CC BY
89
БИОМЕДИЦИНА • № 1 2005, с. 103-107
Разработка технологии получения рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах в препаративных количествах
М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов, Л.В. Черенова, Е.Г. Пикер
НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи РАМН, Москва
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
Разработан метод получения препаративных количеств рекомбинантных векторов CELO в куриных эмбрионах, представляющий собой высокотехнологичный процесс с относительно низкой себестоимостью по сравнению с увеличением в культуре количества клеток векторов на основе аденовирусов млекопитающих.
Ключевые слова: рекомбинантные векторы CELO, куриные эмбрионы, технология.
Введение
В настоящее время аденовирусы широко применяются в качестве векторов для транзиентной экспрессии генов в клетках млекопитающих in vivo и in vitro [3, 4, 12, 14, 18, 19]. Активно исследуется возможность применения векторов на основе Ад человека и животных в качестве живых рекомбинантных вакцин для ветеринарии и медицины, а также для генной терапии.
Особый интерес представляют векторы на основе аденовируса птиц CELO (FAV-1). Вирус CELO был охарактеризован как инфекционный агент в 1957 году [20]. До настоящего времени в литературе не были описаны патологии кур, связанные с их инфицированием вирусом CELO, т.е. инфекция протекает латентно и не имеет экономических последствий. Показано, что вирус CELO может быть выделен от здоровых кур, и не вызывает заболеваний при экспериментальном заражении [7]. Эффективное размножения аденовируса CELO происходит только в куриных эмбрионах в возрасте 9-14 дней.
Впервые возможность получения эукариотического вектора на основе аденовируса птиц CELO была показана в 1999 году группой исследователей под руководством M. Cotten [17]. На данный момент суще-
ствуют три способа получения рекомбинантных аденовирусов CELO: метод гомологической рекомбинации фрагментов вирусного генома в составе плазмид в клетках E. СоН [17], метод гомологичной рекомбинации между вирусной ДНК и челночным плазмидным вектором в культуре клеток LMH [2] и метод получения рекобинантных аденовирусов CELO с использованием космидных векторов [9].
Показано, что участок генома протяженностью около 3600 пар нуклеотидов, находящийся на правом конце генома, является «несущественным» для репликации вируса CELO в культуре клеток LMH [17]. Пакующая емкость векторов на основе генома аденовируса CELO составляет более 5500 пар нуклеотидов.
Одним из важных преимуществ данной векторной системы является отсутствие предсуществующего иммунного ответа в организме человека против аденовируса птиц CELO. Иммунный ответ является одним из факторов, препятствующих успешному применению аденовирусных векторов на основе Ад5 и других серотипов аденовирусов человека. Кроме того, известно, что CELO не способен к полноценному циклу репликации в клетках человека или млекопитающих и является по отношению к данным хозяевам дефектным.
М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов, Л.В. Черенова, Е.Г. Пикер
Особенностью аденовируса птиц CELO является способность размножаться не только в культуре таких клеток, как Ад млекопитающих, но и в куриных эмбрионах [6, 15].
Наработка препаративных количеств рекомбинантных векторов CELO в куриных эмбрионах является высокотехнологичным процессом с относительно низкой себестоимостью в сравнении с наращиванием в культуре клеток векторов на основе аденовирусов млекопитающих. Куриные эмбрионы являются хорошо изученной и безопасной системой для получения биологических препаратов в случае использования SPF-эмбрионов. Это является большим преимуществом векторов CELO при создании живых маркированных вакцин для птицеводства, в качестве субъединичных вакцин для применения в ветеринарии и медицине, а также для генной терапии.
Эффективность получения препаративного количества рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах возможно повысить за счет применения для концентрации и очистки аденовирусных препаратов методов колоночной анионообменной хроматографии и гель-фильтрации [13], которые позволяют уве-
личивать отношение количества инфекционных частиц к общему количеству вирионов. Это очень важно для снижения антигенной нагрузки капсидных вирусных белков в лекарственных и профилактических препаратах. Кроме того, применение колоночной хроматографии для очистки рекомбинантных аденовирусов повышает безопасность их использования в медицине и ветеринарии по сравнению с применением ультрацентрифугирования в градиенте хлористого цезия.
