CC BY
47
I I I I I I
■ I I I
Новости клеточных технологий
Ученые показали возможность дифференцировки этих клеток in vitro в нервную ткань и мезенхиму. В качестве кон троля использовали две линии ESC, полученные при обычном оплодотворении. Затем, NT pESC были использованы для получения химерных мышей. Органы этих мышей проана лизировали на содержание клеток NT pESC и их дериватов (по маркерному белку). В каждом образце уставливали уро вень метилирования импринтированных доменов, которые оказались гипометилированными по сравнению с нормой. При этом клетки NT pESC химеризовали органы и диффе ренцировались в тканях мышей.
Таким образом, японская группа исследователей показа ла положительное влияние процедуры переноса ядра на по тенциал развития партеногенетических ЭСК. Интересно, что в полученных линиях NT pESC не наблюдали феномена по тери X хромосомы, что обычно бывает при партеногенезе. В данном эксперименте все кариотипические и эпигенети ческие характеристики линий сохранялись, как и у pESC, на протяжении нескольких пассажей (до 30). Кроме того, уровень
успешного образования клеточных линий после переноса ядра партогенетической клетки в ооцит был в полтора два раза выше, чем при получении 1\1Т ЕЭС, когда донором ядра были соматические клетки или нормальные ЕЭС. Причины этого неясны. Можно предположить, что улучшенное разви тие, дифференцировка и жизнеспособность этих клеток яви лись следствием отбора самых лучших клеток для донорства ядра и цитоплазмы, и этот отбор производился неоднократно в течение двух и более переносов генетического материала в ооцит. Возможно также, что здесь наблюдается влияние но вой цитоплазмы ооцита на ядро. В любом случае, положитель ный эффект переноса ядра на жизнеспособность и потенциал развития клеток 1ЧТ рЕБС был подтвержден серией экспе риментов. Причины изменений потенциала развития еще предстоит выяснить. Использование партеногенетических клеток в медицине имеет многообещающие перспективы. Не смотря на генетические нарушения и аномальность развития этих клеток по сравнению с ЕБС, исследования в этой области имеют также и большое фундаментальное значение.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Surani М.А, Barton S.C., Norris M.L. Development of reconstituted mouse eggs suggests imprinting of the genome during gametogenesis. Nature 1984; 308(5959): 548 50.
2. McGrath J., Solter D. Completion of mouse embryogenesis requires both the maternal and paternal genomes. Cell 1984; 37(1): 179 83.
3. Kaufman M.H., Barton S.C., Surani M.A. Normal postimplantation development of mouse parthenogenetic embryos to the forelimb bud stage. Nature 1977; 265(5589): 53 5.
4. Holm T.M., Jackson Grusby L., Brambrink T. et al. Global loss of imprintinq leads to widespread tumoriqenesis in adult mice. Cancer Cell 2005; 8(4): 275 85.
Подготовила Т. Лопатина По материалам: Stem Cells 2007; 25; 1:46-53
Создание гистосовместимых эмбриональных стволовых клеток методом партеногенеза
Генетически совместимые плюрипотентные эмбрио нальные стволовые клетки, созданные методами переноса ядра и/или с помощью партеногенеза (пЭСК), могут являть ся потенциальным источником тканей для трансплантации при различных заболеваниях.
Результатом партеногенеза у многих животных является развитие нормального эмбриона без предварительного оп лодотворения овоцита. Однако грызуны не относятся к таким видам, так как их пренатальное развитие требует экспрес сии генов отцовского генома (пронуклеуса). Ранее сообща лось о получении пЭСК из партеногенетических бластоцист мышей и приматов (1, 2]. При развитии таких животных на блюдалось явление партеногенетического химеризма. У человека такое явление было описано при получении парте ногенетических клеток кожи и гематопоэтической системы [3]. В 2004 году японской группой ТотоЫго Копо впервые была показана возможность рождения жизнеспособного потомства из партеногенетически развитых эмбрионов мыши (4).
