CC BY
51
тттт
на выявление возможных хромосомных аббераций, не выявляли уровни экспрессии критических эмбриональных генов,
ЛИТЕРАТУРА:
1. Campbell K.H., McWhir J., Ritchie W.A., Wilmut I. Sheep cloned by nuclear transfer from a cultured cell line. Nature 1996; 380: 64-6.
2. Cibelli J.B., Stice S.L., Golueke P.J. et al. Cloned transgenic calves produced from nonquiescent fetal fibroblasts. Science 1998; 280: 1256-58.
3. Byrne J.A., Pedersen D.A., Clepper L.L. et al. Producing primate embryonic stem cells by somatic cell nuclear transfer. Nature 2007; 450 (7169): 497-502.
4. Stojkovic M., Stojkovic P., Leary C. et al. Derivation of a human blastocyst after heterologous nuclear transfer to donated oocytes. Reprod. Biomed. Online 2005; 11: 226-31.
5. Lu C., Lin G., Xie C. et al. Reconstruction of human embryos derived from
таких как Oct 4, Cdx2 и др., то есть не доказали, что клетки были полностью репрограммированы.
somatic cells. Chinese Science Bulletin 2003; 48: 1840-3.
6. Campbell K.H. Nuclear equivalence, nuclear transfer, and the cell cycle. Cloning 1999; 1: 3-15.
7. Wakayama T., Perry A. C., Zuccotti. et al. Full-term development of mice from enucleated oocytes injected with cumulus cell nuclei. Nature 1998; 394: 369-74.
8. French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts development of human cloned blastocysts following somatic cell nuclear transfer (SCNT) with adult fibroblasts. Stem Cells 2008; 26: 485-93.
9. Boquest A.C., Day B.N., Prather R.S. Flow cytometric cell cycle analysis of cultured porcine fetal fibroblast cells. Biol. Reprod. 1999; 60: 1013-19.
Подготовил И.Я. Бозо
По материалам: French A.J., Adams C.A., Anderson L.S. Fibroblasts Development of Human cloned Blastocysts Following
Somatic Cell Nuclear Transfer (SCNT) with Adult Fibroblasts. Stem Cells 2008; 26:485-93
Получение мультипотентных клеток из GPR125+ сперматогенных стволовых клеток
Оперматогенез является тонко регулируемым и сложным процессом, в который вовлечено несколько типов клеток. К ним относятся клетки, способные дифференцироваться в гаметы; гормон-секретирующие клетки Лейдига и клетки Сертоли, обеспечивающие регуляцию и дифференцировку клеток полового ряда. Первичные половые клетки, или го-ноциты, имеют внегонадное происхождение. Они обособляются на задней стенке первичной кишки от прочих клеток формирующегося эмбриона и мигрируют в область зачатка половых желез на вентральной стороне мезонефроса. У эмбрионов мужского пола мигрирующие в гонады гоно-циты делятся несколько раз. Тем самым они преобразуются в просперматогонии и создают некоторое число (определенный, но не окончательный пул) стволовых сперматогенных клеток. Затем сперматогенез приостанавливается на этом этапе и возобновляется уже при наступлении полового созревания, когда происходит дифференцировка стволовых клеток в сперматогонии типа А (темная цитоплазма). Они медленно делятся с образованием светлых быстроделящих-ся прогениторных клеток, дающих начало сперматогониям типа В. Последние, в свою очередь, вступают на путь диф-ференцировки в сперматоциты, а далее в сперматиды и сперматозоиды.
Культивирование сперматогенных стволовых/прогени-торных клеток (СпСПК) до последнего времени являлось трудновыполнимой задачей, так как выделенные из протоков извитых семенных канальцев клетки даже на фидерном слое инактивированных мышиных эмбриональных фибробластов быстро теряют пролиферативную активность [1]. Тем не менее, используя специфический коктейль факторов роста, в состав которого входили glial cell line-derived neurotrophic factor, EGF, bFGF и LIF, T. Shinohara с соавт. (2003) удалось культивировать СпСПК мыши в течение длительного времени [2]. После пятимесячного культивирования трансплантация полученных клеток (germinal stem cells, GS-клетки) бесплодным мышам приводила к восстановлению сперматогенеза. Формирования тератом или каких-либо соматических тканей обнаружено не было, что свидетельствовало
о том, что GS-клетки надежно коммитированы в спермато-генном направлении.
