Nad +-зависимая формиатдегидрогеназа растений Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

УДК 577.1:577.15

NAD+-зависимая

формиатдегидрогеназа растений

А. А. Алексеева1,2,3, С. С. Савин2,3, В. И. Тишков1,2,3*

Химический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова, 119991, Москва, Ленинские горы, 1, стр. 3

2ООО «Инновации и высокие технологии МГУ», 109559, Москва, Цимлянская ул., 16, оф. 96 3Учреждение Российской академии наук Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 119071, Москва, Ленинский просп., 33 *E-mail: [email protected] Поступила в редакцию 05.08.2011 г.

РЕФЕРАТ NAD+^ависимая формиатдегидрогеназа [КФ 1.2.1.2] (FDH), состоящая из двух идентичных субъединиц и не содержащая простетических групп и ионов металлов, широко распространена в природе. FDH этого типа найдены в различных микроорганизмах (включая патогенные) - в бактериях, дрожжах, микроскопических грибах, а также в растениях. В отличие от FDH микробного происхождения, находящихся в цитоплазме, растительные FDH локализованы в митохондриях. Впервые формиатдегидрогеназную активность описали еще в 1921 г. именно в растениях, однако до последнего времени растительные FDH были изучены существенно хуже, чем ферменты микроорганизмов. В представленном обзоре рассмотрены последние достижения в области изучения физиологической роли, свойств, структуры и белковой инженерии формиатдегидрогеназ растений.

КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА растительная формиатдегидрогеназа, физиологическая роль, свойства, структура, экспрессия, Escherichia coli, белковая инженерия.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ FDH - формиатдегидрогеназа; PseFDH, CboFDH - формиатдегидрогеназы бактерий Pseudomonas sp. 101 и дрожжей Candida boidinii; SoyFDH, AthFDH - растительные формиатдегидрогеназы

из сои и Arabidopsis thaliana.

ВВЕДЕНИЕ

NAD+-зависимые формиатдегидрогеназы (FDH) [КФ 1.2.1.2] относятся к группе ферментов, катализирующих окисление формиат-иона до углекислого газа при сопряженном восстановлении NAD+ до NADH:

HCOO- + NAD+ ^ ТО2Т + NADH.

На основании различий в структуре можно выделить две большие группы FDH. В первую группу входят формиатдегидрогеназы анаэробных микроорганизмов и архебактерий. FDH этой группы представляют собой гетероолигомеры со сложной четвертичной структурой и высокой молекулярной массой. Для них характерны наличие в активном центре различных простетических групп (железосерные кластеры, ионы молибдена, вольфрама) и высокая чувствительность к кислороду [1, 2].

Вторую группу образуют NAD+-зависимые фор-миатдегидрогеназы, которые состоят из двух идентичных субъединиц, имеют по два активных центра и не содержат в белковой глобуле ни ионов металлов, ни простетических групп. FDH этой группы принад-

лежат к суперсемейству D-специфичных дегидроге-наз 2-оксикислот [3]. Реакция окисления формиата, катализируемая FDH этой группы, является простейшим примером дегидрирования карбонильных соединений, так как в каталитическом механизме отсутствует стадия переноса протона(ов), а также какие-либо другие стадии кислотно-основного катализа. Скорость реакции в целом ограничивается скоростью переноса гидрид-иона от субстрата на атом С-4 никотинамидного кольца [4]. Таким образом, FDH служит модельным ферментом для изучения механизма переноса гидрид-иона в активном центре деги-дрогеназ, входящих в данное суперсемейство.

Активное и систематическое изучение FDH началось в начале 70-х гг. прошлого века и было в основном посвящено ферментам микроорганизмов. Физиологическая роль микробных FDH различна. Например, в метанолутилизирующих бактериях и дрожжах фермент участвует в снабжении клетки энергией, а в патогенных бактериях и микроскопических грибах FDH является белком стресса. Подробно свойства и белковая инженерия FDH рассмотрены в работах [5, 6].

NAD+-3aBMCMMbie формиатдегидрогеназы растений также относятся ко второй группе FDH. Исследования последних лет показали, что в растениях, как и в патогенных микроорганизмах, FDH также входит в число белков стресса, и ее синтез сильно возрастает в условиях засухи, при резком изменении температуры, облучении жестким ультрафиолетом, воздействии химических реагентов [7-9], гипоксии [10], а также патогенных микроорганизмов [11]. Важность физиологической роли этого фермента обуславливает необходимость изучения растительных FDH. В настоящее время нет ни одной публикации, в которой систематизированы данные о растительных FDH. В представленном обзоре рассмотрены основные особенности растительных формиатдеги-дрогеназ, их кинетические свойства и стабильность, а также подробно описана физиологическая роль.

ИСТОРИЯ ОТКРЫТИЯ, ЛОКАЛИЗАЦИЯ И ФИЗИОЛОГИЧЕСКАЯ РОЛЬ РАСТИТЕЛЬНЫХ FDH

Впервые растительную FDH обнаружили в бобах фасоли (Phaseolus vulgaris) в 1921 г. [12].

Первая попытка детально описать FDH и оценить роль этого фермента в метаболизме растений была предпринята Дэвисоном в 1951 г. [13] на примере фор-миатдегидрогеназ из семян гороха и фасоли. Считалось, что роль FDH заключается в восстановлении NADH, который впоследствии расходуется на образование этанола, сукцината и глутамата в сопряженных реакциях. Таким образом, впервые была обозначена роль FDH как «поставщика» молекул NADH для удовлетворения различных потребностей клетки. В этой же работе было высказано предположение о механизмах появления формиата в растительной клетке. Согласно первой гипотезе формиат мог образоваться вместе с этанолом и уксусной кислотой в результате анаэробного дыхания. Согласно другой гипотезе формиат мог образоваться в процессе окисления гликолевой кислоты, однако однозначные данные, подтверждающие метаболический путь, в ходе которого образуется формиат, отсутствуют.

Первые опыты по определению локализации FDH в клетках растений были проведены в 1956 г. Оказалось, что формиатдегидрогеназная активность присутствует прежде всего в митохондриях [14]. Однако в силу того, что исследуемые образцы были загрязнены другими органеллами, нельзя было однозначно утверждать, что FDH локализована именно в митохондриях. В 1960 г. показали, что FDH находится не только в семенах, но и в других частях растений. Формиатдегидрогеназная активность выявлена в листьях капусты и шпината, корнях редиса и репы, почках цветной капусты, а также в плодах тыквы [15]. На листьях шпината показано, что в растительной

клетке существуют как минимум два пути окисления формиата - с помощью FDH в митохондриях и пе-роксидазы в пероксисомах [16]. Отдельно установили, что при pH > 6 формиат окисляется с помощью FDH в митохондриях, при более кислых значениях pH основную роль в окислении формиата играет перок-сидаза в пероксисомах. Позже установили, что в митохондриях FDH представлена не индивидуальной молекулой, а входит в белковый комплекс массой около 200 кДа [17]. В качестве возможных кандидатов на образование таких комплексов рассматриваются глициндекарбоксилаза и фумараза, концентрация которых возрастает синхронно с ростом активности FDH [9].

В ходе систематических исследований показано, что величина формиатдегидрогеназной активности очень сильно зависит как от вида растения, так и от органа, в котором содержится фермент [18]. Также выявлена зависимость активности фермента от скорости потребления кислорода растением. Так, в растениях с высоким потреблением кислорода (шпинат, табак и др.) формиатдегидрогеназная активность была выше, чем в растениях с низким потреблением (бобовые, зеленый салат и др.) [18]. В этой же работе впервые было высказано предположение, что в результате окисления NADH, полученного с помощью формиатдегидрогеназной реакции, запасенная энергия по электрон-транспортной цепи расходуется на образование АТР, удовлетворяя таким образом энергетическую потребность клетки [18]. К сожалению, большой разброс в активности FDH у растений разного вида не позволяет однозначно ответить на вопрос о роли этого фермента в метаболизме. Взаимосвязь метаболизма формиата и ответа растений на стрессовые воздействия впервые отметили в 1978 г. [19], когда при выращивании ячменя в условиях избыточного увлажнения наблюдали повышенное образование меченого углекислого газа из формиата.

На качественно новый уровень изучение физиологической роли формиатдегидрогеназы растений перешло в 1992 г. [20], когда обнаружили, что митохондрии нефотосинтезирующих тканей картофеля содержат неизвестный полипептид с молекулярной массой около 40 кДа, составляющий до 9% всех белков митохондрий. кДНК этого полипептида клонировали в 1993 г., а анализ кодируемой этой кДНК аминокислотной последовательности показал, что она имеет более чем 55% гомологии с FDH из бактерий Pseudomonas sp. 101 [21]. Сравнение N-концевых последовательностей природной FDH картофеля и клонированного полипептида выявило в последнем присутствие сигнального пептида из 23 аминокислотных остатков, который обеспечивает транспорт профер-

мента из цитоплазмы в митохондрии. Полипептиды с такой же молекулярной массой найдены в растениях гороха, томата, лука и др., причем содержание FDH в митохондриях нефотосинтезирующих тканей (клубни, корни) было примерно в 8 раз выше, чем в листьях [20]. Кроме того, в растениях, выращенных без доступа света (стебли гороха, листья цикория, корни моркови, клубни батата и др.), количество FDH резко возрастало [20].

В настоящее время опубликованы многочисленные данные в пользу того, что FDH синтезируется в большом количестве в условиях, неблагоприятных для роста растений - при засухе, пониженной температуре, воздействии жесткого ультрафиолетового излучения, химических соединений, при недостатке света, железа, а также при пониженном содержании кислорода, однако скорость ответа сильно зависит от типа воздействия. Например, самый быстрый ответ растений картофеля, выраженный синтезом мРНК, наблюдали при непосредственном повреждении растительной ткани (около 20 мин), в то время как время ответа на другие воздействия составило в среднем 8 ч [7]. В условиях нехватки железа количество мРНК формиатдегидрогеназы в корнях ячменя начинало увеличиваться через 1 день и достигало максимума через 14 дней [8, 22], тогда как в листьях синтез формиатдегидрогеназы не увеличился. При анаэробном стрессе концентрация мРНК FDH в корнях ячменя повышалась уже через 12 ч и к 48 ч достигала максимального значения. У приморской сосны биосинтез FDH усиливается в условиях засухи [23]. Повышение уровня мРНК FDH отмечено и в растениях Lotus japonicus, росших в условии гипоксии [10].

Экспрессия генов мха Physcomitrella patens в ответ на стрессовые воздействия изучена в работе [24]. Растения мха обрабатывали абсцизовой кислотой (гормон, индуцирующий переход растений к периоду покоя и способный тормозить рост стеблей; накапливается осенью в семенах и почках), а также охлаждали до +4оС. Обнаружено, что под действием абсцизовой кислоты увеличивается устойчивость мха к воздействию низких температур, а также изменяется набор экспрессируемых генов. FDH - один из ферментов, ген которых экспрессируется в ответ на абсцизовую кислоту. Оказалось, что уровень экспрессии гена FDH возрастает в течение нескольких часов после обработки абсцизовой кислотой, а также при содержании растений на холоду в течение 24 ч. В отсутствие абсцизовой кислоты ответ на воздействие низких температур развивается гораздо медленнее. Обработка хлоридом натрия в больших концентрациях (0.125 и 0.25 М) и маннита (0.25 и 0.5 М) увеличивала как устойчивость мха к действию низких температур, так и экспрессию ряда генов,

в том числе гена FDH. Таким образом, показано, что и у высших растений, и у мхов формиатдегидро-геназа служит белком стресса, и уровень синтеза этого фермента может регулироваться гормонами. Другие растительные гормоны, такие, как ауксин и цитокинин, также влияют на активность FDH у высших растений [25].

Синтез FDH изучен и у Arabidopsis thaliana, подвергнутых различным воздействиям. Это первое растение, у которого определена полная нуклеотид-ная последовательность генома, поэтому во многих случаях A. thaliana используется как модельное растение. Растения опрыскивали различными С1-соединениями: метанолом, формальдегидом, форми-атом, и проводили Нозерн-блот-анализ, используя кДНК FDH в качестве пробы. Наиболее интенсивная экспрессия гена FDH наблюдалась при обработке формальдегидом или метанолом. Более низкий уровень экспрессии наблюдался в образцах, опрысканных формиатом и деионизованной водой. Не обнаружено повышения экспрессии гена FDH в растениях с обрезанными листьями, а также в контрольном экземпляре. Эти данные позволили сделан вывод о том, что синтез FDH индуцируется в большей степени не субстратом - формиатом, а его восстановленной формой - формальдегидом [26]. Показано также [27], что одноуглеродные соединения - метанол, формальдегид и формиат, индуцируют синтез FDH в листьях растений. Метанол влияет непосредственно на синтез FDH-транскриптов, в то время как его окисленные модификации (формальдегид, формиат) могут служить сигнальными молекулами. Анализ N-концевой области фермента позволил предположить, что FDH может транспортироваться и в хлоропласты. Двойная локализация FDH - и в митохондриях, и в хлоропла-стах, показана на трансгенных растениях A. thaliana и табака, содержащих ген AthFDH [28].

