CC BY
59
I I I I I
Ш
Новости клеточных технологий
НОВОСТИ КЛЕТОЧНЫХ ТЕХНОЛОГИИ
КЛЕТОЧНАЯ БИОЛОГИЯ Успешное получение бластоцист человека методом SCNT
Вопрос клонирования животных и человека, несмотря на морально-этические противоречия, находит все больше заинтересованных исследователей. Как правило, официальная цель подобных исследований озвучивается как получение пациент-специфичных линий стволовых клеток, а идея создания истинного клона человека не афишируется. В настоящее время получены клоны целого ряда млекопитающих [1-3], однако исследования в области клонирования человека пока еще малочисленны. Это связано не только с этическими ограничениями, но и с проблемами в оформлении соответствующей документации и разрешений на работу с яйцеклетками человека.
Уже были предприняты первые шаги по созданию эмбрионов человека «альтернативным путем». В частности, воспроизведены ранние стадии эмбриогенеза [до бластоцисты) с использованием в качестве клеток-доноров т. н. «кариопласта», линии эмбриональных стволовых клеток (ЭСК) человека [4], фетальных фибробластов [5]. Однако успешность результатов не была подтверждена методами генного анализа.
Основным методологическим направлением, применяющимся для реализации идеи клонирования, является перенос ядра [nuclear transfer, NT), суть которого состоит в объединении ядра донорской клетки (кариопласта) с цитоплазмой овоцита II деления мейоза (цитопластом). В соответствии с этим протокол NT включает ряд обязательных этапов: энук-леирование овоцита, подготовку донорского ядра, перенос его в цитопласт, а также активацию, инициирующую эмбриональное развитие [6]. Каждый шаг последовательности может быть выполнен с помощью различных методик. Например, введение генетического материала клетки-донора ядра в цитоплазму овоцита II порядка потенциально осуществимо как клеточным слиянием, так и микроинъекцией ядра [7].
В январе 2008 года в он-лайн версии журнала Stem Cells опубликованы материалы исследования A.J. French с соавт. о клонировании человека. В этой работе в качестве источника ядра использовали соматические клетки взрослого человека - фибробласты кожи. Иными словами, эксперимент выполнен посредством метода переноса ядра соматической клетки [somatic cell nuclear transfer, SCNT), который ранее был успешно проведен в работе по клонированию приматов [3].
В исследовании использовались 29 зрелых овоцитов II деления мейоза, энуклеация которых производилась двумя разными способами: экструзией и аспирацией. Первый способ заключается в том, что заостренной стеклянной микропипеткой осуществлялось «выдавливание» ядра через цитоплазматическую мембрану и прозрачную оболочку. Второй способ предполагал экстрагирование тем же инструментом ядросодержащей области цитоплазмы [в 12 случаях -
с первым полярным тельцем). Преимуществ одного метода перед другим выявлено не было.
Отбор фибробластов 3-5-го пассажа производился посредством проточной цитометрии, а также по морфологическому критерию, основанному на данных A.C. Boquest (1999), в соответствии с которыми 95% клеток диаметром 10-15 мкм находятся в оптимальной для использования стадии клеточного цикла - в G1 (или G0) периоде [9]. Нужно отметить, что экспериментальное обоснование зависимости диаметра и фазы клеточного цикла, которое учитывали авторы работы, было показано для фетальных фибробластов. Нормальный диплоидный набор хромосом фибробластов подтверждался цитогенетическим анализом. Интеграция системы «кариопласт-цитопласт» производилась посредством клеточного слияния.
Полученные путем SCNT клетки через 2-3 часа после слияния, а также овоциты II деления мейоза были подвергнуты партеногенетической активации. В первые 24 часа у 7 зигот, полученных посредством SCNT, наблюдались деградация и лизис, однако у 66% клеток через 6-7 часов после химической активации выявлялись процессы ремоделирования ДНК. На третий день из группы SCNT-овоцитов было получено 10 морул, состоящих из 5 и более клеток, а на пя-тый-шестой день определялось 5 бластоцист, количество бластомеров которых находилось в пределах 41-72. Столько же бластоцист исследователи получили партеногенетической активацией овоцитов II деления мейоза, но в их составе насчитывалось порядка 35-54 клеток.
Исходный клеточный материал и бластоцисты были подвергнуты генной дактилоскопии (анализ митохондриальной и ядерной ДНК) с целью установления соответствия последовательностей ДНК бластоцист и донорских клеток, а также выявления возможного «загрязнения» в процессе осуществления технических мероприятий. В двух случаях в каждой группе не удалось показать достоверных данных, касающихся происхождения бластоцист. В остальном, генотип зародышей, полученных посредством SCNT, соответствовал генотипу донорских фибробластов и не включал фрагменты генетического материала овоцитов. Характерно, что вследствие клеточного слияния, наряду с внесением в цитопласт ядра от фибробласта, происходит передача и митохондриальной ДНК соматической клетки. В дальнейшем, по всей видимости, митохондрии, принадлежавшие овоциту замещаются новыми, а митохондриальная ДНК цитопласта подвергается вырождению.