К настоящему времени имеется набор рекомбинантных аденовирусов CELO, экспрессирующих различные целевые гены (см. таблицу).
Нами отработана технология увеличения количества рекомбинантных частиц аденовирусов CELO в куриных эмбрионах, несущих как репортерные (GFP, 8ЕАР), так и целевые гены.
Материалы и методы
В работе были использованы рекомбинантные аденовирусы птиц CELO-GFP [2] и CELO-SEAP [1], несущие репортерные гены зеленого флуоресцентного белка (GFP) и секретируемой щелочной фосфа-тазы (SEAP), а также рекомбинантные аде-
Перечень целевых гелей, которые были использованы для получения рекомбинантных
аденовирусов
Целевой ген Источник целевого гена Авторы
VP2 Вирус инфекционного A. Francois et al.
бурсита кур (IBDV) [8]
Гликопротеин G Вирус бешенства М.М. Шмаров и др. [неопубликованные данные]
р53 Геном человека D.Y Logunov et al.
Опухолевый супрессор [16]
И-2 Геном человека L.V. Cherenova et al.
Цитокин [5]
Ангиогенин Геном человека С.В. Авдеева, В.З. Тарантул и др.
Фактор роста сосудов [в печати]
104
Разработка технологии получения рекомбинантных аденовирусов CELO ...
новирусы CELO-glRB, несущий ген гликопротеина G вируса бешенства, и CELO-p53, несущий ген белка p53 [16].
Клетки линии LMH (leghorn male hepatoma) были любезно предоставлены M. Cotten (Австрия). Клетки культивировались в среде DMEM с добавлением 10%-ной фетальной бычьей сыворотки.
Наращивание рекомбинантных аденовирусов CELO проводили на SPF-эмбрионах 9, 10 и 11-суточного возраста.
Очистка и концентрирование аденовирусов
Очистку и концентрирование рекомбинантных аденовирусов CELO из аллантоисной жидкости куриных эмбрионов проводили по модифицированному методу Green [11], состоящему из двух этапов.
1) Аллантоисную жидкость осветляли низкоскоростным центрифугированием, затем проводили концентрирование вирио-нов путем их осаждения на поверхность раствора CsCl плотностью 1,45 г/см3. Осаждение проводили на центрифуге Beckman L7-55 (США) в течение 1 часа при 23 тыс. об/мин и 15 °С в роторе SW27.
2) Очистка вируса центрифугированием в равновесном градиенте плотности CsCl (р = 1,345 г/см3) в течении 20 часов при 40 тыс. об/мин и 15 ОС в роторе VTI50 на центрифуге L7-55 Beckman (США). Интактные вирионы собирали в зоне плотности CsCl р = 1,35 г/см3, дефектные частицы вируса — в зоне плотности CsCl р = 1,311,33 г/см3.
Титрование вирусов
Титрование рекомбинантных аденовирусов CELO проводили по бляшкообразова-нию, как описано Graham [10]. Монослой клеток линии LMH на 6 см чашках инфицировали разведениями вируса, приготовленными на бессывороточной среде DMEM. После адсорбции вируса на клетках в течение 1 ч на клеточный монослой наносили покрытие, содержащее 0.5% ага-
розы в среде БМЕМ с 10% FBS. Чашки инкубировали в СО2-инкубаторе в течение 5-7 дней, после чего вносили вторую порцию покрытия с добавлением прижизненного красителя нейтрального красного в концентрации 33 мкг/мл покрытия. Учет результатов проводили на 8—12-й день после заражения. Титр аденовируса определяли в бляшкообразующих единицах (БОЕ) на 1 мл вирусного препарата.