Невыясненным остается происхождение формиата в клетках растений, подвергнутых стрессовым воздействиям. Были высказаны предположения, что форми-ат может синтезироваться в процессе фотодыхания, метаболизма метанола, а также из глиоксилата, образующегося из различных продуктов цикла Кребса [7]. Обсуждалось образование формиата из серина, как это происходит в бактериях [1], поскольку добавление серина приводило к увеличению концентрации FDH в растениях картофеля. В ходе дальнейших экспериментов [29] получен трансгенный картофель, в котором подавлен синтез FDH. Оказалось, что в тканях трансгенных растений накапливается формиат, который не окисляется в дальнейшем до углекислого газа. Показано также, что в условиях засухи в трансгенном картофеле образуется большое количество пролина и его предшественника - глутамата.

Метаболизм формиата и его физиологическая роль хорошо изучены [30]. В фотосинтезирующих тканях картофеля формиат служит главным предшественником всех других углеродсодержащих соединений, и синтезируется он главным образом через ферредоксин-зависимую фиксацию углекислого газа. В других тканях формиат является побочным продуктом фотодыхания и неких ферментативных процессов, его образование, по-видимому, может быть результатом непосредственного восстановления углекислого газа в хлоропластах. В растениях картофеля метаболизм формиата связан с синтезом серина.

Тесная взаимосвязь между биосинтезом формиа-та и серина существует и у A. thaliana [31]. Получены три линии трансгенных растений с повышенной экспрессией FDH. Уровень формиата в трансгенных растениях был практически таким же, как и в A. thaliana дикого типа. При добавлении меченого формиа-та образование радиоактивно меченного углекислого газа в трансгенных растениях происходило гораздо интенсивнее, в то время как накопление серина оставалось на прежнем уровне. Трансгенные растения A. thaliana с повышенным уровнем экспрессии гена FDH получены и в работе [32].

Фосфорилирование - важнейший способ регуляции метаболизма. Известно 14 белков митохондрий картофеля, которые могут находиться в фосфорилирован-ном виде [33], в том числе и FDH. Идентифицированы аминокислотные остатки митохондриальной FDH картофеля, которые подвергаются фосфорилированию -Thr76 и Thr333 [34]. Анализ структуры FDH показал, что эти два остатка треонина находятся на поверхности белковой глобулы и могут быть легко доступны для киназ, катализирующих процесс фосфорилиро-вания. Высокий уровень фосфорилирования наблюдается и в субъединице Е1-а пируватдегидрогеназы (ПДГ). Фосфорилирование как FDH, так и пируватде-гидрогеназы регулируется изменением концентрации NAD+, формиата и пирувата, что говорит о сходстве в механизмах регуляции работы этих ферментов. При повышении концентрации NAD+, формиата и пи-рувата уровень фосфорилирования фермента сильно снижается. Предполагается, что пируват может превращаться в формиат в реакции, катализируемой пируват-формиатлиазой (ПФЛ), а далее формиат окисляется при участии FDH.

Как видно из представленных данных, формиат-ион вовлечен в большое количество сложно регулируемых метаболических процессов. Наиболее полную схему участия формиата в метаболизме растений можно найти в работе [11].

Исследования последних лет свидетельствуют, что содержание FDH в митохондриях растений воз-

растает в ответ не только на физические и химические факторы, но и при «биологической атаке». Активацию биосинтеза FDH наблюдали при заражении дуба черешчатого (Quercus robur) патогенным грибом Piloderma croceum [35], пшеницы - грибом Blumeria graminis f. sp. tritici [36] и фасоли (P. vulgaris) - грибом Colletotrichum lindemuthianum [11]. В геноме фасоли имеются три гена FDH, и их экспрессия регулируется типом воздействия. Предполагают, что синтез FDH у пшеницы индуцируется метанолом в результате воздействия пектинметил-эстеразы на пектин. В растениях табака Nicotiana attenuate, поврежденных гусеницами Manduca sexta, происходит выделение конъюгатов жирных кислот, которые запускают синтез ряда белков, в том числе и FDH [37].

В заключение этого раздела отметим, что фор-миатдегидрогеназа - это универсальный фермент, вовлеченный в ответ клеток на стресс, вызванный как экзогенными (негативные воздействия окружающей среды), так и эндогенными (нехватка важнейших микроэлементов, воздействие патогенов) процессами. Это свидетельствует о ключевой роли FDH в процессах метаболизма высших растений. Получение мутантных форм FDH, обладающих повышенной каталитической активностью, и встраивание их генов в геном растений вместо генов ферментов дикого типа открывает принципиально новый подход к созданию растений с повышенной устойчивостью к стрессовым воздействиям.

ОСОБЕННОСТИ ПЕРВИЧНОЙ СТРУКТУРЫ растительных FDH

Активное развитие методов мегасеквенирования привело к тому, что практически каждый день публикуется структура генома различных организмов, включая растения. Поиск в базах данных GenBank (GB), EMBL, а также KEGG (http://www.genome.jp/) позволил найти нуклеотидные последовательности генов (полные или в виде кДНК) растительных FDH более чем из 70 источников. Кроме того, ряд последовательностей, отсутствующих в банках данных, представлен в работе [11]. В табл. 1 приведены названия растений, а также сокращенные обозначения FDH. При сравнении использовали FDH, характерные для различных микроорганизмов, например, ферменты метилотрофных бактерий Pseudomonas sp. 101 (наиболее изученная к настоящему времени FDH) и Moraxella sp. С2, патогенных Burkholderia stabilis и Bordetella bronchiseptica RB50 (Alcaligenes bronchisepticus), глубоководных некультивируе-мых морских альфа-протеобактерий и азотофикси-рующих бактерий Sinorhizobium meliloti, дрожжей Saccharomyces cerevisiae и Candida boidinii.

Таблица 1. Источники и сокращенные обозначения формиатдегидрогеназ, рассмотренных в данной работе

Организм FDH Источник данных

Латинское название Русское название

РАСТЕНИЯ

Antirrhinum majus Львиный зев AmaFDH1 KEGG: EST 2545

Aquilegia formosa x Aquilegia pubescens Лютик ApuFDH1 KEGG: EST 273

ApuFDH2 [11]

Arabidopsis thaliana Резуховидка Таля AthFDH EMBL AF208029

Brachypodium distachyon Коротконожка BdiFDH1 [11]

Brassica napus Рапс BnaFDH1 [11]

BnaFDH2 KEGG: EST 21261

Brassica oleracea Капуста BolFDH1 [11]

Cryptomeria japonica Японский кедр CjaFDH1 KEGG: EST 5066

Carica papaya Папайя CpaFDH1 KEGG: EST 3924

Citrus reticulata Мандарин CreFDH3 KEGG: EST 11052

Citrus sinensis Апельсин CsiFDH1 [11]

Coffea canephora Кофе CcaFDH1 KEGG: EST 1007

Festuca arundinacea Овсяница тростниковая FarFDH1 KEGG: EST 5855

Glycine max Соя SoyFDH1 GB AK244764, [38]

SoyFDH2 GB BT094321

SoyFDH3 GB AK243932, [38]

SoyFDH4 GB BT095613

SoyFDH5 KEGG: EST 19520

Gossypium arboreum Хлопчатник GarFDH1 KEGG: EST 1085

Gossypium hirsutum Хлопчатник GhiFDH1 KEGG: EST 19680

Gossypium raimondii Хлопчатник GraFDH1 KEGG: EST 213

Helianthus annuus Подсолнечник HanFDH1 [11]

Hordeum vulgare Ячмень обыкновенный HvuFDH1 GB D88272, [8]

Ipomoea batatas Батат IbaFDH EMBL BM878811

Lactuca saligna Латук солончаковый LsaFDH1 KEGG: EST 1616

Lotus japonicus Лядвенец LjaFDH1 GB FM865900, [10]

Lycopersicon esculentum Томат LesFDH1 GB AJ849378

Malus domestica Яблоня MdoFDH EMBL CN496368

Manihot esculenta Маниок съедобный, кассава MesFDH1 KEGG: EST 2788

Medicago truncatula Люцерна трункатула MtrFDH1 KEGG: EST 1503

Mesembryanthemum crystallinum Ледяник, хрустальная трава McrFDH GB BE035085

Nicotiana tabacum Табак NtaFDH1 [11]

Oryza sativa Japonica group Рис японский OsaFDH Ja GB AK065872, [39]

Oryza sativa_indica cultivar-group Рис индийский OsaFDH_In GB CT832868, [40]

Oryza sativa Рис OsaFDH1 AB019533, [41]

Panicum virgatum Просо PviFDH1 KEGG: EST 8602

Phaseolus vulgaris Фасоль обыкновенная PvuFDH1 GB ACZ74695, [42]

Phyllostachys edulis Бамбук PedFDH GB FP093692

Physcomitrella patens Мох Фискомитрелла раскрытая PpaFDH GB XM001768721, [43]

Picea glauca Ель сизая PglFDH1 KEGG: EST 2327

Picea sitchensis Ель ситхинская PsiFDH GB EF085163, [44]

Pinus pinaster Сосна приморская PpiFDH1 KEGG: EST 174

Pinus taeda Сосна ладанная PtaFDH1 [11]

PtaFDH2 KEGG: EST 2972

PtaFDH3 KEGG: EST 15504

Populus nigra Тополь черный PniFDH2 KEGG: EST 7989

Populus trémula Осина PtmFDH1 KEGG: EST 4757

Populus trichocarpa Тополь волосистоплодный PtrFDH1 GB XM002320465, [45]

Prunus pérsica Персик PpeFDH1 KEGG: EST 4281

Quercus robur Дуб черешчатый QroFDH1 GB AJ577266.2, [35]

Raphanus raphanistrum subsp. raphanistrum Редька дикая RraFDH1 KEGG: EST 15157

Ricinus communis Клещевина RcoFDH1 GB XM_002517292

Saccharum officinarum Сахарный тростник SofFDH1 KEGG: EST 18227

Solanum tuberosum Картофель StuFDH1 GB Z21493, [21]

Sorghum bicolor Сорго SbiFDH1 GB XM002438363, [46]

SbiFDH2 GB XM002454363, [46]

Taraxacum officinale Одуванчик обыкновенный TofFDH1 [11]

Theobroma cacao Какао TcaFDH1 KEGG: EST 10274

Triphysaria pusilla Карликовый совиный клевер TpuFDH1 KEGG: EST 5550

Triticum aestivum Мягкая пшеница TaeFDH1 GB AK332605, [47]

Vigna unguiculata Коровий горох VunFDH1 KEGG: EST 6491

Vitis vinifera Виноград VviFDH1 GB XM002278408

Yucca filamentosa Юкка YfiFDH1 [11]

Zea mays Кукуруза ZmaFDH GB EU967680, [48]

Zingiber officinale Имбирь ZofFDH1 KEGG: EST 5316

МИКРОСКОПИЧЕСКИЕ ГРИБЫ

Aspergillus oryzae Аспергилл, плесневый гриб AorFDH1 NCBI XM001827498

Mycosphaerella graminicola Плесневый гриб MgrFDH GB AW180713 180985 180259 180189 180073

Penicillium marneffei Плесневый гриб PmaFDH1 GB XM002153251

Ajellomyces capsulatus Патогенный гриб AjcFDH1 [49]

AjcFDH3

ДРОЖЖИ

Candida boidinii Метилотрофные CboFDH EMBL AF004096

Saccharomyces cerevisiae Пекарские SceFDH EMBL Z75296

БАКТЕРИИ

Pseudomonas sp. 101 Метилотрофные PseFDH [50]

Moraxella sp. Метилотрофные MorFDH EMBL Y13245

Burkholderia stabilis Патогенные BstFDH [51]

Bordetella bronchiseptica RB50 (Alcaligenes bronchisepticus) Патогенные BbrFDH EMBL BX640441

Uncultured marine alpha proteobacterium HOT2C01 cosmid clone Некультивируемые глубоководные морские альфа-протеобактерии UmaFDH GB AY372455

Sinorhizobium meliloti Азотофиксирующие SmeFDH GB AE006469, [52]

BdiFDH1---------------------MAMWRAAARQLVDRALVGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

PedFDH-----------------------MAMWRAAARQLVDRALGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

FarFDH1------------------------MWRAAARHLVDRALGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

HvuFDH1---------------------MAAMWRAAARQLVDRAVGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

TaeFDH1---------------------MAAMCRAAARQLVDRAVGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

SbiFDH1----------------------MAMWRAAARQLVDRALGSSAAHTSAG-SKKIVGVF

SofFDH1----------------------MAMWRAAARKLVDRALGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

