thermal stability, formate dehydrogenase, differential scanning calorimetry.
Сведения об авторах: Пометун Анастасия Александровна - науч. сотр. Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, ст. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. хим. наук ([email protected]); Клейменов Сергей Юрьевич - ст. науч. сотр. Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН, ст. науч. сотр., Институт биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. биол. наук ([email protected]); Зарубина София Александровна - аспирант химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, мл. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ» ([email protected]); Каргов Иван Сергеевич - аспирант химического факультета МГУ имени М. В. Ломоносова, Институт биохимии им. А. Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, мл. науч. сотр. ООО «Инновации и высокие технологии МГУ» (ikar,[email protected]); Паршин Павел Дмитриевич - студент химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова (parshin.p04@ gmail.com); Садыхов Эльчин Гусейнович - зам. директора по инновационной работе, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, канд. хим. наук ([email protected]); Савин Святослав Сергеевич - науч. сотр. химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова, ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», канд. биол. наук ([email protected]); Тишков Владимир Иванович - профессор химического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова; зав. лабораторией молекулярной инженерии Института биохимии им. А.Н. Баха, Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» Российской Академии наук; ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», докт. хим. наук ([email protected]).