Определение концентрации вируса
Для определения концентрации рекомбинантных аденовирусов необходимо провести диализ препарата вируса после очистки в градиенте хлористого цезия против буфера 1 (10 тМ Трис pH 7,5, 1 тМ М§С12, 10%-ный глицерин) в течение 16—18 ч при +4 ОС. В этом буфере аденовирусы можно хранить при —80 ОС, предварительно разлив препарат вируса на аликвоты. После диализа к 25 мкл вирусного препарата добавить 475 мкл буфера ТЕ (10 тМ Тиб pH 8,0, 1 тМ EDTA pH 8,0) с добавлением 0,1% SDS, встряхнуть на вортексе (5 минут), центрифугировать при 14000 об/мин (5 минут) и измерить оптическое поглощение супернатанта при длине волны 260 нм. Расчет количества вируса проводить исходя из соотношения: 1 ОЕ2б0 — 1012 физических частич аденовируса.
Результаты и обсуждение
Для проведения предклинических и клинических испытаний, а тем более для производства вакцин и лечебных препаратов необходимо оптимизировать условия получения препаративных количеств рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах с целью увеличения количества вируса, выделяемого из одного эмбриона. Также очень важной характеристикой получаемых вирусных препаратов является соотношение титра вируса и количества вирусных частиц, которые определяются по измерению содержания белка в очи-
М.М. Шмаров, Д.Ю. Логунов, Л.В. Черенова, Е.Г. Пикер
щенном препарате рекомбинантного аденовируса.
В нашей работе мы провели серию экспериментов по накоплению рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах, в которых варьировали возраст инфицируемых эмбрионов, дозу заражения и время инкубации эмбрионов после заражения. Возраст эмбрионов, используемых в экспериментах, составлял от 9 до 11 суток. Доза заражения рекомбинантными аденовирусами CELO была в диапозо-не от 102 до 108 БОЕ/эмбрион. Время инкубации эмбрионов при 37 ОС после заражения изменяли от 2 до 4 суток.
В результате проведенной работы была определена оптимальная методика получения препаративного количества рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах, при применении которой выход вируса составил более 3 ОЕ вируса (3х1012 вирусных частиц) из одного эмбриона. Соотношение инфекционных частиц и вирусных частиц при использовании приведенной ниже методики составляло 1:250. Применение данной схемы позволило повысить эффективность наращивания более чем в 10 раз.
Выводы
Выводы из данной работы сформулированы в виде технологической схемы получения препаративного количества рекомбинантных аденовирусов CELO в куриных эмбрионах. Общая схема их получения представлена на рисунке (см. «Технология получения аденовирусов CELO в куриных эмбрионах» в рубрике «Практикум»).
Литература
1. Логунов Д.Ю., Черенова Л.В., Шмаров М.М., Шашкова Е.В., Верховская Л.В., Доронин К.К., Народицкий Б.С. In vitro и in vivo доставка гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO.
106
4.
7.
9.
Молекулярная генетика, микробиология и вирусология, 2002 (4), с. 21-25.
Шмаров М.М., Черенова Л.В., Шашкова Е.В., Логунов Д.Ю., Верховская Л.В., Капитонов А.В., Неугодова Г.Л., Доронин К.К., Народицкий Б.С. Эукариотические векторы на основе генома аденовируса птиц CELO, несущие гены GFP и IL-2 человека. Молекулярная генетика, микробиология и вирусология», 2002 (2), с. 30-35.
Benihoud K., Yeh P., Perricaudet M. Adenovirus vectors for gene delivery. Curr. Opin. Biotechnol., 1999, v. 10(5), 440-447.
Berkner K.L. Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes. Biotechniques, 1988, v. 6(7), 616-629. Cherenova L.V., Logunov D.Y., Shashkova E.V., Shmarov M.M., Verkhovskaya L.V., Neugodova G.L., Kazansky D.B., Doronin K.K., Naroditsky B.S. Recombinant avian adenovirus CELO expressing the human interleukin-2: characterization in vitro, in ovo and in vivo. Virus Res, 2004, v. 100(2), 257-261.