ZmaFDH-----------------------MAMWRAAARQLVDRALGSRAAHTSTG-SKKIVGVF

PviFDH1----------------------MAMWRAAARQLVDRALGARAAHTSAG-SKKIVGVF

OsaFDH1----------------------MAMWRAAAGHLLGRALGSRAAHTSAG-SKKIVGVF

SbiFDH2--------------MAMRRAAQQAARFAMGPHVPHTAPAARSLHASAG-SKKIVGVF

LjaFDH1------------MAMKRAASSAVRSLLTAPTPNPSSSIFSRWLHASGG-KKKIVGVF

MtrFDH1------------MAMKRAASTLITASSKISSLSSPSSIITRDLHASGG-KKKIVGVF

PvuFDH1-------------------MAMKRAAASSAFRSLLSSTFSRWLH------KKIVGVF

VunFDH1-------------------MAMRRAAGSSAIRSLFSSTFSRWbHVSGE-KKKIVGVF

SoyFDH3-----------------MAMMKRAASSSVRSLLSSSSTFTRWbHASGE-KKKIVGVF

SoyFDH4-----------------MAMMKRAASSALRSLIASSSTFTRWbHASGE-KKKIVGVF

SoyFDH1 --MSNFTLKMSDPTLAQQHLVKVHTTTHETVVTTHNHNQTPSIMASGE-KKKIVGVF SoyFDH2--MLNFTLKMSDPTLAQPHLVKVHTT-LETVVTTHNHNHRPSIMASGE-KKKIVGVF

SoyFDH5----------------------MAMKRAVQSLLASSSTLTRWbHASGE-KKKIVGVF

TofFDH1-------------MAIAMKRAAAAAATRAISSANSGSIFTRHLHASSG-KKKIVGVF

LsaFDH1--------------------------MAIAMKSDSGSILTRHLHASSG-KKKIVGVF

HanFDH1------------MAMSMAMKRSAAAATRALSSATSSSIL TRDLHSSSG-KKKIVGVF

AmaFDH1----------------MAMKRAAVTAVRALTSSAPSSVL TRGLHASPG-SKKIVGVF

TpuFDH1--------------MAMKRAVASTVGAITSSGNPASSVLARYLHASPG-SKKIVGVF

LesFDH1-----------------MAMRRVASTAARAIASPSSLVFTRFLOASPG-PKKIVGVF

StuFDH1-----------------MAMSRVASTAARAITSPSSLVFTRFLOASPG-PKKIVGVF

NtaFDH1-------------MAMRRVASTAARAFASSSPSPSSLVFTRFLQASPG-SKKIVGVF

VviFDH1---------------MAMMKRVAESAVRAFALGSTSGALTKHLHASAG-SKKIVGVF

MesFDH1---------------MKRAATSAIRAFPSSFGISGSSALGRHLHASAG-SKKIVGVF

GraFDH1------------------MKQVANSAIKAIANSGSSSLLTRQLHASPG-SKKIVGVF

GarFDH1------------------MKQVANSAIKAIANSGSSSLLTROLHASPG-SKKIVGVF

GhiFDH1------------------MKQVANSAIKAIANSGSSSLLTROLHASPG-SKKIVGVF

TcaFDH1------------------MKQVASSAIKALANSGSSSVLTRQLHASPG-SKKIVGVF

CcaFDH1--------------MAMKRVAASALRAFTSSGNSTSSLLTRRLHASPG-SKKIVGVF

IbaFDH---------------MAMRRVAASGLRAFASYGNPS--LLTROLHASPG-SKKIVGVF

ApuFDH1---------------MATRKAVVLGAQSLLRSSSTSSPSIRWLHASSE-SKKIVGVF

ApuFDH2-----------------MKKAALSTVQSVLSSSSFSTRLVRHSHTSPG-SKKIVGVF

YfiFDHl----------------MAMLRAAKQAIQTLGSRIPSSSTFSRHLHASPG-SKKIVGVF

ZofFDH1---------------MAMLRAAKHAMRALGSRAPDASPFARMLHASTG-SKKIVGVF

QroFDH1--------------------------MAGAATSAIKSVLTRHLHASPG-SKKIVGVF

RcoFDH1------------MKSYSKRIALWLQRIEDGASDVTEELGVSIWSASAG-SKKIVGVF

BnaFDH2---------------MAMRRVTRAAIRASCVSSSSSGYFARKFWASSGDSKKIVGVF

BolFDH1-------------------MAMRRVIRASCVSSSSTGYLARKFHASSGDSKKIVGVF

CsiFDH1-------------MAMKRVASSAINAFASSGYLRSSSRFSRHY-ASSG-RKKIVGVF

MdoFDH--------------MASKGVIASAVRALASSGSSASSTTFTRHLHASGG-SKKIVGVF

PpeFDH1---------------MKGVIASAVRTLASSGSSASSTTFTRHLHASAG-SKKIVGVF

CpaFDH1-------------MKRAATSAIKAFASSQTSFSGLSTNFARWLHASPG-SKKIVGVF

CreFDH3---------------MKRVASSAINAFASSGYLRSSSRFSRHY-ASSG-SKKIVGVF

BnaFDH1----------------MAMRRITGAIRASCVSSSSSGYFAROFHASSGDSKKIVGVF

AthFDH----------------MAMRQAAKATIRACSSSSSSGYFARROFWASSGDSKKIVGVF

RraFDH1--------------------MAMQAAIRACVSSNSSGFLSRHLHASSGDSKKIVGVF

PpiFDH1----------MASRRAVISAFRAASRRPICSPVSSIASSVRFLHAPAG-SNKIVGVF

PtaFDH2--------------MASRRSVISAFRAASRRPICSPVSSVRFLHAPAG-SNKIVGVF

PtaFDH3----------MASKRAVISAFRAASRRPICSPVSSIASSVRFLHAPAG-SNKIVGVF

PtaFDH1----------MASRRSVISAFRAASRRPICSPVS----SVRFLHAPAG-SNKIVGVF

PsiFDH-----------MASKRAVISTFRAASRKPIFSSVSPLASS VRFLHAPAG-SNKIVGVF

PglFDH1----------MASKRAVISTFRAASRRPICSSVSPLASSVKKLHAPAG-SNKIVGVF

CjaFDH1----------MASKRAVKS---AAQ------AFSPL-SSIRALHAPAG-PNKIVGVF

PtrFDH1-----------MAMKRAATSAIRAFSSSSPASSVSSGSSTRLLHASAE-SKKIVGVF

PtmFDH1-----------MAMKRAATSAIRAFSSSSPSSSLSSGSSTRLLHASAE-SKKIVGVF

PniFDH2-----------MAMKRAATSAIRAFSSASPASSVSSGSSTRLLHASAE-SKKIVGVF

McrFDH-----------------MKRATASAIRAMVASSTNSSTILSRWLHASSD-SKKIVGVF

AorFDH1-------------------MTFARSITRAALKASPLSRASRTFSSSSSAQSKVLMVL

MgrFDH--MVFARSSLRMARPASSLLSQRATASFTQRGANLARAGGVRTLTSTSSRQGKVLLVL

PmaFDH1------MVFSRSIPRALQRPATSLLAIPARQWRAPVFSGVRTLTASAPRQGKVLMVL

AjcFDH3-------MGRGLPRSSSAPFPGYNTQSYGPLPRLPSLTRVITLTASPKLQGKVLLVL

AjcFDH1-------------------------------------------------MGKVLLVL

PseFDH--------------------------------------------------MAKVLCVL

Рис. 1. Сигнальные последовательности растительных формиатдеги-дрогеназ. Здесь и на рис. 2 и 3 обозначения ферментов см. в табл. 1. Названия ферментов из растений выделены зеленым, из микроскопических грибов - розовым, а FDH из бактерий - синим. Подчеркнуты потенциальные специфические последовательности, обеспечивающие транспорт фермента в митохондрии. Остаток, после которого происходит отщепление сигнального пептида, показан зеленым курсивом. Красным выделены консервативные аминокислотные остатки для всех формиатдегидрогеназ.

Отличительной чертой растительных FDH является наличие на П-конце синтезируемого профермента сигнального пептида, который отвечает за транспорт FDH из цитоплазмы в митохондрии [21]. У бактериальных и дрожжевых FDH сигнальные пептиды отсутствуют. Гены FDH ряда патогенных микроскопических грибов также содержат нуклео-тидную последовательность, кодирующую сигнальный пептид. Однако в зависимости от состояния клетки-хозяина синтезируемая с гена FDH РНК подвергается альтернативному сплайсингу, в результате которого образуются разные мРНК, кодирующие белок как с сигнальным пептидом, так и без него [49].

На рис. 1 представлены сигнальные последовательности формиат-дегидрогеназ из различных источников. Подчеркнуты потенциальные специфические последовательности, обеспечивающие транспорт фермента в митохондрии. Остаток, после которого происходит отщепление сигнального пептида, показан зеленым курсивом. У большинства формиатдегидрогеназ это остаток аргинина, в этом положении находятся также остаток серина (FDH сорго SbiFDH1, клещевины RcoFDH1), лизина (виноград VviFDH1), пролина (FDH сои SoyFDH1, SoyFDH2, изоформы 1, 2). Сигнальная последовательность FDH обогащена аминокислотными остатками, содержащими гидроксиль-ные или положительно заряженные группы, и способна образовывать амфифильную а-спираль. Сигнальная последовательность очень консервативна: удаление всего двух П-концевых аминокислот полностью блокирует транспорт фермента в митохондрии [53]. Установлено, что П-концевой мотив МАМ позволяет осуществлять быстрый транспорт фермента в митохондрии. На рис. 1 представлены П-концевые последовательности 63 растительных FDH, из них мотив МАМ в положении 1-3 имеют 35 ферментов. У ряда растительных FDH на П-конце находятся

0.1

I-РТ1

1_|"Р

PtmFDH1 PtrFDH1 PniFDH2

- SoyFDH2 ■SoyFDH1

- MtrFDH1

- VviFDH1

MesFDH1

_1- PpeFDH1

~I- MdoFDH

— PtaFDH3

— _I PtaFDH2

-ПPtaFDH1 ^~PpiFDH1

|-PsiFDH

1-PglFDH1

CjaFDH1

TcaFDH1 GraFDH1 GhiFDH1 GarFDH1 - CpaFDH1

I- CsiFDH1 "т— CreFDH3

ч:

-lbaFDH

- CcaFDH1

-TpuFDH1

AmaFDH1

YfiFDH1 -ZofFDH1

- SbiFDH2

С

-с

NtaFDH1

.-StuFDH1

'—LesFDH1

- McrFDH

-SoyFDH3

-SoyFDH4

'L^aFDH1

VunFDH1 -PvuFDH1

TofFDH1

■ LsaFDH1

■SoyFDH5

- HanFDH1

QroFDH1

-ApuFDH2

-ApuFDH1

PpaFDH

- RraFDH1

-BolFDH1

' BnaFDH2 -BnaFDH1

AthFDH

■RcoFDH1

OsaFDH_Ja OsaFDHJn OsaFDH1 TaeFDH1 — HvuFDH1 -SofFDH1

|-PviFDH1

Ч|-SbiFDH1

II— ZmaFDH Ч_] PedFDH BdiFDH1

Рис. 2. Филогенетическое дерево ^концевых последовательностей FDH растений.

>

о

н >

>

н с

я >

м

н о

л и

рз РЗ

А fr Я

К

S

w

Я РЗ >0 н

о

о

Ч §

Ü Я

рз й tr я

V

щ g

н

О W

я к

° ¡=1

fr£

Ф о щ g

рз о

° >0 fr g s

ф Ф w Щ Я ^

а Н

>6- й

ф ф

^ £ а ?

о: Ф Я

X

О Й S Н о

а и

s s

и ф

it. о • S ч- <-> ^ Я

- Рз й tr я

о

о

«i I

о\ и

S Н

О J К И

РЗ >0

V %

i 3

к

§ *

о " ф и

К я

РЗ

>0 я

О рз

№ н

s °

й f

^ tr4

о о о О го и 2 w

ф fr

gc ф

о >0 н м Рз

2 р3

И о

V! о

s 1

а л

ф я

нн Н

Я РЗ

рз И О

° "

й s

ф w

Я >0

н ф

к S St о Й я о

Я о и п> ох 1 1 Hl ¡=1

Й Hl

f ч о

о о О

S >

w о" Ч

ф ф Я й

рз о

W и Рз

н

ф

й tr я

о о н

¡=1 ф а

Ъ 2

I

я о я

ß 43

ф

и £ St

го Й а. ir

°fr

о

р а

о >0 Рз М

К

ф

к S а я

0

ja о

м Й

рз Рз Я Н рз Я

3 S А t4

2 и

1 S и <1

Рз рз

а >—

я я

о tr

ffi а

о s

£ я

чЗ рз

£ 43

Н Й

S "" и я tr

и tr

Ё

ф

й И ф

я I

о ф

л

>0 S

о\ и Ф> Q ... .

и

° g рз >0

S

е я

g §

ф v! И

о Н V!

К w

рз рз о и

о Я S St X

с

и

ф ф

н

о

g S

§ щ

Я о

>0 «

о о

о И

я tr

о В

я

S л

о S ч

к

рз

и

tr я о Я

о щ ° о

Я S

ф о

V!

о о н н

к

ф

я о н о >0

tr

ф

Й о

Ф о

о и

О Ф

о и рз н рз ф

>0

рз

W V!

S В s

ф о

а й w £ чз

ф

W S V!

я и ^ tr

рз н

g ё hj ф

К Рз

к gä

■—' н

ф

«5 >0

2 ü S И

р 2 Й- s

S м

со о g

4 tr

Sfr

5 ф ^ >0 s g

> Я Сч ^

м s U м

К ¡ь,

W <fä. о

о р

о

го

'S«.

