CC BY
32
■ И I II II
■m
Новости клеточных технологий
(трансфузии проводились в бедренную артерию), но и в мес тах удалённых от области первичного введения клеток. Это свидетельствует о том, что мезангиобласты способны к зна чительной миграции. Более того, в регенерирующих мышцах обнаруживался не только сам дистрофии, но и р саркогликан, являющийся компонентом дистрофиновой системы. При вве дении мезангиобластов в грудную ветвь аорты было показано наиболее сильное распространение их по мышечной системе организма, а также наилучшая степень регенерации.
Результаты исследования оказались более чем обнадё живающими: животное, получившее аортальную трансфузию аллогенных клеток, практически полностью восстановило способность нормально двигаться, остальные же продемон стрировали улучшения в несколько меньшей степени. В це лом, те собаки, которые получили трансфузии именно алло генных, но не аутогенных трансфецированных вектором мезангиобластов, демонстрировали более быстрое и эффек тивное улучшение качества жизни. Некоторые их мышцы, судя по биопсиям, после лечения практически не отличались от здоровых, другие же, несмотря на неполное восстановле ние, всё же могли выполнять свои функции. При дополни тельном введении аллогенных мезангиобластов собакам, уже получавшим аутогенных клетки, также наблюдалось выздоровление. Таким образом, эти различия нельзя свя зывать со временем начала терапии.
Интересно, что более выраженный эффект был получен при введении именно аллогенных клеток. Можно предполо жить, что если метод будет перенесён в клинику для терапии МД, при Н1_А несовместимости донора и реципиента, паци ент после трансплантации должен подвергаться пожизненной иммуносупрессии. Это, в свою очередь, может приводить к тяжёлым побочным эффектам. Возможно, в будущем удас тся разработать более адекватный метод генетической кор рекции аутогенных клеток. Решением проблемы может стать введение в вектор полноценной копии гена дистрофина. Кроме того, авторами использовался ген человеческого микродистрофина, что могло повлиять на результаты экс перимента.
Несомненно, предложенный метод перспективен, требует дальнейшей разработки и, возможно, клинических испыта ний. Это связано, в частности, с тем, что мезангиобласты могут применяться не только в случаях миопатии Дюшенна, но и при других миодегенеративных заболеваниях. Так, этой же группой авторов было показано, что мезангиобласты могут восстанавливать функцию мышц при некоторых дру гих типах миодистрофий [7]. На данный момент таких за болеваний насчитывается около двадцати. Возможно, именно это направление окажется одним из наиболее пер спективных для применения взрослых стволовых клеток в клинике.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Emery А.Е. The muscular dystrophies. Lancet 2002; 359: 687 95.
2. Dell’Agnola С., Wang Z., Stcrb R. et al. Hematopoietic stem cell transplantation does not restore dystrophin expression in Duchenne muscular dystrophy dogs. Blood 2004; 104(13): 4311 8.
3. Qu Petersen Z., Deasy B., Jankowski R. et al. Identification of a novel population of muscle stem cells in mice: potential for muscle regeneration. J. Cell Biol. 2002; 157:851 64.
4. Minasi M.G., Riminucci М., De Angelis L. et al. The meso angioblast: a
multipotent, self renewing cell that originates from the dorsal aorta and differentiates into most mesodermal tissues. Dev. 2002; 1 29: 2773 83.
5. Galvez B.G., Sampaolesi М., Brunelli S. et al. Complete repair of dystrophic skeletal muscle by mesoangioblasts with enhanced migration ability. J. Cell Biol. 2006; 174: 231 43.
6. Bachrach E, Li S., Perez AL. et al. Systemic delivery of human microdystrophin to regenerating mouse dystrophic muscle by muscle progenitor cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004; 101:3581 6.