Экспериментальный партеногенез у грызунов представ ляет собой остановку деления клеток во второй фазе мейо за, с последующей стимуляцией специальными агентами в присутствии цитохалазина, который предотвращает процесс выброса полярного тельца из ооцита. Таким образом сохра няется диплоидность, и «псевдозигота» может развиться в бластоцисту, из которой и выделяются пЭСК. ПЭСК несут уд воившиеся гаплоидные клетки, то есть они преимущественно
гомозиготны. Ткани, полученные из гомозиготных клеток, будут нести один из двух родительских наборов генов гисто совместимости и, теоретически, они будут предпочтительнее для пересадки, поскольку риск их отторжения будет значи тельно снижен. Однако, у гетерозиготных пациентов МНС гомозиготные ткани могут атаковаться натуральными кил лерами, которые распознают нехватку одного из наборов антигенов гистосовместимости. Этот процесс называется «гибридная устойчивость» и часто проявляется при пересад ке костного мозга. Поэтому идеальным вариантом была бы пересадка генотипированных МНС совместимых клеток.
Американские ученые под руководством G. Daley из Harvard Stem Cell Institute (Harvard University, Boston, USA) разработали метод создания гистосовместимых пЭСК. Уче ным удалось выделить и охарактеризовать плюрипотентные ЭСК, полученные партеногенезом, в которых поддерживалась экспрессия материнских локусов МНС. Ткани, возникшие из таких клеток, могут пересаживаться животным донорской линии без отторжения.
После партеногенетической активации ооцитов мышей и прерывания (остановки) их деления в первой или второй фазе мейоза пЭСК выделяли и генотипировали. Авторы при меняли специально разработанный метод - прямое секве нирование полиморфизмов (SNP генотипирование) для оп ределения линий пЭСК, которые несут последовательности главного комплекса гистосовместимости (МНС) донорского овоцита. Ткани, полученные после дифференцировки таких
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, 1У< 1, 2007
■ И I II II
■тп
Новости клеточных технологий
клеток, были бы способны идеально приживаться после пе ресадки МНС совместимым реципиентам - мышам.
Из 74% стимулированных овоцитов, развившихся до ста дии бластоцисты, исследователи получили 72 линии пЭСК. После проведенного генотипирования полученных линий ока залось, что 33% (24 линии) из них гетерозиготны по генам МНС. Восстановление гетерозиготное™ произошло в процес се рекомбинации. Генотипирование фланкирующих маркеров 17 й хромосомы (которая несет гены главного комплекса гистосовместимости) подтвердило гетерозиготность иссле дуемых локусов уже у 8 линий. Именно эти линии ученые и назвали рекомбинантными МНС совместимыми пЭСК. Эти линии культивировали на желатине в виде эмбриоидных те лец в течение 14 дней, наблюдая за последующей экспрес сией МНС. Все клетки этих линий экспрессировали МНС и имели преимущественно нормальный кариотип.
Для получения генетически идентичных клеток ученые использовали ещё один метод они индуцировали парте ногенетическое деление зрелых ооцитов мышей гибридной линии С57В1_/6ЧСВА Р1, изменяя процесс сегрегации пар ных гомологичных хромосом во время первой метафазы мейоза. При этом получались партеногенетические эмбрио ны, которые являлись клонами донорского овоцита в резуль тате предотвращения сегрегации гомологичных материнских и отцовских хромосом. В этом случае авторы получили 23 линии из 56% активированных ооцитов, а гетерозиготность по генам МНС наблюдалась у 21 линии.
Плюрипотентность полученных пЭСК исследователи под тверждали формированием тератом при пересадке клеток под кожу иммунодефицитным мышам. Кроме того, ученые наблюдали спонтанно сокращающиеся кардиомиоцитарные колонии в культуре, и стандартное розеткообразование на полужидкой среде, характерное для клеток гемопоэтичес кого ряда. При инъекции полученных пЭСК в бластоцисту развивались химерные мыши.
Клетки пересаживали иммунокомпетентным животным после предварительной дифференцировки в культуре, так как недифференцированные ЭСК не экспрессируют моле кул комплекса МНС [6]. Все линии, гетерозиготные и совме стимые с реципиентами по МНС, идеально приживались в организме реципиента без видимых признаков отторжения и образования тератом. Во всех остальных случаях переса док наблюдалось формирование тератом.