. _ ГО ф ^

л 2

ф 3 м

я Щ щ

Е о о ГО о

>0

о w

OD

о Р И и го

f Й 5

|-ч ГО

а

>0 S

и

ф

Й

ф

я

tr

«а -ä р

N Я н

P О РЗ

ro О Я

н

s ф

od Ч ü 1

К я о

<3 •п я

й V п

od S ф

о\ и

43 о Е

ro И ф

3 's«. ^ я

о od о

's«. о

го й

's«. -ä ф

Й «а Й о

s й od и рз н

p о ф

-ä -ä й

3 «С tr

о щ

Я рз

Ф и

S ф fr

S ^

ф л

о н

Я о

S ^

St о

fr §

S s

я H в

S °

S и

St g

Й л

•Ö Р3

V! S

а

43 Г, рз о н S

н

ф

й tr я tr

S я

W о

о я

fr s

ф р

я

о о

й ф

Й о . и X рз

S о

§ 5 > й

ся

я

о о й IS5 ф

4 Й м ° О и

К g

о Ф

5 ^

s tr я

о о н S

V! ф

и а

° I g

s 2

sTZ^ Cr

к >

£ >

-G S

ф P"!

и ^

E ^

ф й

g и

>0

w о а ^

Рис. 3. Сравнение последовательностей формиатдегидрогеназ из различных источников. Расшифровку обозначений ферментов см. в табл. 1. Названия ферментов из растений выделены зеленым, из микроскопических грибов - розовым, а FDH из бактерий - синим. Подчеркиванием выделены потенциальные специфические последовательности, обеспечивающие транспорт фермента в митохондрии. Нумерация остатков приведена согласно последовательности FDH из Pseudomonas sp. 101 (PseFDH). Звездочкой и красным омечены консервативные аминокислотные q

остатки. td

со

FarFDHl .......................MWRAAARHLVDRALGS AAHTSAG-SKKIVGVFYKAGEHA..............................DKNPNFVGCVEGALGIRNWLESKGHHYIVTDDKEG-PNSELEKHIEDMHVLITTPFHPAY-VSAER О

HvuFDHl ....................MAAMWRAAARQLVDRAVGS AAHTSAG-SKKIVGVFYQAGEYA..............................DKNPNFVGCVEGALGIRDWLESKGHHYIVTDDKEG-FNSELEKHIEDMHVLITTPFHPAY-VTAEK Ч

TaeFDHl ....................MAAMCRAAARQLVDRAVGS AAHTSAG-SKKIVGVFYQAGEYA..............................DKNPNFVGCVEGALGIRDWLESKGHHYIVTDDKEG-LNSELEKHIEDMHVLITTPFHPAY-VTAER tT4

ZmaFDH .....................MAMWRAAARQLVDRALGS AAHTSTG-SKKIVGVFYKAGEYA..............................DKNPNFVGCVEGALGIRGWLESQGHQYIVTDDKEG-PNCELEKHIEDMHVLITTPFHPAY-VTAER

OsaFDHl .....................MAMWRAAAGHLLGRALGS AAHTSAG-SKKIVGVFYKGGEYA..............................DKNPNFVGCVEGALGIREWLESKGHHYIVTDDKEG-LNSELEKHIEDMHVLITTPFHPAY-VSAER

SbiFDH2 .............MAMRRAAQQAARFAMGPHVPHTAPAA SLHASAG-SKKIVGVFYKGGEYA..............................DRNPNFVGCAEHALGIRGWLESQGHQYIVTDDKDG-PNCELEKHIADAHVLITTPFHPAY-VTADR

LjaFDHl ...........MAMKRAASSAVRSLLTAPTPNPSSSIFS NLHASGG-KKKIVGVFYKAHEYA..............................ALNPNFVGCVEGALGIREWLEAQGHEYIVTDDKEG-LDSELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

SoyFDH3 ................MAMMKRAASSSVRSLLSSSSTFT NLHASGE-KKKIVGVFYKGNEYA..............................KLNPNFVGCVEGALGIREWLESQGHQYIVTDDKEG-PDSELEKHIPDAHVIISTPFHPAY-VTAER

SoyFDH2 -MLNFTLKMSDPTLAQPHLVKVHTT-LETVVTTHNHNHR SINASGE -KKKIVGVFYKGNEYA..............................KLNPNFVGCVEGALGIREWLESQGHQYIVTDDKEG-PDSELEKHIPDAHVI ISTPFHPAY-VTAER

AmaFDHl ...............MAMKRAAVTAVRALTSSAPSSVLT GLHASPG-SKKIVGVFYKANEYA..............................SMNPNFLGCVENSLGIRDWFYSEGHQYIVTPDKDA-PDCELEKHIPEMHVLITTPFHPAY-VTAER

TpuFDHl .............MAMKRAVASTVGAITSSGNPASSVLA YLHASPG-SKKIVGVFYKANEYA..............................SMNPDFVGCAENALGIREWLESKGHHYIVTPDKDG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

LesFDHl ................MAMRRVASTAARAIASPSSLVFT ELQASPG-PKKIVGVFYKANEYA..............................EMNPNFLGCAENALGIREWLESKGHQYIVTPDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

StuFDHl ................MAMSRVASTAARAITSPSSLVFT ELQASPG-PKKIVGVFYKANEYA..............................EMNPNFLGCAENALGIREWLESKGHQYIVTPDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

VviFDHl ..............MAMMKRVAESAVRAFALGSTSGALT HLHASAG-SKKIVGVFYKANEYA..............................AMNPNFVGCVEGALGIRDWLESQGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

GhiFDHl .................MKQVANSAIKAIANSGSSSLLT QLHASPG-SKKIVGVFYKAHEYF..............................TKNPNFVGCVEGALGLRPWLESQGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

TcaFDHl .................MKQVASSAIKALANSGSSSVLT QLHASPG-SKKIVGVFYKAHEYY..............................EKNPNFVGCVEGALGLREWLESQGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

CcaFDHl .............MAMKRVAASALRAFTSSGNSTSSLLT RLHASPG-SKKIVGVFYDAKEYA..............................AKNPNFLGCTENALGIRQWLESQGHQYIVTSDKEG-PHCELEKHIPDLHVLITTPFHPAY-VTAER

ApuFDHl ..............MATRKAWLGAQSLLRSSSTSSPSI NLHASSE-SKKIVGVFYKANEYA..............................SMNPNFVGCAEGALGIRDWLESQGHQYIVTDDKDG-PNSELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

ZofFDHl ..............MAMLRAAKHAMRALGSRAPDASPFA MLHASTG-SKKIVGVFYKANE YA..............................SMNPKFVGCVEGSLGIRDWLESQGHQYIVTDDKEG-PNCELEKHIPDMHVLITTPFHPAY-VTEER

QroFDHl .........................MAGAATSAIKSVLT HLHASPG-SKKIVGVFYKANENA..............................ALNPNFVGCVEGSLGIRDWLESQGHQYIVTDDKEG-PNSELEKHIPDLHVLITTPFHPAY-VTAER

RcoFDHl ...........MKSYSKRIALWLQRIEDGASDVTEELGV I NSASAG-SKKIVGVFYKANE YA..............................SMNPNFSGCAEGALGIRDWLESQGHQYIVTDDKEG-PHCELEKHIPDLHVLITTPFHPAY-VTAER

BnaFDH2 ..............MAMRRVTRAAIRASCVSSSSSGYFA KFNASSGDSKKIVGVFYKANEYA..............................SKNPNFLGCVENALGIRNWLESQGHHYIVTDDKEG-PNCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

BolFDHl ..................MAMRRVIRASCVSSSSTGYLA KFHASSGDSKKIVGVFYKANEYA..............................SKNPNFLGCVENALGIRNWLESQGHHYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

MdoFDH ............MASKGVIASAVRALASSGSSASSTTFT HLHASGG-SKKIVGVFYKANE YA..............................ELNPNFLGSQERALGIRDWLESQGHEYIVTDDKEG-PNCELEKHIEDLHVLITSPFHPAY-VTAER

PpeFDHl ..............MKGVIASAVRTLASSGSSASSTTFT HLHASAG-SKKIVGVFYKANEYA..............................ELNPNFLGCEERALGIKDWLESQGHKYIVTDDKDG-PDCELDKHIQDLHVLISTPFHPAY-VTAER

CpaFDHl ............MKRAATSAIKAFASSQTSFSGLSTNFA NLHASPG-SKKIVGVFYKANE YA..............................TENPNFVGCVENALGIRNWLESQGHQYIVTDDKEG-PNCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

AthFDH ..............MAMRQAAKATIRACSSSSSSGYFAR QFNASSGDSKKIVGVFYKANEYA..............................TKNPNFLGCVENALGIRDWLESQGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-VTAER

PpiFDHl .........MASRRAVISAFRAASRRPICSPVSSIASSV ELHAPAG-SNKIVGVFYKANEYA..............................SLNPNFLGCVENALGIREWLESNGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDVHVLISTPFHPAY-VTAER

PtaFDH2 .............MASRRSVISAFRAASRRPICSPVSSV ELHAPAG-SNKIVGVFYKANEYA..............................SLNPNFLGCVENALGIREWLESNGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDAHVLISTPFHPAY-VTAER

PsiFDH .........MASKRAVISTFRAASRKPIFSSVSPLASSV ELHAPAG-SNKIVGVFYKANEYA..............................SLNPNFLGCVENALGIREWLESKGHQYIVTDDKEG-PDCELEKHIPDLHVLISTPFHPAY-MTAER

PtmFDHl ..........MAMKRAATSAIRAFSSSSPSSSLSSGSST LLHASAE - SKKIVGVFYKANE YA..............................SLNPNFVGSLEGALGIRDWLESQGHQYIVTDDKEG-LDSELEKHIPDLHVLITTPFHPAY-VTAER

MgrFDH -VFARSSLRMARPASSLLSQRATASFTQRGANLARAGGV TLTSTSSRQG VL VLYDGH HA..............................QQEPRLLGTTENELGLRKWIEDQGHTLVTTSDKEGE-NSKFDQELVDAEVIITTPFHPGY-LTAER

AjcFDHl .................................................GKVL LVL YDGGRHA..............................KNQPGLLGATENELGLRKWLEEKGHTLVTTSDKDGA-NSKFDQELVDAEVI ITTPFHPGY-LT ADR

CboFDH ..................................................KIVLVLYDAGKHA..............................ADEEKLYGCTENKLGIANWLKDQGHELITTSDKEGETSELDKHIP-DADIIITTPFHPAY-ITKER

SceFDH ...............................................SKGKVL LVL YEGGKHA..............................EEQEKLLGCIENELGIRNFIEEQGYELVTTIDKDPEPTSTVDRELKDAEIVITTPFFPAY-ISRNR

MorFDH .................................................AKWCVLYDDPINGYPTSYARDDLPRIDKYPDGQTLPTPKAIDF-TPGALLGSVSGELGLRKYLESQGHELWTSSKDG-PDSELEKHLHDAEVIISQPFWPAY-LTAER

BstFDH .................................................ATVLCVLYPDPVDGYPPHYVRDTIPVITRYADGQTAPTPAGPPGFRPGELVGSVSGALGLRGYLEAHGHTLIVTSDKDG-PDSEFERRLPDADWISQPFWPAY-LTAER

BbrFDH .................................................AKILCVLYDDPVGGMPATYARDSLPAIARYPGGATLPTPLALDF-TPGHLLGCVSGELGLRPFLQARGHTLWTADKDG-PGSVFERELPDADWISQPFWPAY-LTAAR

UmaFDH ..................................................KVLCILYDDPKGGMPSSYPVETLPKIEKYPDGQTLPTPKGIDF-NPGELLGCVSGELGLRKFLEDAGHTLWTNDKDA-PGCVAEKELVDADWISQPFFPFY-LTKER

SmeFDH ...............................................EMAKVACVLYDDPVDGYPTAYARDGLPTLERYPGGQTLPTPKAIDF-EPGALLGSVSGELGLRKFLEGQGHTLWTSDKDG-PDSVFERELVDAEIVISQPFWPAY-LTAER

PseFDH .................................................AKVLCVLYDDPVDGYPKTYARDDLPKIDHYPGGQTLPTPKAIDF-TPGQLLGSVSGELGLRKYLESNGHTLWTSDKDG-PDSVFERELVDADWISQPFWPAY-LTPER

1* ****** ***** 107

H

о

>

о

H >

>

H с

M >

к

FarFDHl

HvuFDHl

TaeFDHl

ZmaFDH

OsaFDHl

SbiFDH2

IKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLPAAAA-IKKAKTPELLLTAGIGSDHIDLPAAAA-IKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLPAAAA-IKNAKNLELLLTAGIGSDHIDLPAAAA-IKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLPAAAA-IARAKNLELL LTAGIGSDHVDL PAAAA -LjaFDHl IKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLNAAAA-SoyFDH3 IKKAQKLELLLTAGIGSDHVDLKAAAA-SoyFDH2 IKKAQKLELLLTAGIGSDHVDLKAAAA-AmaFDHl INKAKNLQLLLTAGIGSEHIDLKAAAD-TpuFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLQAAAD-LesFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAA-StuFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAA-VviFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLKAAAA-GhiFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAE-IKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAE-IKKAKNLQLLLTAGIGSDHVDLKAAAD-IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLKAAAA-ZofFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLKAAAA-QroFDHl ITKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLPAAAA-EcoFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLKAAAE-BnaFDH2 IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLQAAAA-BolFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLQAAAA-IKKAKNLELLLTAGIGSDHIDLKAAPA-IKKAKNLQLLLTAGVGSDHIDLKAAAA-CpaFDHl IKKAKNLQLLLTAGIGSDHIDLKAAAA-AthFDH IKKAKNLKLLLTAGIGSDHIDLQAAAA-PpiFDHl IQEGKELKLLLTAGIGSDHIDLNAAAA-PtaFDH2 IQEGKELKLLLTAGIGSDHIDLNAAAA-PsiFDH IKKAKNLKLLLTAGIGSDHIDLNAAAA-PtmFDHl IKRAKNLQLLLTAGIGSDHIDLKAAAA-MgrFDH