Таким образом, A.J. French с соавт. впервые воспроизвели начальные этапы клонирования человека с использованием метода SCNT. Показав идентичность генома полученных бластоцист и донорских клеток, исследователи не осуществляли детальный хромосомный анализ, нацеленный
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
тттт
Новости клеточных технологий
на выявление возможных хромосомных аббераций, не выявляли уровни экспрессии критических эмбриональных генов,
ЛИТЕРАТУРА:
1. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-6.
2. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J. et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280: 1256-58.
3. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L. et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007; 450 (7169): 497-502.
4. Stojkovic M., Stojkovic P., Leary C. et al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes. Reprod. Biomed. Online 2005; 11: 226-31.
5. Lu C., Lin G., Xie C. et al. Reconstruction of human embryos derived from
таких как Oct 4, Cdx2 и др., то есть не доказали, что клетки были полностью репрограммированы.
somatic cells. Chinese Science Bulletin 2003; 48: 1840-3.
6. Campbell K.H. Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning 1999; 1: 3-15.
7. Wakayama T., Perry A. C., Zuccotti. et al. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-74.
8. French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer (SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells 2008; 26: 485-93.
9. Boquest A.C., Day B.N., Prather R.S. Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells. Biol. Reprod. 1999; 60: 1013-19.
Подготовил И.Я. Бозо
По материалам: French A.J, Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts Development of Human cloned Blastocysts Following
Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) with Adult Fibroblasts. Stem Cells 2008; 26:485-93
Получение мультипотентных клеток из GPR125+ сперматогенных стволовых клеток
Оперматогенез является тонко регулируемым и сложным процессом, в который вовлечено несколько типов клеток. К ним относятся клетки, способные дифференцироваться в гаметы; гормон-секретирующие клетки Лейдига и клетки Сертоли, обеспечивающие регуляцию и дифференцировку клеток полового ряда. Первичные половые клетки, или го-ноциты, имеют внегонадное происхождение. Они обособляются на задней стенке первичной кишки от прочих клеток формирующегося эмбриона и мигрируют в область зачатка половых желез на вентральной стороне мезонефроса. У эмбрионов мужского пола мигрирующие в гонады гоно-циты делятся несколько раз. Тем самым они преобразуются в просперматогонии и создают некоторое число (определенный, но не окончательный пул) стволовых сперматогенных клеток. Затем сперматогенез приостанавливается на этом этапе и возобновляется уже при наступлении полового созревания, когда происходит дифференцировка стволовых клеток в сперматогонии типа А (темная цитоплазма). Они медленно делятся с образованием светлых быстроделящих-ся прогениторных клеток, дающих начало сперматогониям типа В. Последние, в свою очередь, вступают на путь диф-ференцировки в сперматоциты, а далее в сперматиды и сперматозоиды.
Культивирование сперматогенных стволовых/прогени-торных клеток (СпСПК) до последнего времени являлось трудновыполнимой задачей, так как выделенные из протоков извитых семенных канальцев клетки даже на фидерном слое инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов быстро теряют пролиферативную активность [1]. Тем не менее, используя специфический коктейль факторов роста, в состав которого входили glial cell line-derived neurotrophic factor, EGF, bFGF и LIF, T. Shinohara с соавт. (2003) удалось культивировать СпСПК мыши в течение длительного времени [2]. После пятимесячного культивирования трансплантация полученных клеток (germinal stem cells, GS-клетки) бесплодным мышам приводила к восстановлению сперматогенеза. Формирования тератом или каких-либо соматических тканей обнаружено не было, что свидетельствовало
о том, что GS-клетки надежно коммитированы в спермато-генном направлении.
Однако в более позднем исследовании T. Shinohara с соавт. (2004) обнаружили, что после 4-7 недель культивирования GS-клеток, наряду с типичными колониями, выявляются колонии клеток, по своей морфологии сходные с ЭСК [3]. Более того, клетки ЭСК-подобных колоний удалось выделить и размножить при культивировании в среде, содержащей 15% сыворотки плодов коров и LIF, что является стандартным условием культивирования ЭСК. ЭСК-подоб-ные клетки дифференцировались в разные типы соматических клеток при индукции in vitro и формировали тератомы при трансплантации иммунодефицитным мышам. Введение ЭСК-подобных клеток в полость бластоцист приводило к образованию химерных эмбрионов. Наличие в семенниках неонатальных мышей клеток с мультипотентной природой позже было подтверждено немецкой исследовательской группой К. Guan и др. (2006). Полученные при культивировании СпСПК мыши мультипотентные клетки получили обозначение maGSCs (multipotent adult germline stem cells) [4]. Тем не менее, фенотипический профиль специфической субпопуляции сперматогенных клеток, которые могут при культивировании конвертироваться в ЭСК-подобные клетки, остается плохо изученным.
Ранее было показано, что поверхностный белок GPR125, экспрессирующийся в семенниках неонатальных мышей, является потенциальным маркером СпСПК [5]. Группа исследователей под руководством S. Rafii из Медицинского института Говарда Хьюза предположила, что GPR125+ является маркером субпопуляции сперматогенных клеток, конвертирующихся в ЭСК-подобные клетки при длительном культивировании.
На первом этапе исследования, для визуализации экспрессии GPR125 генноинженерными методами были получены мыши, несущие ген LacZ, под контролем GPR125-промо-тора. Окрашивание срезов семенников на наличие галактозидазы показало, что экспрессия маркера обнаруживалась лишь в извитых семенных канальцах и ограничивалась
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