7. Cossu G, Sampaolesi M. New therapies for muscular dystrophy: cautious optimism. Trends Mol. Med. 2004; 10: 516 20.
Подготовила A.C. Григорян По материалам: Nature 2006; 444, 574-9
Дендритные клетки, активированные антигенами злокачественных стволовых клеток - технология создания онковакцин нового поколения
В настоящее время проводятся клинические испытания ряда так называемых онковакцин для терапии различных видов солидных новообразований и лейкемии. Одна из ос новных применяемых технологий создания таких вакцин заключается в стимуляции цитотоксических лимфоцитов пациента против определённой опухоли. Этот подход реа лизуется через метод активации дендритных клеток (ДК) in vitro опухолевыми антигенами. Активированные ДК, презен тирующие опухолевый антиген на своей поверхности, взаи модействуют с «наивными» Т лимфоцитами, определяя их дифференцировку в «профессиональные цитотоксические лимфоциты киллеры (ЦТЛ)», миграцию и лизис определён ной опухоли в организме. Более 10ОО онкологических паци ентов, вовлечённых в клинические испытания, получили вак цины на основе ДК. Однако, феномен «ускользания опухоли» от иммунного ответа, часто обусловливающий невысокую
эффективность ряда онковакцин при определённых видах опухолей человека, заставляет исследователей совершен ствовать методики и искать новые подходы к иммунотера пии злокачественных новообразований [1 2]. Создание и действие онковакцины на основе ДК представлено на ри сунке.
В последние годы развивается концепция «злокаче ственных стволовых клеток» (ЗСК) - которые, по видимому, образуются из мутировавших нормальных стволовых клеток взрослых и определяют образование и развитие опухоли (опу холь инициирующие клетки) [3]. Именно существованием не большого пула ЗСК исследователи объясняют неэффектив ность современных химиопрепаратов и возникновение рецидивов после эрадикации опухоли. Таким образом, ЗСК являются новой мишенью для разработки современных ме тодов лечения опухолей.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
А
гттт
■ III
Новости клеточных технологий
Опухолевые 0 / Дендритная антигены ^ 4 / I клетка Р ° / @ I Т-лимфоцит * *V(наивный) V* Цитотоксический В Т-лимфцит (СБ8+) Опухолевые клетки ч ТКР - Т-клеточный рецептор <- 2 ж!} МНС I - молекула главного комплекса ) гистосовместимости I класса " ^
Схема создания онковакцины на основе дендритных клеток
Исследователи из Италии выдвигают новую концепцию создания онковакцин на основе ДК, активированных антиге нами стволовых клеток опухоли. Авторы выдвигают гипотезу о возможности большей эффективности такого рода вакци ны, поскольку ЦТЛ будут прицельно активированы против пула ЗСК.
Новый подход был реализован на модели злокачествен ной глиомы (ЗП самой частой агрессивной злокачественной опухоли головного мозга. Авторам удалось показать, что линия ЗГ мыши (GI^IB) гетерогенна при создании опреде лённых условий культивирования. Так, некоторые клетки, в отличие от стандартного роста линии, не прикреплялись к пластику и формировали нейросферы (GL216 NS). По срав нению со стандартным ростом линии (GL216 АС) клетки этих нейросфер обладали признаками ЗСК особый рост в культуре, способность к дифференцировке в нейрональные клетки всех трех типов, высокая экспрессия нестина, высо коинфильтративный агрессивный рост /п vivo, вызывающий ускоренную гибель животных.
На основе выявленной разницы между нейросферами GL216 NS и стандартными клетками GL216 АС внутри одной линии исследователи создали две вакцины из алло генных дендритных клеток, активированных лизатами этих двух видов злокачественных клеток. Активированные ДК (DC NS, DC АС) вводили троекратно через неделю после интра краниальной пересадки GL216 NS и GL216 АС. Вакцина на
основе ЗСК (DC NS) эффективно защищала животных от возникновения обоих видов опухолей GL216 NS в 60% и GL216 АС в 80%. Однако, вакцина на основе лизата стан дарной линии ЗГ (DC АС) приводила к излечению только у 50% животных с GL216 АС и абсолютно не избавляла от роста опухоли мышей с GL216 NS.
Интересно, что GL216 NS клетки экспрессировали зна чительно более высокий уровень молекул МНС I,II и CD80, CD86, чем GL216 АС, что указывает на большую иммуноген ность первых. Кроме того, обычное введение лизатов обоих видов клеток линии приводило к более значительному ответу у мышей с GL216 AC. Иммуногистохимический анализ по казал более значительную инфильтрацию опухолей ЦТЛ при лечении DC NS вакциной. Спленоциты мышей, иммунизи рованных DC NS, лизировали клетки опухоли обоих типов (GL216 АС и GL216 NS) in vitro, тогда как при иммунизации □С АС приводили к лизису только GL216 АС опухоль.
Таким образом, авторами исследования впервые был предложен совершенно новый подход к созданию онковак цин на основе ДК. Эффективность активации ЦТЛ против мишени злокачественных стволовых клеток оказалась гораздо выше, чем при стандартном подходе. Авторы ис пользовали оригинальную модель линию злокачественной глиомы, позволяющую показать разницу при активации им мунной системы против различных клеточных мишеней в пределах одной опухоли.