■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILVRNFLPGYQQWQGEWDVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLQINPELEKEIG-■AGLTVARVTGSNTVSVAEDELMRILILLRNFLPGYQQWKGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRYGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLQINPELEKEIG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILLRNFLPGYQQWKGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLQINPELEKEIG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELLRILILLRNFLPGYQQWQGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLQIDPELEKEIG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILLRNFLPGYQQVVHGEWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKIDPELEKEIG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDQLMRVLVLMRNFLPGHHQAISGEWDVAGVAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLRPFNC-KLLYHDRLRIDPALEAETG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILVRNFLPGYHQAITGEWNVAGIAHRAYDLEGKTIGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMEPELEKEIG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILMRNFLPGYHQAVKGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYFDRLRIDPELEKEIG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILMRNFLPGYHQAVKGEWNVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYFDRLRIDPELEKEIG-■AGLTGAEGTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVINGEWDVAAIAYRSYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMDPELESQIG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVINGDWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMEPELENEIG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVINGEWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMDSELENQIG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVINGEWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMDSELENQIG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVISGEWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRIKMDPELENQIG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFVPGYHQVITGDWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTIGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYHDRVKIDPELEKQTG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFLPGHHQVITGDWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTIGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRVKIDPELEKQTG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRVLILVRNFVPGHHQVISGDWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRIKMDPELENQTG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILVRNFVPGYKQVITGDWNVAAIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRVKMDSDLESQTG-■AGLTVAEVTGSNTVSVAEDELMRILILVRNFLPGYHQVINGDWNVAAIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMEPDLEKEIG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILVRNFLPGYHQAISGEWNVAAISHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMDPELENQIG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILVRNFLPGYHQVISGDWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRIKMDPELENQTG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILMRNFVPGYNQWNGEWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFGC-NLLYHDRLQMGPEMEKETG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILMRNFVPGYNQWNGEWNVAGIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFGC-NLLYHDRLQMGPEMEKETG-■AGLTVAEVTGSNVGSVAEDELMKILNLVPNFVPGYQQIVTGEWNVAGIAHRAYDLERKTVGTVGAGRIGRLLLLTLNPVHC-DLLYHDRVKIDPEVEQHTG--AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILVRNFVPGYTQIVNGEWKVAGIAHRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-HLLYHDRFKIDPELEQQIG--AGLTVAEVTGSNWSVAEDEVMRVLILMRNFVPGYQQWNGEWNVAAIACRSYDLEGKTVGTVGAGRIGRLLLQRLKPFNC-NLLYHDRVKMDPELESQIG-■AGLTVAEVTGSNWSVAEDELMRILILMRNFVPGYNQWKGEWNVAGIAYRAYDLEGKTIGTVGAGRIGKLLLQRLKPFGC-NLLYHDRLQMAPELEKETG-■AGVTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILMRNFVPGYKQIVEGDWKVAAISYRSYDLEGKTIGTIGAGRIGKELLKRLKPFNC-KLLYHDRLSIGPELEKETG-■AGVTVAEVTASNVVSVAEDELMRILILMRNFVPGYKQIVEGDWKVAAISYRSYDLEGKTIGTIGAGRIGKELLKRLKPFNC-KLLYHDRLSIGPELEKETG-■AGVTVSEVTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFVPGYKQIVNGDWKVAAISYRSYDLEGKTIGTIGAGRIGKELLKRLKPFNC-KLLYHDRLSIGPELEKETG-■AGLTVAEVTGSNVVSVAEDELMRILILVRNFLPGYHQVINGEWNVAAIAYRAYDLEGKTVGTVGAGRIGKLLLQRLKPFNC-NLLYHDRLKMDPELEKQTG-LAKAKKLKIAVTAGIGSDHVDLNAANKTNGGITVAEVTGSNVVSVAEHWMTMLVLVRNFVPAHEQIAAGDWNVAAVAKHEYDLEGKWGTVAVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYFDYQALAPEVEKEIG-AjcFDHl LAKAKHLKLAVTAGVGSDHVDLDAANKTNGGITVAEVTGCl^SVAEHVLMTILVLVRNFVPAHEQVVGGDWDVAAVAKHEYDIEHKVVGTVGVGRIGERVLRRLKPFDCKELLYYDYQPLPPAVEQEIG-CboFDH LDKAKNLKLVWAGVGSDHIDLDYINQTGKKISVLEVTGSNWSVAEHVVMTMLVLVRNFVPAHEQIINHDWEVAAIAKDAYDIEGKTIATIGAGRIGYRVLERLLPFNPKELLYYDYQALPKEAEEKVG-SceFDH

TcaFDHl CcaFDHl ApuFDHl

MdoFDH PpeFDHl

108

IAEAPNLKLCVTAGVGSDHVDLEAANE -IAKAPKLKLALTAGIGSDHVDLQAAID-IARAPKLRLALTAGIGSDHVDLDAAAR-IAKAPRLKLAITAGIGSDHVDLQAAAQ-IAMAKNLKMAITAGIGSDHVDLQAAMD-IVKAARLKLAITAGIGSDHVDLQAAID-IAKAKNLKLALTAGIGSDHVDLQSAID-

** ** * **

■NNITVAEVTYCNSNSVAEHVVMMVLGLVRNYIPSHDWARNGGWNIADCVARSYDVEGMHVGTVAAGRIGLRVLRLLAPFDMH-LHYTDRHRLPEAVEKELN............LTWHATREDMYGACDWT

-AHITVAEVTGSNSISVAEHVVMTTLALVRNYLPSHAIAQQGGWNIADCVSRSYDVEGMHFGTVGAGRIGLAVLRRLKPFGLH-LHYTQRHRLDAAIEQELG............LTYHADPASLAAAVDIVN

-HGLTVAEVTYSNSISVSEHVVMMVLALVRNYLPSYQCVLDGGWNIADCVARSYDLEGMQVGWGAGRIGSAVLRRLKPFDVG-LHYTDQHRLPAATEQELG............ARYHPDAAALAGACDVIS

-NKIDVMEVTFCNSRSVAEHIVMMILSLVRDYHNQYRIINEGGWNIADAVQRSYDLEGMHVGTVAAGRIGLDALRKLKHFDVH-MHYFDRHRLPESVEKELN............LTFHDSVESMVAVCDWT

■RGITVAEVTYCNSISVSEHVVMMILSLARNYIPSYQWWKGGWNVADCVARSYDIEGMDIGTVGAGRIGTAVLRRLKPFDVK-LHYTDRHRLPDEVAKELG............VTFHQTAAEMVPVCDWT

■RNVTVAEVTYCNSISVAEHVVMMILSLVRNYLPSHEWARKGGWNIADCVSHAYDLEAMHVGTVAAGRIGLAVLRRLAPFDVH-LHYTDRHRLPESVEKELN............LTWHATREDMYPVCDWT

***** ** ** ** **** * * * 252

FarFDHl INTPLTEKTRGMFNKEKIAKMKKGVIWNNARGGIMDAQAVADACSSGH-HvuFDHl INTPLTEKTRGMFNKEKIAKMKKGVIIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-TaeFDHl INTPLTEKTRGMFNKEKIAKMKKGVIIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-ZmaFDH INTPLTEKTRGMFNKERIAKMKKGVIWNNARGAIMDAQAVADACSSGH-OsaFDHl INTPLTEKTRGMFNKERIAKMKKGVIIVNNARGAIMDTQAVADACSSGQ-SbiFDH2 LNMPLTEKTRGMFDKERIARMKKGVIIVHNARGAIMDTQAVADACATGH-L j aFDHl INTPLTDKTRGLFDKHRIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-SoyFDH3 INTPLTEQTRGLFDKHRIAKCKKGVLIVHNARGAIADTQAIADACSSGH-SoyFDH2 INTPLTEQTRGLFDKHRIAKCKKGVLIVHNARGAIADTQAIADACSSGH-AmaFDHl INTPLTEKTKGMSDKDRIAKLKNGVLIVTNARGAIMDTQAVVDACSSGH-TpuFDHl INTPLTEKTKGMFDKDKIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVVDACSSGH-LesFDHl INTPLTEKTKGMFDKERIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVVDACNSGH-StuFDHl INTPLTEKTKGMFDKERIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVVDACNSGH-VviFDHl INMPLTEKTKGMFNKERIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-GhiFDHl INMPLTEKTRGMFDKDRIAKMKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-TcaFDHl INMPLTEKTRGMFDKDRIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-CcaFDHl INMPLTEKTRGMFDKDRIARLKKGVLIVNNARGAIMDTQAVVDGCSSGQ-ApuFDHl INMPLTEKTAGMFNKEKIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-ZofFDHl INTPLTEKTRGLFNKERIGKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-QroFDHl INTPLTDKTRGLFDKDRIAKCKKGVLIVNNARGAIMDIQAVADACSSGH-RcoFDHl INTPLTEKTRGLFNKDRIAKLKKGVLIVHNARGAIMDTQAVADACSSGH-BnaFDH2 VNTPLTEKTRGMFNKEMIGKMKKGVLIVHNARGAIMDRQAVVEAVESGH-BolFDHl VNTPLTEKTRGMFNKEMIGKMKKGVLIVHNARGAIMDRQAVVEAVESGH-MdoFDH VNTPLTEKTRGLFDKERIAKCKKGVLIVHNARGAIMDTQAVVDACSSGH-PpeFDHl INTPLTEKTRGLFDKERIAKCKKGVLIVHNARGAIMDTQAVVDASSSGH-CpaFDHl VNTPLTEKTRGMFNKERIAKMKKGVRIVNNARGAIMDTQAVVDACNSGQ-AthFDH INMPLTEKTRGMFNKELIGKLKKGVLIVHNARGAIMERQAVVDAVESGH-INMPLSDKTRGMFNKEKISKMKKGVLIVHNARGAIMDAQAVADASASGQ-INMPLSDKTRGMFNKEKISKLKKGVLIVHNARGAIMDAQAVADASASGH-INMPLSDKTRGMFNKEKISKMKKGVLIVHNARGAIMDAQAVADASASGH-

PpiFDHl

PtaFDH2

PsiFDH

PtmFDHl

MgrFDH

Aj cFDHl

CboFDH

■ IAGYGGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYGGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYGGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYGGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-■VAGYGGDVWFPQPAPKGPPWRYMPN-

■ IAGYGGDVWHPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-■VAGYSGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-■VAGYSGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSADVWYPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWYPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWYPQPAPKDHLWRYMPN-

■ IAGYSGDVWYPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWYPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWYPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWYPQPAPKDHPWRFMPN-

■ IGGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPN-■VAGYSGDVWFPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IGGYSGDVWYPQPASKDHPWRYMPN-

■ IGGYSGDVWDPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IGGYSGDVWDPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IAGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IGGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPN-

■ IGGYSGDVWDPQPAPKDHPWRYMPN-■IGGYSGDVWFPQPAPKDHPWRSMPN-■IGGYSGDVWSAQPAPKDHPWRSMPN-■IGGYSGDVWFPQPAPKDHPWRSMPN-

■ IGGYSGDVWNPQPAPKDHPWRYMPN-

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE -DFPAENYIV -KEGELAS----QYK.....

-HAMTPHI SGTT IDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE -EFPVENYIV -KEGELAS----QYK.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-DFPAENYIV-KEGELAS----QYK.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYADGVRDMLNRYFKGE-DFPVQNYIV-KEGQLAS----QYQ.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-DFPVQNYIV-KEGQLAS----QYQ.....

-NAMTPHISGTTIDGQLRYAAGVKDMLERYFKGQ-DFPVQNYIV-KEGNLAG----QYQ.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLERHFKGE-DFPEQNYIV-KEGQLAS----QYR.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRHFKGE-DFPEQNYIV-KEGQLAS----QYR.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRHFKGE-DFPEQNYIV-KEGQLAS----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAPGVKDMLENYFKGE-DFPPQNYIV-KDGELAS----QYR.....

-QAMTPHIFGTTIDAQLRYAAGVKDMLERYFKGE-DFPPQHYIV-KDGELAS----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGTKDMLDRYFKGE-DFPAENYIV-KDGELAP----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGTKDMLDRYFKGE-DFPAENYIV-KDGELAP----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-DFPAQHYIV-KEGQLAS----QYQ.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLERYFKGE-DFPEQNYIV-KAGELAP----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-EFPAQNYIV-KEGELAP----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQIRYAAGVKDMLDRYFKGE-DFPPQHYIV-KDGELAS----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDKYFKGE-DFPAQNYIV-KEGELAS----QYR.....

