Научная статья на тему 'Получение мультипотентных клеток из gpr125 сперматогенных стволовых клеток'

Получение мультипотентных клеток из gpr125 сперматогенных стволовых клеток Текст научной статьи по специальности «Биологические науки»

CC BY
149
57
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Журнал
Гены и клетки
Область наук
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Текст научной работы на тему «Получение мультипотентных клеток из gpr125 сперматогенных стволовых клеток»

тттт

на выявление возможных хромосомных аббераций, не выявляли уровни экспрессии критических эмбриональных генов,

ЛИТЕРАТУРА:

1. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-6.

2. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J. et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280: 1256-58.

3. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L. et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007; 450 (7169): 497-502.

4. Stojkovic M., Stojkovic P., Leary C. et al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes. Reprod. Biomed. Online 2005; 11: 226-31.

5. Lu C., Lin G., Xie C. et al. Reconstruction of human embryos derived from

таких как Oct 4, Cdx2 и др., то есть не доказали, что клетки были полностью репрограммированы.

somatic cells. Chinese Science Bulletin 2003; 48: 1840-3.

6. Campbell K.H. Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning 1999; 1: 3-15.

7. Wakayama T., Perry A. C., Zuccotti. et al. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-74.

8. French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer (SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells 2008; 26: 485-93.

9. Boquest A.C., Day B.N., Prather R.S. Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells. Biol. Reprod. 1999; 60: 1013-19.

Подготовил И.Я. Бозо

По материалам: French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts Development of Human cloned Blastocysts Following

Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) with Adult Fibroblasts. Stem Cells 2008; 26:485-93

Получение мультипотентных клеток из GPR125+ сперматогенных стволовых клеток

Оперматогенез является тонко регулируемым и сложным процессом, в который вовлечено несколько типов клеток. К ним относятся клетки, способные дифференцироваться в гаметы; гормон-секретирующие клетки Лейдига и клетки Сертоли, обеспечивающие регуляцию и дифференцировку клеток полового ряда. Первичные половые клетки, или го-ноциты, имеют внегонадное происхождение. Они обособляются на задней стенке первичной кишки от прочих клеток формирующегося эмбриона и мигрируют в область зачатка половых желез на вентральной стороне мезонефроса. У эмбрионов мужского пола мигрирующие в гонады гоно-циты делятся несколько раз. Тем самым они преобразуются в просперматогонии и создают некоторое число (определенный, но не окончательный пул) стволовых сперматогенных клеток. Затем сперматогенез приостанавливается на этом этапе и возобновляется уже при наступлении полового созревания, когда происходит дифференцировка стволовых клеток в сперматогонии типа А (темная цитоплазма). Они медленно делятся с образованием светлых быстроделящих-ся прогениторных клеток, дающих начало сперматогониям типа В. Последние, в свою очередь, вступают на путь диф-ференцировки в сперматоциты, а далее в сперматиды и сперматозоиды.

Культивирование сперматогенных стволовых/прогени-торных клеток (СпСПК) до последнего времени являлось трудновыполнимой задачей, так как выделенные из протоков извитых семенных канальцев клетки даже на фидерном слое инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов быстро теряют пролиферативную активность [1]. Тем не менее, используя специфический коктейль факторов роста, в состав которого входили glial cell line-derived neurotrophic factor, EGF, bFGF и LIF, T. Shinohara с соавт. (2003) удалось культивировать СпСПК мыши в течение длительного времени [2]. После пятимесячного культивирования трансплантация полученных клеток (germinal stem cells, GS-клетки) бесплодным мышам приводила к восстановлению сперматогенеза. Формирования тератом или каких-либо соматических тканей обнаружено не было, что свидетельствовало

о том, что GS-клетки надежно коммитированы в спермато-генном направлении.