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, N° 1, 2007
■ И I II II
■ III
Новости клеточных технологий
Технология создания онковакцин на основе активиро ванных ДК антигенами злокачественных стволовых клеток имеет огромные перспективы и, безусловно, будет разви ваться. У человека уже описано несколько видов ЗСК, ве дётся поиск их уникальных маркёров, которые могут служить
мишенью клеточной, химио и иммунотерапии. Безусловно, перед началом клинических испытаний методика, предло женная итальянскими исследователями, должна быть прове рена на других моделях. Тем не менее, именно такой подход найдёт быстрое клиническое воплощение.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Banchereau J., Palucka AK. Dendritic cells as therapeutic vaccines against cancer. Nat. Rev. Immunol. 2005; 5(4): 296 306.
2. Nestle F.O., Farkas A., Conrad С. Dendritic cell based therapeutic
vaccination against cancer. Curr. Opin. Immunol. 2005; 17(2): 163 9.
3. Dalerba P., Cho R.W., Clarke M.F. Cancer Stem Cells: Model and Concepts. Annu. Rev. Med. 2007; 58: 18.1 18.18.
Подготовил A.B. Берсенев По материалам: Cancer fíes. 2006: 66: 10247-52
Технология получения партеногенетических линий эмбриональных стволовых клеток комбинацией с методом переноса ядра
Партеногенез - это процесс образования эмбриона из яйцеклетки, не оплодотворенной сперматозоидом. У неко торых животных этот процесс наблюдается в природе, но ни один вид млекопитающих не способен размножаться таким образом. Основные причины остановки развития - наруше ние экспрессии генов из за неправильной картины имприн тинга [1]. Геномный импринтинг - одна из форм регуляции генной экспрессии, при которой транскрипция гена зависит от пола особи, от которой был получен аллель этого гена. Данная регуляция осуществляется посредством метилиро вания генов. При импринтинге уровень транскрипции неко торых генов определяется полом организма, от которого эти гены унаследованы. В этом случае вклады отцовского и ма теринского геномов в развитие организмов неодинаковы. Поэтому для нормального развития эмбриона необходим хромосомный материал особей разных полов (2). В экспе риментах на мышах партеногенезом удается получить за родыш из нескольких десятков клеток, очень редко эти эм брионы развиваются дольше [3]. Впрочем, получение партеногенетического клона - не первостепенная задача ученых. Перспектива использования стволовых клеток партеногенетических эмбрионов (parthenogenetic embryonic stem cells - pESC) в терапевтических целях может решить этические проблемы, связанные с получением эмбриональ ных стволовых клеток (ESC ЭСК) и обусловленные созда нием и разрушением эмбриона для их получения. ЭСК, по лученные из партеногенетических эмбрионов, могли бы иметь большое терапевтическое значение, если бы была показана их способность к дифференцировке, так же, как и ЭСК, полученных обычным путём. Однако, применение pESC в медицине пока невозможно, так как у этих клеток наруше ны развитие и способность к дифференцировке. Химерные мыши, полученные при смешении бластомеров нормальных и партеногенетических эмбрионов, задерживались в росте, у них наблюдалось частое образование опухолей [4].
Исследователям из Японии во главе с Takafusa Hikichi удалось повысить жизнеспособность и способность к диф ференцировке pESC мыши с помощью технологии перено са ядра (nuclear transfer - NT). Ядро из pESC было перене
сено в энуклеированный ооцит, затем из него были получе ны новые клетки - NT pESC. Таким образом было получено 84 клеточных линии. Некоторые линии были получены вслед ствие неоднократного переноса ядра. Все эти линии несли маркеры ЭСК и имели нормальный кариотип. Способность к дифференцировке этих клеток была значительно выше, чем у обычных pESC, что показано серией экспериментов in vitro и in vivo - в химерных мышах.
Исследователи использовали две различные линии мы шей для получения pESC, чтобы избежать нарушений раз вития, связанных с вырождением. Одна из этих линий -трансгенная содержала маркёрный белок GFP. Хромосом ный материал одного ооцита был перенесен в другой, затем искусственно было запущено развитие. Таким образом были получены партеногенетические эмбрионы, а затем и линии pESC (рис.). Далее их ядра были перенесены в ооциты мыши другой линии и индуцировано развитие. Полученные таким образом ESC имели нормальный кариотип и экспрессиро вали маркёры плюрипотентности 0ct4, Nanog и другие.
Схема эксперимента Hikichi Т., Wakayama Т. [с изменениями)
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