-HAMTPHISGTTIDGQLRYAAGTKDMLDRYFKGQ-DFPAQNYIV-KEGKLAS----QY......

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGTKDMLERYFKGE-EFPSQNYIV-KGGKLAS----QYQ.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-EFPLQNYIV-KEGKLAS----QYQ.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGTKDMLEKYFKGE-DFPAQNYIV-KDGELAP----QYR.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGTKDMLEKYFKGE-DFPAQNYIV-KDGELAP----QYR.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGTKDMLDRYFKGE-EFPAQNYIV-KDGKLAS----QYQ.....

-HAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-DFPAQNYIV-KDGKIAS----QYQ.....

-QAMTPHISGTTIDAQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-DFPAENYIV-KDGQLAS----QYR-

-QAMTPHTSGTTIDAQLRYAAGTKDMLERYFKGE-DFPTENYIV-KDGELAP----QYR-

-HAMTPHI SGTT IDAQIRYAAGTKDMLDRYFKGE - DFPSQNYIV-KEGKLAS----QYL -

-HAMTPHISGTTIDGQIRYAAGTKDMLERYFKGE-DFPSQNYIV-KEGKLAS----QYL-

-HAMTPHISGTTIDAQIRYAAGTKDMLDRYFRGE-DFPPQHYIV-KEGKLAS----QYL-

-QAMTPHISGTTIDGQLRYAAGVKDMLDRYFKGE-EFPPQNYIV-KEGKLAS----QYL-

INTPLTEKTRGMFDKERIAKMKKGVLIVNNARGAIMDTQAVVDACSSGQ-

INCPLHEKTRGLFNKELISKMKKGSWLVNTARGAIWKEEVAAALKFGQ--LRGYGGDVWFPQPVPADHPFRTASYSTWGGGNAMVPHMSGTSIDAQARYAAGTKAILDSYFSGREDYRPEDLIV-HKGDYAT---KAYGQRNLIDKK

INCPLHEKTRGLFNKDLIAKMKKGSWLVNTARGAIWKEDVADAIKSGHGHLRGYGGDVWFPQPAPKDHPLRYAQGPW-GGGNAMVPHMSGSSIDAQVRYAAGTKAILESYFSGKYDYRPEDLIV-HAGDYAT---KSYGQRK

VNAPLHAGTKGLINKELLSKFKKGAWLVNTARGAICVAEDVAAALESGQ--LRGYGGDVWFPQPAPKDHPWRDMRNK-YGAGNAMTPHYSGTTLDAQTRYAEGTKNILESFFTGKFDYRPQ-DIILLNGEYVT---KAYGKHDKK-

o w w o

tr4

SceFDH INCPLHKDSRGLFNKKLISHMKDGAYLVNTARGAICVAEDVAEAVKSGK-

MorFDH LNCPLHPETEHMINDETLKLFKRGAYLVNTARGKLCDRDAIVRALESGR-

BstFDH LQIPLYPSTEHLFDAAMIARMKRGAYLINTARAKLVDRDAVVRAVTSGH-

BbrFDH LHCPLHPGTEHLFDAAMLARMKRGAYLINTARGKICDRDAVVQALASGQ-

UmaFDH INCPLHPETENLFDDEMIGKMKKGAYIVNTARGKICNRDAIARALESGQ-

SmeFDH INAPLHPETENLFNEAMIGKMKRGAYLVNTARGKICNRDAVARALESGQ -

PseFDH LNCPLHPETEHMINDETLKLFKRGAYIVNTARGKLCDRDAVARALESGR-253 ** * * ** *

■LAGYGGDVWDKQPAPKDHPWRTMDNK-DHVGNAMTVHISGTSLDAQKRYAQGVKNILNSYFSKKFDYRPQ-DIIVQNGSYAT---RAYGQKK-

■LAGYAGDVWFPQPAPNDHPWRTMPH-■ LAGYGGDVWFPQPAPADHPWRAMPF -■LAGYAGDVWFPQPAPRDHPWRSMPH-■LSGYAGDVWFPQPAPNDHVWRTMPN-■LAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRSMPH-■LAGYAGDVWFPQPAPKDHPWRTMPY-

-NGMTPHISGTSLSAQTRYAAGTREILECYFEGRPIRDEY-LIVQG-GGLAGVGAHSYSKGNATGGSEEAAKYEKLDA

-NGMTPHISGTSLSAQARYAAGTLEILQCWFDGRPIRNEY-LIVDG-GTLAGTGAQSYRLT.................

-HGMTPHISGSSLPAQARYAAGTREILECWLDGRAIRTEY-LIVDQ-GRLAGAGAHAYTPGDTTAGSEDAARFHP---

-HGMTPHTSGTSLSAQARYAAGVREILECFFAGEVQRTEY-TIVKD-GALAGTGAHSYSEGSATSGSEEAAKYERK--

-HGMTPHISGSSLSAQARYAAGTREILECWFEGRPIREEY-LIVSG-GKLAGAGAHSYSAGDATRGSEEAAKYKK---

-NGMTPHISGTTLTAQARYAAGTREILECFFEGRPIRDEY-LIVQG-GALAGTGAHSYSKGNATGGSEEAAKFKKAV-* * * *** * * * * * 400

ячменя и риса. Предполагается, что при некоторых условиях AthFDH, локализованная в хлоропластах, может катализировать обратную реакцию, т.е. превращение углекислого газа в формиат [27]. Использование другого алгоритма для сравнения сигнальных пептидов FDH показало, что все ферменты, кроме FDH из растений томата, могут транспортироваться как в митохондрии, так и в хлоропласты [28]. Анализ сигнальных последовательностей, проведенный с помощью программ Predotar, TargetP и Mitoprot [11], подтвердил, что FDH локализуется преимущественно в митохондриях.

В растениях формиатдегидрогеназа часто представлена несколькими изоформами, или изофер-ментами, синтез которых определяется состоянием растения. Различия в изоферментном составе FDH в здоровых и больных пальмах Pericopsis mooniana используют для отбора деревьев при выборочной вырубке [54]. Полиморфизм характерен и для FDH из миндаля Prunus dulcis [55] или P. amygdalus [56]. На основании анализа изоформ FDH и нескольких других дегидрогеназ предложен метод идентификации генотипа растения. Как уже отмечалось выше, причиной образования различных изоформ FDH может быть фосфорилирование [34]. В зависимости от степени модификации наблюдалось образование многочисленных форм фермента с p! от 6.75 до 7.19. Кроме того, установлено, что дополнительные изоформы FDH картофеля возникают в результате посттрансляционного деамидирования остатков Asn329 и Gln330 [34].

В отличие от самих растительных FDH, уровень гомологии между которыми составляет около 80%, различия в последовательностях сигнальных пептидов гораздо более выражены. Особенно наглядно это видно в случае изоферментов FDH сои. Гомология последовательностей самих изоферментов составляет 98%, в то время как у сигнальных последовательностей не достигает и 40%. На рис. 2 представлено филогенетическое дерево сигнальных пептидов растительных FDH. Видно, что два изофермента FDH сои Glycine max - SoyFDH1 и SoyFDH2, образуют отдельную группу. N-Концевая область этих ферментов гораздо длиннее, чем у FDH из других растений (рис. 1), и сильно отличается по аминокислотному составу. Далее от дерева отделилась большая группа семейства злаков. Это ферменты риса (Os-aFDH), пшеницы (TaeFDH), ячменя (HvuFDH), сахарного тростника, бамбука и других. Большая группа представлена ферментами растений семейства капустных (крестоцветных): редьки (RraFDH), капусты (BolFDH), рапса (BnaFDH), а также A. thaliana (AthFDH). Другие группы образуют белки астровых, бобовых, пасленовых, мальвовых, сосновых и иво-

вых. Как уже отмечалось выше, пять изоферментов FDH сои не образуют отдельную группу. Поскольку сигнальный пептид отвечает прежде всего за транспорт фермента внутри клетки, можно предположить, что разные изоферменты FDH сои транспортируются в разные органеллы.

На рис. 3 представлено выравнивание некоторых известных на настоящий момент полных последовательностей растительных FDH, для сравнения приведены также последовательности ряда аналогичных ферментов микроорганизмов. Абсолютно консервативные участки выделены красным, остатки, повторяющиеся только в растительных FDH, отмечены зеленым. Важное отличие бактериальных ферментов от растительных состоит в наличии жесткой N-концевой петли. Этот участок покрывает значительную часть субъединицы фермента. Вероятно, его взаимодействие с другими аминокислотными остатками является причиной более высокой термостабильности бактериальных ферментов по сравнению с растительными. Кроме того, у FDH микробного происхождения С-концевая область длиннее, чем у ферментов растений. В то же время в остальной части аминокислотной последовательности отчетливо прослеживается разделение FDH по гомологии на две группы. В первую входят ферменты бактерий и растений, а во вторую - дрожжей и микроскопических грибов.

Ферменты растений высокогомологичны между собой (около 80%), гомология между бактериальными и растительными FDH составляет около 50%.

ПОЛУЧЕНИЕ РАСТИТЕЛьНЫх формиатдегидрогеназ

В растениях FDH локализованы в митохондриях, поэтому они составляют малую часть всех растворимых белков клетки, и выделение фермента непосредственно из растений представляет трудоемкую и длительную процедуру. Как правило, растительные FDH не отличаются высокой стабильностью, что приводит к достаточно существенной инактивации фермента в процессе выделения. В результате удельная активность полученных препаратов FDH намного ниже, чем можно было ожидать (табл. 2). Впервые очищенная растительная FDH была получена в 1951 г. из гороха и фасоли [13]. В 1983 г. в достаточно больших количествах FDH выделили из бобов сои G. max, что позволило определить аминокислотный состав растительной формиатдегидрогеназы [57].

Первую кДНК растительной FDH клонировали из картофеля в 1993 г. [21]. В 1998 г. клонировали кДНК FDH из ячменя [8], а в 2000 г. - из риса [41] и A. thaliana [26, 27]. Созданы трансгенные растения A. thaliana и табака, экспрессирующие AthFDH

[28], однако выход фермента был не очень высоким. Экспрессия полноразмерной кДНК FDH картофеля в клетках Escherichia coli приводила к образованию нерастворимых телец включения [21].

Впервые активную и растворимую рекомби-нантную растительную формиатдегидрогеназу получили в клетках E. coli, в которых экспресси-ровали кДНК FDH риса [41], однако уровень белка был очень низким - около 0.01% от всех растворимых белков клетки. В нашей лаборатории созданы штаммы E. coli - суперпродуценты активных FDH из A. thaliana (AthFDH) и сои G. max (изофермент SoyFDH2), в которых содержание фермента достигало 40% от всех растворимых белков клетки [58] (ген FDH сои любезно предоставлен профессором Н. Ла-бру (N. Labrou) из Афинского сельскохозяйственного университета, Греция, а ген FDH A. thaliana - профессором Дж. Марквеллом (J. Markwell) из Университета штата Небраска в Линкольне, США). В клетках E. coli отсутствует система транспорта в митохондрии, поэтому, чтобы получить «природный» фермент нам пришлось удалить из кДНК последовательности, кодирующие сигнальный пептид [58]. После оптимизации условий культивирования выход рекомбинантных FDH A. thaliana и сои G. max достигал 500-600 мг/л среды [6]. Разработана методика, которая за одну хроматографическую стадию позволяла получать несколько сотен миллиграмм гомогенного препарата FDH за одно выделение. Таким образом, были созданы все условия для проведения систематических исследований FDH из A. thaliana и сои G. max, включая эксперименты по генетической инженерии и определению структуры с помощью рентгеноструктурного анализа. Успешно проведены и эксперименты по экспрессии в клетках E. coli FDH из L. japonicus [10].

КИНЕТИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА

формиатдегидрогеназ растений

В табл. 2 суммированы кинетические свойства природных и рекомбинантных растительных FDH. Для сравнения приведены характеристики наиболее изученных бактериальных и дрожжевых ферментов. Из данных, приведенных в табл. 2, можно сделать несколько важных выводов:

1. На примере FDH из A. thaliana хорошо видно, что многостадийное выделение природного фермента сопровождается значительной потерей активности. Удельная активность препаратов, даже полученных из трансгенных растений, в несколько раз меньше, чем у рекомбинантной AthFDH, экспрессируемой в клетках E. coli. Следует отметить, что AthFDH относится к стабильным FDH. По термостабильности она даже превосходит FDH Moraxella sp. C2 и дрож-

жей C. boidinii (табл. 3). Очевидно, что степень инактивации других менее стабильных FDH (особенно в случае SoyFDH), выделяемых из природных источников, будет выше. Это необходимо учитывать при анализе формиатдегидрогеназной активности в растениях.