Cotten M., Wagner E., Zatloukal K., Birnsti-el M.L. Chicken adenovirus (CELO virus) particles augment receptor-mediated DNA delivery to mammalian cells and yield exceptional levels of stable transformants. J. Virol., 1993, v. 67(7), 3777-3785.
Cowen B., Calnek B.W., Menendez N.A., Ball R.F. Avian adenoviruses: effect on egg production, shell quality, and feed consumption. Avian Dis., 1978, v. 22(3), 459-470.
Francois A., Chevalier C., Delmas B., Eterra-dossi N., Toquin D., Rivallan G., Langlois P. Avian adenovirus CELO recombinants expressing VP2 of infectious bursal disease virus induce protection against bursal disease in chickens. Vaccine, 2004, v. 22(17-18), 23512360.
Francois A., Eterradossi N., Delmas B., Payet V., Langlois P. Construction of avian adenovirus CELO recombinants in cosmids. J. Virol., 2001, v. 75, 5288-5301.
10. Graham F.L., Prevec L. Manipulation of adenovirus vectors. Methods in Mol.Biol., 1994, v. 7, 109-127.
11. Green K.Y., Wold W.S.M. Human adenoviruses: growth, purification and transfection assay. Methods of Enzymology, 1980, v. 80, 425-431.
Разработка технологии получения рекомбинантных аденовирусов CELO .
12. Grunhaus A., Horwitz M. Adenoviruses as cloning vectors. Semin. virol., 1992; v. 3, 237-252.
13. Kamen A., Henry O. Development and optimi- 17.
zation of an adenovirus production process. J.
Gene Med., 2004, v. 1, 184-192.
14. Kovesdi I., Brough D.E., Bruder J.T., Wickham T.J. Adenoviral vectors for gene transfer. 18.
Curr. Opin. Biotechnol., 1997, v. 8(5), 583-589.
15. Laver W.G., Younghusband H.B., Wrigley N.G.
Purification and properties of chick embryo lethal orphan virus (an avian adenovirus). Virology, 1971, v. 45(3), 598-614. 19.
16. Logunov D.Y., Ilyinskaya G.V., Cherenova L.V.,
Verhovskaya L.V., Shmarov M.M., Chumakov P.M., Kopnin B.P, Naroditsky B.S. Restoration 20.
of p53 tumor-suppressor activity in human tumor cells in vitro and in their xenografts in
vivo by recombinant avian adenovirus CELO-p53. Gene Ther., 2004, v. 11(1), 79-84. Michou A., Lehrmann H., Saltik M., Cotten M. Mutational analysis of the avian adenovirus CELO, which provides a basis for gene delivery vectors. J. Virol, 1999, v. 73, 1399-1410. Romano G., Micheli P., Pacilio C., Giordano A. Latest developments in gene transfer technology: achievements, perspectives, and controversies over therapeutic applications. Stem Cells, 2000, v. 18(1), 19-39.
Trapnell B.C., Gorziglia M. Gene therapy using adenoviral vectors. Curr. Opin. Biotechnol., 1994, v. 5(6), 617-625.
Yates V.J., Fry D.E. Observations on a chicken embryo lethal orphan (CELO) virus. Am. J. Vet. Res., 1957, v. 18, 657-660.
DEVELOPMENT OF PROCESS FOR PRODUCING THE PREPARATON AMOUNT OF ADENOVIRUS CELO RECOMBINANTS IN CHICKEN EMBRYOS
M.M. Shmarov, D.Yu. Logunov, L.V. Cherenova, E.G. Piker
Research Center for Biomedical Technologies of RAMS, Moscow
Hi-tech process for escalating the number of recombinant vectors in chicken embryos characterized by low cost in comparison with producing vectors on a mammal adenoviruses basis.
Key words: recombinant vectors CELO, chicken embryos, technology.