Однако в более позднем исследовании T. Shinohara с соавт. (2004) обнаружили, что после 4-7 недель культивирования GS-клеток, наряду с типичными колониями, выявляются колонии клеток, по своей морфологии сходные с ЭСК [3]. Более того, клетки ЭСК-подобных колоний удалось выделить и размножить при культивировании в среде, содержащей 15% сыворотки плодов коров и LIF, что является стандартным условием культивирования ЭСК. ЭСК-подоб-ные клетки дифференцировались в разные типы соматических клеток при индукции in vitro и формировали тератомы при трансплантации иммунодефицитным мышам. Введение ЭСК-подобных клеток в полость бластоцист приводило к образованию химерных эмбрионов. Наличие в семенниках неонатальных мышей клеток с мультипотентной природой позже было подтверждено немецкой исследовательской группой К. Guan и др. (2006). Полученные при культивировании СпСПК мыши мультипотентные клетки получили обозначение maGSCs (multipotent adult germline stem cells) [4]. Тем не менее, фенотипический профиль специфической субпопуляции сперматогенных клеток, которые могут при культивировании конвертироваться в ЭСК-подобные клетки, остается плохо изученным.

Ранее было показано, что поверхностный белок GPR125, экспрессирующийся в семенниках неонатальных мышей, является потенциальным маркером СпСПК [5]. Группа исследователей под руководством S. Rafii из Медицинского института Говарда Хьюза предположила, что GPR125+ является маркером субпопуляции сперматогенных клеток, конвертирующихся в ЭСК-подобные клетки при длительном культивировании.

На первом этапе исследования, для визуализации экспрессии GPR125 генноинженерными методами были получены мыши, несущие ген LacZ, под контролем GPR125-промо-тора. Окрашивание срезов семенников на наличие галактозидазы показало, что экспрессия маркера обнаруживалась лишь в извитых семенных канальцах и ограничивалась

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008

I I I I I

Ш

первым слоем клеток, непосредственно прилегающих к базальной мембране, то есть являвшихся сперматогониями.

Культивирование GPR125+ клеток на обычном слое фидерных клеток оказалось неэффективно. Т огда авторы использовали фидерный слой из инактивированных тестикулярных стромальных клеток, содержащих CD34+ перитубулярные клетки, которые, как ранее было показано, могут играть ключевую роль в экспансии сперматогенных клеток [6].

Культивирование сперматогенных клеток от Gpr125lacZ/lacZ мышей приводило к получению пролиферирующих колоний с экспоненциальной фазой роста. Клетки многократно пассировались и поддерживались в культуре вплоть до года без каких-либо признаков трансформации. На протяжении всего времени культивирования клетки поддерживали постоянный уровень экспрессии GPR125 и не экспрессировали поверхностный маркер с-kit (рис.).

Схема эксперимента

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008

тттт

Молекулярная идентичность GPR125+ СпСПК после долговременного культивирования подтверждалась количественной ПЦР. СпСПК экспрессировали герминальные транскрипционные факторы Dazl, PLZF, Mvh и не экспрессировали транскрипционные факторы, характерные для более поздних стадий дифференцировки сперматогенных прогениторных клеток (Sox17, Tnp1, Adam2, Prm1 и Pgk2). Эти данные свидетельствуют, что репопулирующие СпСПК имели герминальное происхождение и при этом находились в недифференцированном состоянии. Таким образом, авторы создали условия, которые позволили получить долговременную культуру GPR125+ сперматогоний.

На следущем этапе эксперимента изучалась способность GFP+ GPR125lacZ/lacZ СпСПК восстанавливать сперматогенез у обработанных бисульфаном C57Bl6 мышей. На 2-3-й месяц посттрансплантационного периода выявлялось большое количество GFP+ Gpr125lacZ/lacZ колоний герминальных клеток внутри извитых семенных канальцев реципиентов. Клетки этих колоний характеризовались типичной сперма-тогенной морфологией. Окрашивание на наличие галакто-зидазы подтвердило, что небольшая субпопуляция GPR125+ (LacZ+) клеток среди общей массы GFP+ клеток непосредственно контактировала с базальной мембраной.