2. Удельная активность рекомбинантных AthFDH и SoyFDH сравнима с активностью формиатдеги-дрогеназ микроорганизмов, хотя она уступает FDH метилотрофных бактерий и пекарских дрожжей. Как уже отмечалось выше, в ходе выделения может происходить частичная инактивация ферментов, поэтому расчет каталитической константы на основе величин удельной активности и молекулярной массы может давать заниженные значения k . Это особенно важно в случае SoyFDH, термостабильность которой намного ниже, чем у других FDH (см. ниже раздел по термостабильности). Поэтому нами разработана методика определения концентрации активных центров рекомбинантной SoyFDH, основанная на тушении собственной флуоресценции фермента при его титровании азид-ионом в присутствии кофермента NAD+ [64]. Азид-ион является сильным конкурентным ингибитором SoyFDH (K; = 3.6 х 10-7 M), поэтому в условиях, обеспечивающих эквимолярное связывание фермента и ингибитора, наблюдается линейная зависимость тушения флуоресценции FDH от концентрации азида. Определенная из этих экспериментов величина kcat фактически совпала с величиной, рассчитанной по удельной активности и молекулярной массе. Полученные данные свидетельствуют, что, несмотря на низкую термостабильность, SoyFDH, выделяемая по разработанной нами методике, не инак-тивируется. В настоящее время эта методика активно используется для определения величин kcat мутант-ных форм SoyFDH.

3. Растительные FDH имеют гораздо более низкие значения констант Михаэлиса как по формиа-ту, так и по коферменту NAD+, чем бактериальные и дрожжевые ферменты. Это очень важно для практического применения FDH. В настоящее время ре-комбинантные FDH Pseudomonas sp. 101 и C. boidinii, химическая и температурная стабильность которых улучшены методами белковой инженерии, используются для регенерации восстановленного кофермента (NADH или NADPH) в процессах синтеза хиральных соединений с помощью дегидрогеназ [6].

4. Практически все изученные FDH высокоспецифичны по отношению к коферменту NAD+. Их каталитическая эффективность в реакции с NAD+ выше, чем в реакции с NADP+ от 2500 (PseFDH) до 3 миллиардов (SceFDH) раз. Исключение составляет описанная совсем недавно FDH из патогенных бактерий Burkholderia stabilis, которая в 26 раз более эффек-

Таблица 2. Кинетические параметры формиатдегидрогеназ из различных источников

Препарат FDH Удельная активность, ед./мг k t c-1 cat, KM (NAD+), мкМ KM (формиат), мМ KM + (NADP+), мМ k NADP+ / cat / Ссылка

к NADP+ / M / /к NAD+ / cat

/ к NAD+ M

Arabidopsis thaliana, нативная, после аффинной хроматографии нд* нд 65 10 нд нд [27]

A. thaliana, нативная, из митохондрий нд нд 76 11 нд нд [59]

A. thaliana, рекомбинантная из трансгенного табака 1.3 0.87 78 11 нд нд [59]

A. thaliana, рекомбинантная из трансгенного табака + термообработка 5 мин при 60°С 0.1 0.07 35 3.3 нд нд [59]

A. thaliana, из митохондрий листьев 1.9 1.27 34 1.4 нд нд [60]

A. thaliana, рекомбинантная из E. coli 6.5 3.8 20 2.8 10 5.0 х10-5 [58]

Горох (семена) Pisum sativum нд нд 22 2 [61] 1.67; 6.25 [62] нд нд [61, 62]

Бобы Маш, Phaseolus aureus, нативная нд нд 7.2 1.6 нд нд [63]

Соя, Glycine max, нативная нд нд 5.7 0.6 нд нд [57]

Соя, G. max, рекомбинантная 4.0 2.83 [64] 13.2 1.5 1 8.7 Х10-4 [58, 64, 76]

Lotus japonicus нд 1.2 (NAD+) 0.005 (NADP+) 25.9 6.1 29.5 3.7 Х10-6 [10]

Шпинат, Spinacia oleracea l., из листьев нд нд нд 1.7 нд нд [16]

Картофель Solanum tuberosum нд нд 19 0.54 нд нд [29]

C. boidinii, рекомбинантная, дикого типа 6.3 3.7 37 5.9 нд нд [65]

C. metillica, дикого типа 2.1 1.4 55 нд нд < 4х10-6 [66]

Saccharomyces cerevisiae, рекомбинантная 10 6.5 36 5.5 нд < 3.3Х10-10 [67, 68]

Burkholderia stabilis нд 1.66 (NAD+) 4.75 (NADP+) 1430 55.5 0.16 25.9 [51]

Moraxella sp. C2, рекомбинантная 10.0 7.3 80 7.5 нд нд [6]

Pseudomonas sp. 101 10.0 7.3 60 7 >200 4.2 Х10-4 [6]

*нд - нет данных.

тивна в реакции с NADP+, чем с NAD+ [51]. Отметим, что мутантная PseFDH, коферментная специфичность которой сменилась с NAD+ на NADP+, получена еще в 1993 г. [6, 68], и такой фермент успешно использовали для регенерации NADPH [69, 70]. Для получения NADP+-специфичного фермента очень привлекательной выглядит SoyFDH, которая имеет самое низкое значение КМ по NADP+ среди всех NAD+-специфичных FDH дикого типа [58] (табл. 2).

температурная стабильность растительных формиатдегидрогеназ

До получения рекомбинантных AthFDH и SoyFDH в клетках E. coli систематические исследования термостабильности растительных FDH не проводили. Согласно [59], после инкубации трансгенной AthFDH в течение 5 мин при 60°С значения КМ по формиату и NAD+ снижаются, однако величина удельной активности упала при этом в 13 раз. Нами проведены систематические исследования температурной стабильности рекомбинантных AthFDH и SoyFDH с использованием двух подходов - определения кинетики термоинактивации и дифференциальной сканирующей калориметрии [71, 72]. Оказалось, что термоинактивация растительных FDH, как и их аналогов из бактерий и дрожжей, протекает по мономолекулярному механизму. Зависимости падения активности AthFDH и SoyFDH от времени описываются кинетикой реакции первого порядка, а величина наблюдаемой константы скорости инактивации первого порядка не зависит от концентрации фермента. AthFDH и SoyFDH очень сильно отличаются по тер-

мостабильности. AthFDH теряла 50% активности за 20 мин при 59.5°С, а SoyFDH - при 52.8°С. Разница почти в 7оС соответствует разнице в константах скорости инактивации более чем в 1000 раз. Фактически AthFDH уступает по термостабильности только FDH Pseudomonas sp. 101 (63.0°С, самая стабильная FDH из известных) [6] и Staphylococcus aureus (62.0°С) и превосходит все остальные известные микробные формиатдегидрогеназы. SoyFDH, наоборот, уступает по стабильности всем известным FDH за исключением фермента из пекарских дрожжей, у которого существует другой механизм инактивации. Зависимости константы скорости инактивации AthFDH и SoyFDH от температуры описываются уравнением теории активированного комплекса. Рассчитанные значения энтальпии АН*- и энтропии AS*-активации приведены в табл. 3. Видно, что термостабильность формиатдегидрогеназ хорошо коррелирует со значениями АН* и AS*. Наиболее высокие значения характерны для самой стабильной PseFDH, а наиболее низкие - для SoyFDH.

Результаты экспериментов по изучению термостабильности растительных FDH с помощью дифференциальной сканирующей калориметрии хорошо согласуются с данными по кинетике инактивации. В табл. 3 приведены значения температуры и теплоты фазового перехода. Для всех изученных FDH характерна высокая кооперативность процесса денатурации. PseFDH имеет самое большое значение теплоты плавления, у SoyFDH это значение в 2.5 раза меньше. Температура плавления AthFDH выше, чем у CboFDH и MorFDH.

Таблица 3. Параметры термоинактивации формиатдегидрогеназ из разных источников

Источник FDH Кинетика термоинактивации* Дифференциальная сканирующая калориметрия* [72]

AH', кДж/моль AS', Дж/ (моль-град) Cp, кДж/моль T , °C m7 T °C 1 1/2 c

Pseudomonas sp. 101 540 [6] 1320 [6] 2060 67.6 5.4

Moraxella sp. C2 нд** нд** 1830 63.4 4.9

Candida boidinii 480 [77] 1250 [77] 1730 64.4 5.3

Saccharomyces cerevisiae 420 [67] нд 820 46.4 3.2

Arabidopsis thaliana 490 [6] 1200 [6] 1330 64.9 5.9

Glycine max 370 [76] 860 [76] 820 57.1 7.5

*Все измерения проводили в 0.1 М фосфатном буфере, рН 7.0. **Нет данных.

В настоящее время нами проводятся эксперименты по повышению термостабильности рекомбинант-ной SoyFDH методами генной инженерии.

химическая стабильность растительных формиатдегидрогеназ

FDH активно используется в процессах синтеза оптически активных соединений, катализируемых дегидрогеназами. В этих процессах очень большую роль играет операционная стабильность, т.е. время работы фермента. В условиях биокаталитического процесса инактивация FDH связана или с окислением кислородом, или с химической модификацией сульфгидрильных групп фермента. Операционная стабильность PseFDH и cboFDH была повышена с помощью направленного мутагенеза двух остатков Cys [6, 65]. Как уже отмечалось выше, в растениях синтез FDH усиливается при различных стрессовых воздействиях. В этих же условиях, как правило, в клетке резко возрастает концентрация активных форм кислорода (супероксид-радикалы, пероксид водорода и др.). Следовало ожидать, что для обеспечения высокой активности при стрессе растительные FDH должны быть гораздо более устойчивыми к воздействию таких агентов, чем формиатдегидро-геназы, функционирующие в нестрессовых условиях. Для проверки этой гипотезы изучили кинетику инактивации под действием пероксида водорода ре-комбинантных AthFDH, SoyFDH, PseFDH, а также FDH из S. aureus дикого типа (SauFDH) и трех му-тантных PseFDH, в которых заменили один или два остатка cys. FDH из S. aureus также является белком стресса, поскольку ее биосинтез возрастает в 20 раз

при переходе стафилококков от планктонного роста к образованию биопленок [73]. Оказалось, что скорость инактивации AthFDH и SoyFDH под действием Н2О2 примерно одинакова, и она в 18 раз ниже, чем у PseFDH дикого типа. В этих же условиях стабильность SauFDH была в 6 раз выше, чем у растительных ферментов [74]. PseFDH с такой же стабильностью, как у SoyFDH, удалось получить только после двойной замены Cys145Ser/Cys255/Ala. Таким образом, показано, что FDH растений и бактерий, синтезируемые при стрессовых воздействиях, действительно обладают более высокой химической стабильностью, чем формиатдегидрогеназы, синтез которых индуцируется другими факторами. Кроме того, изучение термоинактивации формиатдегидро-геназ в присутствии пероксида водорода может использоваться для сравнительной оценки химической стабильности FDH in vivo.

структурные исследования формиатдегидрогеназ растений

FDH не относится к кристаллографически очень хорошо изученным ферментам. До недавнего времени в банке трехмерных структур белков PDB были депонированы структуры FDH только из трех источников - бактерий Pseudomonas sp. 101 и Moraxella sp. c2 (свободные ферменты и в тройном комплексе с NAD+ и азидом) и дрожжей C. boidinii (структуры двух мутантных форм апо-фермента). В случае формиатдегидрогеназ свободный фермент находится в «открытой» форме. При образовании тройного комплекса FDH-NAD+^зид, структура которого считается аналогом структуры фермента в переход-

А

Б

Рис. 4. Структуры апо- (А) и холо- (Б) форм FDH из Л. ^аНапа. Рисунки получены с использованием структур 3JTM и 3N7U соответственно. Молекулы NAD+ и азид-иона показаны в структуре холо-формы маджентой и красным соответственно.

ном состоянии, происходит значительная компак-тизация белковой глобулы, и FDH переходит в «закрытое» состояние. Разработка высокоэффективной системы экспрессии AthFDH и SoyFDH в клетках E. coli позволила приступить к их кристаллизации и определению структуры. В настоящее время решены структуры AthFDH как в открытой, так и в закрытой конформации (3NAQ и 3N7U, разрешение 1.7 и 2 Ä соответственно). Для получения структуры AthFDH в открытой конформации с более высоким разрешением (3JTM, 1.3 Ä) кристаллы фермента были получены в космосе [75]. На рис. 4 представлены структуры апо- и холо-AthFDH (открытая и закрытая конформации соответственно). Более подробный анализ этих структур будет приведен в отдельных статьях. Как на земле, так и в космосе получены кристаллы только тройного комплекса SoyFDH-NAD+-азид FDH сои G. max. Структуры этих комплексов определены с разрешением 1.9 Ä, готовится их депонирование в банк структур PDB.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Опубликованные и наши собственные данные свидетельствуют, что в растениях FDH играют очень важную роль, особенно при ответе на стрессовые воздействия. Регуляция биосинтеза и физиологическая роль FDH многообразны, сложны и до конца так и не выяснены. Систематическое изучение структуры и функции этих ферментов находится только

в начальной стадии. Результаты таких исследований представляют очень большой интерес для фундаментальной науки, и имеют важное практическое значение. Получение мутантных форм FDH с высокой активностью открывает новый путь к созданию растений с повышенной устойчивостью к неблагоприятным воздействиям, поскольку при таком же уровне экспрессии, как и у FDH дикого типа, более активные мутантные ферменты будут более эффективно снабжать клетку энергией, необходимой для преодоления неблагоприятных последствий стресса. FDH из сои также рассматривается как исключительно перспективная для создания высокоэффективного биокатализатора регенерации NAD(P)H в процессах синтеза оптически активных соединений с помощью дегидрогеназ. Природный фермент отличается высокой операционной стабильностью и среди известных FDH имеет одну из самых низких величин константы Михаэлиса как по NAD+, так и по формиату. Однако для практического внедрения SoyFDH необходимо повысить ее каталитическую активность и термостабильность. В этом направлении нами сейчас ведутся активные исследования. •

Работа выполнена при финансовой поддержке

Министерства образования и науки РФ (госконтракт № 16.512.11.2148) и Российского фонда фундаментальных исследований (грант № 11-04-00920).