Таким образом, в работе продемонстрировали два раз ных способа получения партеногенетических линий мыши ных ЭСК. Полученные обоими путями пЭСК были генетически идентичны (совместимы) по генам МНС с донорским ово цитом. Кроме того, генетический анализ позволил выделить и поддержать линии, несущие материнский генотип МНС.
Способность пЭСК приживаться в организме реципиента и дифференцироваться в клетки трех зародышевых листков не вызывает сомнений, однако влияние потери гетерозигот
ности важнейшими районами генома на функции клетки в таком случае остается мало изученным. Ткани, полученные путем дифференцировки пЭСК и несущие один из двух на боров родительских генов МНС, способны приживаться в тканях гетерозиготных реципиентов (т. е. пЭСК из линии С57В1_/6 приживаются при пересадке мышам гибридной ли нии С57В1_/6ЧСВА Р1). На основе этих экспериментов можно предположить, что пЭСК, гомозиготные по основным гап лотипам МНС, могут служить источником клеток для переса док. Некоторая разница будет наблюдаться лишь в случае с клетками, несущими полный набор МНС на своей поверх ности, например, клетками костного мозга.
Метод получения партеногенетических зародышей мы шей приводит к тому, что эмбрион несет удвоенный гапло идный геном, который ранее описывался как преимуще ственно гомозиготный (кроме тех районов, которые стали гетерозиготными в процессе рекомбинации во время первой фазы мейоза). Результаты этой работы свидетельствуют в пользу того, что большинство локусов в пЭСК претерпевает рекомбинацию, в результате чего они несут почти полное тью гетерозиготный геном. Активация незрелых овоцитов и ингибирование первого мейотического деления способству ют сохранению значительной гетерозиготности в геноме, кроме тех районов, которые возвращаются к гомозигот ности, опять таки, посредством рекомбинации. Оба типа клеток (как полученные в первой, так и во второй фазе мей оза) могут отбираться для поддержания донорского МНС ге нотипа.
Используя методику получения партеногенетических клонов (5), ученые описали 8 линий пЭСК из клеток в первой фазе мейоза, которые демонстрировали полную гетерози готность во всех локусах. Однако все эти клетки были либо тетраплоидны, либо анеуплоидны, то есть, несмотря на то, что они несут весь материнский геном, их нельзя использо вать в качестве источника для трансплантации.
Данные, представленные в работе, доказывают, что рас познавание отдельных паттернов гомо и гетерозиготности в геномах линий ЭСК методом БЫР генотипирования явля ется надежным способом для определения происхождения исследуемых ЭСК, получены ли они партеногенетическим путем, переносом ядра, или естественным оплодотворени ем ооцита.
Таким образом, партеногенез, наряду с получением ЭСК из оплодотворенного овоцита и ЭСК, полученного методом переноса ядра, может стать одним из перспективных спосо бов получения собственных ЭСК. Основное значение работы состоит в демонстрации способа анализа генетической рекомбинации в процессе партеногенетической активации, который позволяет отличить паттерны рекомбинации, полу ченные в результате прерывания кариокинеза во время пер вой или второй стадии мейоза.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Allen N.D., Barton S.C., Hilton K.etal. A functional analysis of imprinting in parthenogenetic embryonic stem cells. Dev. 1994: 120: 1473 82.
2. Cibelli J.B., Grant K.A., Chapman K.B. et al. Parthenogenetic stem cells in nonhuman primates. Science 2002; 295: 819.
3. Strain L., Warner J.P., Johnston T., Bonthron D.T. A human parthenogenetic chimaera. Nat. Genet. 1995; 11: 164 9.
4. Kono T., Obata Y., Wu Q. et al. Birth of parthenogenetic mice that can develop to adulthood. Nature 2004; 428(6985): 8604.
5. Kubiak J., Paldi A., Weber М., Maro B. Genetically identical parthenogenetic mouse embryos produced by inhibition of the first meiotic division by cytochalasin D. Dev. 1991; 111: 763 9.
6. Rideout W.M., Hochedlinger K., Kyba M. et al. Correction of a genetic defect by nuclear transplantation and combined cell and gene therapy. Cell 2002; 109: 17 27.
Подготовила B.C. Мелихова По материалам: Science Express Dec, 14, 2006 DOI: 10,1126/science,1133542
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том II, hl< 1, 2007