Как и в исследовании T. Shinohara et al. (2004), после трех месяцев культивирования СпСПК наряду с типичными колониями наблюдалось появление ЭСК-подобных колоний клеток, обозначенных авторами как MACSs (multipotent adult spermatogonial-derived stem cells). MACSs имели более высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение и успешно пролиферировали в среде для культивирования мышиных ЭСК. Абсолютное большинство MACSs после длительного культивирования имели нормальный кариотип без каких-либо цитогенетических аномалий и экспрессировали высокие уровни GPR125 и 0ст4.

Потенции Gpr125lacZ/lacZ MASCs на первом этапе оценивались путем формирования и дифференцировки эмбрио-идных телец in vitro [7]. В течение 7 дней после посева в

формирующихся эмбриоидных тельцах выявлялись разные уровни экспрессии GPR125 с четкими границами между GPR125+ и GPR125- областями. Полностью сформированные колонии содержали HNF3b+ (FOXA2+) клетки, являющиеся производными энто- или эктодермы, цитокератин-позитив-ные или GFAP+ клетки, являющиеся производными эктодермы, и клетки, экспрессирующие миозин скелетных мышц и являющиеся производными мезодермы.

Подкожная трансплантация GPR125lacZ/lacZ MASCs имму-нодефицитным мышам приводила к формированию тератом (в 14 из 14 случаев). Гистологический и иммуногисто-химичекий анализ тератом показал наличие производных всех трех зародышевых листков. Введение GPR125lacZ/lacZ MASCs в полость бластоцист приводило к формированию химерных эмбрионов с эффективностью 22% (8 эмбрионов из 37 бластоцист).

Анализ экспрессии транскрипционных факторов GPR125lacZ/lacZ MASCs в сравнении с ЭСК, СпСПК и мышиными эмбриональными фибробластами показал высокий уровень экспрессии Oct4, Nanog и Sox2 в MASCs и ЭСК. Минимальная экспрессия типичных маркеров сперматогенных стволовых клеток, Plzf, Ret и Stra8, наблюдалась у MASCs, тогда как высокая степень экспрессии этих факторов, как и ожидалось, обнаруживалась у СпСПК. Удивительно, что некоторые герминально-ассоциированные факторы транскрипции (например, Dazl) практически не экспрессировались в MASCs, как и некоторые типичные факторы транскрипции ЭСК (Gdf3, Esg1, Rex1). Различия в экспрессии этих генов свидетельствуют, что MASCs являются отдельным типом стволовых клеток.

Таким образом, авторы исследования охарактеризовали GPR125 как поверхностный клеточный маркер, характеризующий популяцию самообновляющихся c-kit-PLZF+ СпСПК, которые способны восстанавливать сперматогенез при трансплантации мышам и конвертироваться в GPR125+ MASCs при длительном культивировании. Полученные данные позволяют утверждать, что GPR125+сперматоген-ные клетки являются клетками-предшественниками MASCs.

ЛИТЕРАТУРА:

1. Nagano M., Ryu B.Y., Brinster C.J. et al. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 2003; 68: 2207-14.

2. Kanatsu-Shinohara M., Ogonuki N., Inoue K. et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 2003; 69: 612-16.

3. Kanatsu-Shinohara M., Inoue K., Lee J. et al. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 2004; 119: 1001-12.

4. Guan K., Nayernia K., Maier L.S. et al. Pluripotency of spermatogonial stem

cells from adult mouse testis. Nature 2006; 440: 1199-203.

5. Valenzuela D.M., Murphy A.J., Frendewey D. et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnol. 2003; 21: 652-9.

6. Kuroda N., Nakayama H., Miyazaki E. et al. Distribution and role of CD34-positive stromal cells and myofibroblasts in human normal testicular stroma. Histol. Histopathol. 2004; 19: 743-51.

7. Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 2005; 19: 1129-55.

Подготовили: C.A. Сергеев, Ю.Б. Дьякова По материалам: Seande M, James D., Shmelkov S. et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR1251 germline progenitors. Nature 2007; 449: 346-52

Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008

A

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.