Технология получения рекомбинантных аденовирусов celo в куриных эмбрионах в препаративных количествах Текст научной статьи по специальности «Промышленные биотехнологии»

І І І І І

&

БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 112-113

ПРАКТИКУМ

Технология получения рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах в препаративных количествах

М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов, Л.В. Черенова, Е.Г. Пикер

НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва

Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва

Описание технологии наращивания количества вирусных частиц рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах, позволяющее получать препараты вируса с концентрацией более 1013 частиц/мл и титром 1011 БОЕ/мл. Выход вируса составляет более 3 х 1012 частиц из одного эмбриона.

Ключевые слова: рекомбинантные аденовирусы птиц CELO, куриные эмбрионы, технология.

Вирусные векторы на основе генома аденовируса птиц CELO (ЕАУ-1) CELO имеют хорошие перспективы использования в создании живых маркированных вакцин для птицеводства, в качестве субъединичных вакцин для применения в ветеринарии и медицине, а также в генной терапии. Рекомбинантные аденовирусы CELO способны к размножению в куриных эмбрионах, что позволяет сделать процесс получения препаративного количества вирусных векторов высокотехнологичным и экономически выгодным. Куриные эмбрионы являются хорошо изученной и безопасной (в случае использования SPF-эмбрионов) системой для получения биологических препаратов. Разработанная технология получения рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах позволяет получать препараты вируса с концентрацией более 1013 частиц/мл и титром 1011 БОЕ/мл (БОЕ — бляшкообразующие единицы). Выход вируса составил более 3 х 1012 частиц из одного эмбриона.

Технологическая схема

1. Для заражения куриных эмбрионов необходимо приготовить вирусную «зат-

равку», которая представляет собой грубый лизат клеток LMH, зараженных рекомбинантным аденовирусом CELO, титр которого должен быть не менее 5 х 107 БОЕ/мл. Необходимо провести трехкратное замораживания/оттаивание этого препарата аденовируса и хранить до заражения эмбрионов при —70 0С для предотвращения снижения титра вируса.

2. Эмбрионы 10-дневного возраста для заражения подготовить следующим образом:

A. Провести овоскопирование эмбри -онов, отметить границы воздушной камеры и расположение эмбриона.

Б. Провести фломбирование поверхности скорлупы со стороны воздушной камеры эмбриона.

B. Сделать с помощью пробойника отверстие в скорлупе на расстоянии 2-3 мм выше границы воздушной камеры со стороны противоположной той стороне, с которой расположен эмбрион.

3. Заражение куриных эмбрионов проводить при помощи стерильного шприца объемом 5 мл. Иглу вводить в от-

112

I I I I I

Технология получения рекомбинантных аденовирусов

Введение в аллантоис рекомбинантного вируса CELO

Аллантоис

Инкубирование при 37 ОС

Куриный эмбрион

Отбор аллантоисной жидкости, содержащей рекомбинантный аденовирус CELO

Очистка и концентрирование ультрацентрифугированием в градиенте CsCl

Очищенный препарат рекомбинантного вируса CELO

Схема получения препаратного количества рекомбинантного вируса CELO в куриных эмбрионах

верстие в скорлупе на 10—12 мм под углом 45О к центру эмбриона. Доза заражения должна быть не менее 2 х 107 БОЕ/эмбрион (объем заражающей дозы 400—500 мкл в зависимости от титра препарата вирусной «затравки»).

4. После введения вирусосодержащей жидкости в эмбрион отверстие в скорлупе необходимо залить расплавленным парафином.

5. Инкубировать эмбрионы после заражения при 37 ОС в течение 2 суток.

6. После инкубации поместить эмбрионы в холодильную камеру при +4 ОС и охладить в течение 16—18 часов.

7. Вскрыть скорлупу эмбрионов со стороны воздушной камеры и отобрать аллантоисную жидкость (средний объем аллантоисной жидкости составляет около 10 мл из одного эмбриона). Аллантоисную жидкость осветлить центрифугированием при 4000 об/мин и +4 ОС в течение 15 мин.

8. Рекомбинантный аденовирус из аллантоисной жидкости очистить двукратным ультрацентрифугированием в градиенте хлористого цезия.

9. Определить концентрацию и титр полученного очищенного препарата рекомбинантного аденовируса CELO.

Предложенная нами технологическая схема накопления рекомбинантных аденовирусов CELO позволяет получать вирусные препараты в количествах, необходимых для проведения экспериментов на животных, в том числе доклинических и клинических испытаний.

THE PROCESS FOR PRODUCING THE ADENOVIRUS CELO RECOMBINANTS

IN CHICKEN EMBRYOS

M.M. Shmarov, D.Yu. Logunov, L.V. Cherenova, E.G. Piker

Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow

Technology for escalating recombinant adenoviruses CELO in chicken embryos that allows getting virus preparations with concentration more than 1013 particles/ml and titer of 1011 PFC/ml is presented. The output of viruses exceeded 3 x 1012 particles per embryo.

Key words: recombinant adenoviruses CELO, chicken embryos, technology.