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Родионов Ю.В. // Успехи микробиологии. 1982. Т. 16. С. 104-138.

2. Ferry J.G. // FEMS Microbiol. Rev. 1990. V. 7. P. 377-382.

3. Vinals C., Depiereux E., Feytmans E. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1993. V. 192. P. 182-188.

4. Tishkov V.I., Galkin A.G., Egorov A.M. // Biochimie. 1989. V. 71. № 4. P. 551-557.

5. Тишков В.И., Попов В.О. // Биохимия. 2004. Т. 69. C. 15371554.

6. Tishkov V.I., Popov V.O. // Biomol. Eng. 2006. V. 23. P. 89-110.

7. Hourton-Cabassa C., Ambard-Bretteville F., Moreau F., Davy de Virville J., Remy R., Colas des Francs-Small C. // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 627-635.

8. Suzuki K., Itai R., Suzuki K., Nakanishi H., Nishizawa N.-K., Yoshimura E., Mori S. // Plant Physiol. 1998. V. 116. P. 725-732.

9. Thompson P., Bowsher C.G., Tobin A.K. // Plant Physiol. 1998. V. 118. P. 1089-1099.

10. Andreadeli A., Flemetakis E., Axarli I., Dimou M., Udvardi M.K., Katinakis P., Labrou N.E. // Biochim. Biophys. Acta.

2009. V. 1794. P. 976-984.

11. David P., Colas des Francs-Small C., Sevignac M., Thareau V., Macadre C., Langin T., Geffroy V. // Theor. Appl. Genet.

2010. V. 121. P. 87-103.

12. Thunberg T. // Arch. Physiol. Biochem. 1921. V. 18. P. 601-606.

13. Davison D.C. // Biochem. J. 1951. V. 49. P. 520-526.

14. Davies D.D. // J. Exp. Bot. 1956. V. 7. P. 203-218.

15. Mazelis M. // Plant Physiol. 1960. V. 35. P. 386-391.

16. Halliwell B. // Biochem. J. 1974. V. 138. P. 77-85.

17. Jansch L., Kruft V., Schmitz U.K., Braun H.-P. // Plant J. 1996. V. 9. № 3. P. 357-368.

18. Oliver D.J. // Plant Physiol. 1981. V. 68. P. 703-705.

19. Hanson A.D., Nelsen C.E. // Plant Physiol. 1978. V. 62. P. 305-312.

20. Colas des Francs-Small C., Ambard-Bretteville F., Darpas A., Sallantin M., Huet J.-C., Pernollet J.-C., Remy R. // Plant Physiol. 1992. V. 98. P. 273-278.

21. Colas des Francs-Small C., Ambard-Bretteville F., Small I.D., Remy R. // Plant Physiol. 1993. V. 102. P. 1171-1177.

22. Herbik A., Giritch A., Horstmann C., Becker R., Balzer H.-J., Baumlein H., Stephan U.W. // Plant Physiol. 1996. V. 111. P. 533-540.

23. Dubos C., Plomion C. // Plant Mol. Biol. 2003. V. 51. P. 249262.

24. Minami A., Nagao M, Arakawa K, Fujikawa S., Takezawa D. // J. Plant Physiol. 2003. V. 160. P. 475-483.

25. Yin L., Lan Y., Zhu L. // Plant Mol. Biol. 2008. V. 68. P. 597617.

26. Fukusaki E., Ikeda T., Shiraishi T., Nishikawa T., Kobayashi A. // J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 90. P. 691-693.

27. Olson B.J., Skavdahl M., Ramberg H., Osterman J.C., Markwell J. // Plant Sci. 2000. V. 159. P. 205-212.

28. Herman P.L., Ramberg H., Baack R.D., Markwell J., Oster-man J.C. // Plant Sci. 2002. V. 163. P. 1137-1145.

29. Ambard-Bretteville F., Sorin C., Rebeille F., Hourton-Cabas-sa C., Colas des Francs-Small C. // Plant Mol. Biol. 2003. V. 52. P. 1153-1168.

30. Igamberdiev A.U., Bykova N.V., Kleczkowski L.A. // Plant Physiol. Biochem. 1999. V. 37. № 7-8. P. 503-513.

31. Li R., Moore M., King J. // Plant Cell Physiol. 2003. V. 44. № 3. P. 233-241.

32. Perales M., Eubel H., Heinemeyer J., Colaneri A., Zabaleta E., Braun H.P. // J. Mol. Biol. 2005. V. 350. P. 263-277.

33. Bykova N.V., Egsgaard H., M0ller I.M. // FEBS Lett. 2003. V. 540. P. 141-146.

34. Bykova N.V., Stensballe A., Egsgaard H., Jensen O.N., M0ller I.M. // J. Biol. Chem. 2003. V. 278. P. 26021-26030.

35. Kruger A., Peskan-Berghofer T., Frettinger P., Herrmann S., Buscot F., Oelmuller R. // New Phytol. 2004. V. 163. P. 149-157.

36. Bruggmann R., Abderhalden O., Reymond P., Dudler R. // Plant Mol. Biol. 2005. V. 58. P. 247-267.

37. Giri A.P., Wunsche H., Mitra S., Zavala J.A., Muck A., Svatos A., Baldwin I.T. // Plant Physiol. 2006. V. 142. P. 1621-1641.

38. Umezawa T., Sakurai T., Totoki Y., Toyoda A., Seki M., Ishi-wata A., Akiyama K., Kurotani A., Yoshida T., Mochida K., et al. // DNA Res. 2008. V. 15. P. 333-346.

39. Kikuchi S., Satoh K., Nagata T., Kawagashira N., Doi K., Kishimoto N., Yazaki J., Ishikawa M., Yamada H., Ooka H., et al. // Science. 2003. V. 301. P. 376-379.

40. Liu X., Lu T., Yu S., Li Y., Huang Y., Huang T., Zhang L., Zhu J., Zhao Q., Fan D., et al. // Plant Mol. Biol. 2007. V. 65. P. 403-415.

41. Shiraishi T., Fukusaki E., Kobayashi A. // J. Biosci. Bioeng. 2000. V. 89. P. 241-246.

42. David P., Chen N.W.G., Pedrosa-Harand A., Thareau V., Sevignac M., Cannon S.B., Debouck D., Langin T., Geffroy V. // Plant Physiol. 2009. V. 151. P. 1048-1065.

43. Rensing S.A., Lang D., Zimmer A.D., Terry A., Salamov A., Shapiro H., Nishiyama T., Perroud P.-F., Lindquist E.A., Kamisugi Y., et al. // Science. 2008. V. 319. № 5859. P. 64-69.

44. Ralph S.G., Chun H.J., Kolosova N., Cooper D., Oddy C., Ritland C.E., Kirkpatrick R., Moore R., Barber S., Holt R.A., et al. // BMC Genomics. 2008. V. 9. Р. 484.

45. Tuskan G.A., Difazio S., Jansson S., Bohlmann J., Grigoriev I., Hellsten U., Putnam N., Ralph S., Rombauts S., Salamov A., et al. // Science. 2006. V. 313. P. 1596-1604.

46. Paterson A.H., Bowers J.E., Bruggmann R., Dubchak I., Grimwood J., Gundlach H., Haberer G., Hellsten U., Mitros T., Poliakov A., et al. // Nature. 2009. V. 457. № 7229. P. 551-556.

47. Kawaura K., Mochida K., Enju A., Totoki Y., Toyoda A., Sakaki Y., Kai C., Kawai J., Hayashizaki Y., Seki M., et al. // BMC Genomics. 2009. V. 10. Р. 271.

48. Alexandrov N.N., Brover V.V., Freidin S., Troukhan M.E., Ta-tarinova T.V., Zhang H., Swaller T. J., Lu Y.P., Bouck J., Flavell R.B., et al. // Plant Mol. Biol. 2009. V. 69. P. 179-194.

49. Hwang L., Hocking-Murray D., Bahrami A.K., Andersson M., Rine J., Sil A. // Mol. Biol. Cell. 2003. V. 14. P. 2314-2326.

50. Тишков В.И., Галкин А.Г., Егоров А.М. // Докл. АН СССР. 1991. Т. 317. С. 745-748.

51. Hatrongjit R., Packdibamrung K. // Enz. Microb. Technol. 2010. V. 46. P. 557-561.

52. Barnett M.J., Fisher R.F., Jones T., Komp C., Abola A.P., Barloy-Hubler F., Bowser L., Capela D., Galibert F., Gouzyet J., et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2001. V. 98. № 17. P. 9883-9888.

53. Ambard-Bretteville F., Small I., Grandjean O., Colas des Francs-Small C. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 2003. V. 311. P. 966-971.

54. Weerasinghe P.A., Weerasekera M.L.M.C., van Holm L.H.J. // Biologia Plantarum. 1999. V. 42. P. 541-547.

55. Colic S., Milatovic D., Nikolic D., Zec G. // Hort. Sci. (Prague). 2010. V. 37. P. 56-61.

56. Colich S., Milatovich D., Nikolich D., Zec G. // Bulgarian J. Agricul. Sci. 2009. V. 15. P. 552-556.

57. Farinelli M.P., Fry D.W., Richardson K.E. // Plant Physiol. 1983. V. 73. P. 858-859.

58. Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Ясный И.Е., Войнова Н.С., Алексеева А.А., Петров А.С., Тишков В.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2006. Т. 47. № 1. С. 31-34.

59. Baack R.D., Markwell J., Herman PL., Osterman J.C. // J. Plant Physiol. 2003. V. 160. P. 445-450.

60. Li R., Ziola B., King J. // J. Plant Physiol. 2000. V. 157. P. 161-167.

61. Uotila L., Koivusalo M. // Arch. Biochem. Biophys. 1979. V. 196. P. 33-45.

62. Ohyama T., Yamazaki I. // J. Biochem. 1975. V. 77. P. 845-852.

63. Peacock D., Boulter D. // Biochem. J. 1970. V. 120. P. 763-769.

64. Романова Е.Г., Алексеева А.А., Пометун Е.В., Тишков

B.И. // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. 2010. Т. 51. № 3.

C. 156-159.

65. Slusarczyk H., Felber S., Kula M.R., Pohl M. // Eur. J. Biochem. 2000. V. 267. P. 1280-1289.

66. Karaguler N.G., Sessions R.B., Clarke A.R., Holbrook J. // Biotechnol. Lett. 2001. V. 23. P. 283-287.

67. Серов А.Е. Взаимосвязь структуры и свойств рекомби-нантных формиатдегидрогеназ из пекарских дрожжей и метилотрофных бактерий: Дис. ... канд. хим. наук. М.: МГУ им. М.В. Ломоносова, 2002.

68. Serov A.E., Popova A.S., Fedorchuk V.V., Tishkov V.I. // Biochem. J. 2002. V. 367. P. 841-847.

69. Seelbach K., Riebel B., Hummel W., Kula M.-R., Tishkov V.I., Egorov A.M., Wandrey C., Kragl U. // Tetrahedron Lett. 1996. V. 37. № 9. P. 1377-1380.

70. Rissom S., Schwarz-Linek U., Vogel M., Tishkov V.I., Kragl U. // Tetrahedron: Assymetry. 1997. V. 8. № 15. P. 2523-2526.

71. Садыхов Э.Г., Серов А.Е., Войнова Н.С., Угланова С.В., Петров А.С., Алексеева А.А., Клейменов С.Ю., Попов В.О., Тишков В.И. // Прикл. биохимия и микробиол. 2006. T. 42. № 3. C. 269-273.

72. Садыхов Э.Г. Получение, термостабильность и структурные исследования формиатдегидрогеназ из различных источников: Дис. . канд. хим. наук. М.: Институт биохимии им. А.Н. Баха РАН, 2007.

73. Resch A., Rosenstein R., Nerz C., Gotz F. // Appl. Environ. Microbiol. 2005. V. 71. № 5. P. 2663-2676.

74. Савин С.С., Тишков В.И. // Acta Naturae. 2010. Т. 2. № 1(4). С. 80-84.

75. Шабалин И.Г., Серов А.Е., Скиргелло О.Е., Тимофеев В.И., Самягина В.Р., Попов В.О., Тишков В.И., Куранова И.П. // Кристаллография. 2010. T. 55. № 5. C. 855-859.

76. Alekseeva A.A., Shabalin I.G., Polyakov K.M., Tishkov V.I. // J. Biotechnol. 2010. V. 150. № S1. P. 476.

77. Тишков В.И., Угланова С.В., Федорчук В.В., Савин С.С. // Acta Naturae. 2010. T. 2. № 2(5). C. 86-92.