CC BY
64
■ И I II II
■ I I I
Новости клеточных технологий
Технология создания онковакцин на основе активиро ванных ДК антигенами злокачественных стволовых клеток имеет огромные перспективы и, безусловно, будет разви ваться. У человека уже описано несколько видов ЗСК, ве дётся поиск их уникальных маркёров, которые могут служить
мишенью клеточной, химио и иммунотерапии. Безусловно, перед началом клинических испытаний методика, предло женная итальянскими исследователями, должна быть прове рена на других моделях. Тем не менее, именно такой подход найдёт быстрое клиническое воплощение.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Banchereau J., Palucka АК. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5(4): 296 306.
2. Nestle F.O., Farkas A., Conrad C. Dendritic cell based therapeutic
vaccination against cancer. Curr. Opin. Immunol. 2005; 17(2): 163 9.
3. Dalerba P., Cho R.W., Clarke M.F. Cancer Stem Cells: Model and Concepts. Annu. Rev. Med. 2007; 58: 18.1 18.18.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам: Cancer Res. 2006; 66: 10247-52
Технология получения партеногенетических линий эмбриональных стволовых клеток комбинацией с методом переноса ядра
Партеногенез - это процесс образования эмбриона из яйцеклетки, не оплодотворенной сперматозоидом. У неко торых животных этот процесс наблюдается в природе, но ни один вид млекопитающих не способен размножаться таким образом. Основные причины остановки развития - наруше ние экспрессии генов из за неправильной картины имприн тинга [1]. Геномный импринтинг - одна из форм регуляции генной экспрессии, при которой транскрипция гена зависит от пола особи, от которой был получен аллель этого гена. Данная регуляция осуществляется посредством метилиро вания генов. При импринтинге уровень транскрипции неко торых генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. В этом случае вклады отцовского и ма теринского геномов в развитие организмов неодинаковы. Поэтому для нормального развития эмбриона необходим хромосомный материал особей разных полов [2]. В экспе риментах на мышах партеногенезом удается получить за родыш из нескольких десятков клеток, очень редко эти эм брионы развиваются дольше [3]. Впрочем, получение партеногенетического клона - не первостепенная задача ученых. Перспектива использования стволовых клеток партеногенетических эмбрионов (parthenogenetic embryonic stem cells - pESC) в терапевтических целях может решить этические проблемы, связанные с получением эмбриональ ных стволовых клеток (ESC ЭСК) и обусловленные созда нием и разрушением эмбриона для их получения. ЭСК, по лученные из партеногенетических эмбрионов, могли бы иметь большое терапевтическое значение, если бы была показана их способность к дифференцировке, так же, как и ЭСК, полученных обычным путём. Однако, применение pESC в медицине пока невозможно, так как у этих клеток наруше ны развитие и способность к дифференцировке. Химерные мыши, полученные при смешении бластомеров нормальных и партеногенетических эмбрионов, задерживались в росте, у них наблюдалось частое образование опухолей [4].
Исследователям из Японии во главе с Takafusa Hikichi удалось повысить жизнеспособность и способность к диф ференцировке pESC мыши с помощью технологии перено са ядра (nuclear transfer - NT). Ядро из pESC было перене
сено в энуклеированный ооцит, затем из него были получе ны новые клетки - NT pESC. Таким образом было получено 84 клеточных линии. Некоторые линии были получены вслед ствие неоднократного переноса ядра. Все эти линии несли маркеры ЭСК и имели нормальный кариотип. Способность к дифференцировке этих клеток была значительно выше, чем у обычных pESC, что показано серией экспериментов in vitro и in vivo - в химерных мышах.
Исследователи использовали две различные линии мы шей для получения pESC, чтобы избежать нарушений раз вития, связанных с вырождением. Одна из этих линий -трансгенная содержала маркёрный белок GFP. Хромосом ный материал одного ооцита был перенесен в другой, затем искусственно было запущено развитие. Таким образом были получены партеногенетические эмбрионы, а затем и линии pESC (рис.). Далее их ядра были перенесены в ооциты мыши другой линии и индуцировано развитие. Полученные таким образом ESC имели нормальный кариотип и экспрессиро вали маркёры плюрипотентности 0ct4, Nanog и другие.
Схема эксперимента Hikichi Т., Wakayama Т. [с изменениями)
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
Ученые показали возможность дифференцировки этих клеток in vitro в нервную ткань и мезенхиму. В качестве кон троля использовали две линии ESC, полученные при обычном оплодотворении. Затем, NT pESC были использованы для получения химерных мышей. Органы этих мышей проана лизировали на содержание клеток NT pESC и их дериватов (по маркерному белку). В каждом образце уставливали уро вень метилирования импринтированных доменов, которые оказались гипометилированными по сравнению с нормой. При этом клетки NT pESC химеризовали органы и диффе ренцировались в тканях мышей.
Таким образом, японская группа исследователей показа ла положительное влияние процедуры переноса ядра на по тенциал развития партеногенетических ЭСК. Интересно, что в полученных линиях NT pESC не наблюдали феномена по тери X хромосомы, что обычно бывает при партеногенезе. В данном эксперименте все кариотипические и эпигенети ческие характеристики линий сохранялись, как и у pESC, на протяжении нескольких пассажей (до 30). Кроме того, уровень
успешного образования клеточных линий после переноса ядра партогенетической клетки в ооцит был в полтора два раза выше, чем при получении 1\1Т ЕЭС, когда донором ядра были соматические клетки или нормальные ЕЭС Причины этого неясны. Можно предположить, что улучшенное разви тие, дифференцировка и жизнеспособность этих клеток яви лись следствием отбора самых лучших клеток для донорства ядра и цитоплазмы, и этот отбор производился неоднократно в течение двух и более переносов генетического материала в ооцит. Возможно также, что здесь наблюдается влияние но вой цитоплазмы ооцита на ядро. В любом случае, положитель ный эффект переноса ядра на жизнеспособность и потенциал развития клеток 1ЧТ рЕБС был подтвержден серией экспе риментов. Причины изменений потенциала развития еще предстоит выяснить. Использование партеногенетических клеток в медицине имеет многообещающие перспективы. Не смотря на генетические нарушения и аномальность развития этих клеток по сравнению с ЕЭС, исследования в этой области имеют также и большое фундаментальное значение.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Surani М.А, Barton S.C., Norris M.L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 1984; 308(5959): 548 50.
2. McGrath J., Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 1984; 37(1): 179 83.
3. Kaufman M.H., Barton S.C., Surani M.A. Normal postimplantation development of mouse parthenogenetic embryos to the forelimb bud stage. Nature 1977; 265(5589): 53 5.
4. Holm T.M., Jackson Grusby L., Brambrink T. et al. Global loss of imprintinq leads to widespread tumoriqenesis in adult mice. Cancer Cell 2005; 8(4): 275 85.
Подготовила Т. Лопатина По материалам: Stem Cells 2007; 25:1:46-53
Создание гистосовместимых эмбриональных стволовых клеток методом партеногенеза
Генетически совместимые плюрипотентные эмбрио нальные стволовые клетки, созданные методами переноса ядра и/или с помощью партеногенеза (пЭСК), могут являть ся потенциальным источником тканей для трансплантации при различных заболеваниях.
Результатом партеногенеза у многих животных является развитие нормального эмбриона без предварительного оп лодотворения овоцита. Однако грызуны не относятся к таким видам, так как их пренатальное развитие требует экспрес сии генов отцовского генома (пронуклеуса). Ранее сообща лось о получении пЭСК из партеногенетических бластоцист мышей и приматов (1, 2]. При развитии таких животных на блюдалось явление партеногенетического химеризма. У человека такое явление было описано при получении парте ногенетических клеток кожи и гематопоэтической системы [3]. В 2004 году японской группой ТотоЫго Копо впервые была показана возможность рождения жизнеспособного потомства из партеногенетически развитых эмбрионов мыши (4).
Экспериментальный партеногенез у грызунов представ ляет собой остановку деления клеток во второй фазе мейо за, с последующей стимуляцией специальными агентами в присутствии цитохалазина, который предотвращает процесс выброса полярного тельца из ооцита. Таким образом сохра няется диплоидность, и «псевдозигота» может развиться в бластоцисту, из которой и выделяются пЭСК. ПЭСК несут уд воившиеся гаплоидные клетки, то есть они преимущественно
гомозиготны. Ткани, полученные из гомозиготных клеток, будут нести один из двух родительских наборов генов гисто совместимости и, теоретически, они будут предпочтительнее для пересадки, поскольку риск их отторжения будет значи тельно снижен. Однако, у гетерозиготных пациентов МНС гомозиготные ткани могут атаковаться натуральными кил лерами, которые распознают нехватку одного из наборов антигенов гистосовместимости. Этот процесс называется «гибридная устойчивость» и часто проявляется при пересад ке костного мозга. Поэтому идеальным вариантом была бы пересадка генотипированных МНС совместимых клеток.
Американские ученые под руководством G. Daley из Harvard Stem Cell Institute (Harvard University, Boston, USA) разработали метод создания гистосовместимых пЭСК. Уче ным удалось выделить и охарактеризовать плюрипотентные ЭСК, полученные партеногенезом, в которых поддерживалась экспрессия материнских локусов МНС. Ткани, возникшие из таких клеток, могут пересаживаться животным донорской линии без отторжения.
После партеногенетической активации ооцитов мышей и прерывания (остановки) их деления в первой или второй фазе мейоза пЭСК выделяли и генотипировали. Авторы при меняли специально разработанный метод - прямое секве нирование полиморфизмов (SNP генотипирование) для оп ределения линий пЭСК, которые несут последовательности главного комплекса гистосовместимости (МНС) донорского овоцита. Ткани, полученные после дифференцировки таких
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