Однако в более позднем исследовании T. Shinohara с соавт. (2004) обнаружили, что после 4-7 недель культивирования GS-клеток, наряду с типичными колониями, выявляются колонии клеток, по своей морфологии сходные с ЭСК [3]. Более того, клетки ЭСК-подобных колоний удалось выделить и размножить при культивировании в среде, содержащей 15% сыворотки плодов коров и LIF, что является стандартным условием культивирования ЭСК. ЭСК-подоб-ные клетки дифференцировались в разные типы соматических клеток при индукции in vitro и формировали тератомы при трансплантации иммунодефицитным мышам. Введение ЭСК-подобных клеток в полость бластоцист приводило к образованию химерных эмбрионов. Наличие в семенниках неонатальных мышей клеток с мультипотентной природой позже было подтверждено немецкой исследовательской группой К. Guan и др. (2006). Полученные при культивировании СпСПК мыши мультипотентные клетки получили обозначение maGSCs (multipotent adult germline stem cells) [4]. Тем не менее, фенотипический профиль специфической субпопуляции сперматогенных клеток, которые могут при культивировании конвертироваться в ЭСК-подобные клетки, остается плохо изученным.
Ранее было показано, что поверхностный белок GPR125, экспрессирующийся в семенниках неонатальных мышей, является потенциальным маркером СпСПК [5]. Группа исследователей под руководством S. Rafii из Медицинского института Говарда Хьюза предположила, что GPR125+ является маркером субпопуляции сперматогенных клеток, конвертирующихся в ЭСК-подобные клетки при длительном культивировании.
На первом этапе исследования, для визуализации экспрессии GPR125 генноинженерными методами были получены мыши, несущие ген LacZ, под контролем GPR125-промо-тора. Окрашивание срезов семенников на наличие галактозидазы показало, что экспрессия маркера обнаруживалась лишь в извитых семенных канальцах и ограничивалась
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
I I I I I
Ш
первым слоем клеток, непосредственно прилегающих к базальной мембране, то есть являвшихся сперматогониями.
Культивирование GPR125+ клеток на обычном слое фидерных клеток оказалось неэффективно. Т огда авторы использовали фидерный слой из инактивированных тестикулярных стромальных клеток, содержащих CD34+ перитубулярные клетки, которые, как ранее было показано, могут играть ключевую роль в экспансии сперматогенных клеток [6].
Культивирование сперматогенных клеток от Gpr125lacZ/lacZ мышей приводило к получению пролиферирующих колоний с экспоненциальной фазой роста. Клетки многократно пассировались и поддерживались в культуре вплоть до года без каких-либо признаков трансформации. На протяжении всего времени культивирования клетки поддерживали постоянный уровень экспрессии GPR125 и не экспрессировали поверхностный маркер с-kit (рис.).
Схема эксперимента
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
тттт
Молекулярная идентичность GPR125+ СпСПК после долговременного культивирования подтверждалась количественной ПЦР. СпСПК экспрессировали герминальные транскрипционные факторы Dazl, PLZF, Mvh и не экспрессировали транскрипционные факторы, характерные для более поздних стадий дифференцировки сперматогенных прогениторных клеток (Sox17, Tnp1, Adam2, Prm1 и Pgk2). Эти данные свидетельствуют, что репопулирующие СпСПК имели герминальное происхождение и при этом находились в недифференцированном состоянии. Таким образом, авторы создали условия, которые позволили получить долговременную культуру GPR125+ сперматогоний.
На следущем этапе эксперимента изучалась способность GFP+ GPR125lacZ/lacZ СпСПК восстанавливать сперматогенез у обработанных бисульфаном C57Bl6 мышей. На 2-3-й месяц посттрансплантационного периода выявлялось большое количество GFP+ Gpr125lacZ/lacZ колоний герминальных клеток внутри извитых семенных канальцев реципиентов. Клетки этих колоний характеризовались типичной сперма-тогенной морфологией. Окрашивание на наличие галакто-зидазы подтвердило, что небольшая субпопуляция GPR125+ (LacZ+) клеток среди общей массы GFP+ клеток непосредственно контактировала с базальной мембраной.
Как и в исследовании T. Shinohara et al. (2004), после трех месяцев культивирования СпСПК наряду с типичными колониями наблюдалось появление ЭСК-подобных колоний клеток, обозначенных авторами как MACSs (multipotent adult spermatogonial-derived stem cells). MACSs имели более высокое ядерно-цитоплазматическое соотношение и успешно пролиферировали в среде для культивирования мышиных ЭСК. Абсолютное большинство MACSs после длительного культивирования имели нормальный кариотип без каких-либо цитогенетических аномалий и экспрессировали высокие уровни GPR125 и 0ст4.
Потенции Gpr125lacZ/lacZ MASCs на первом этапе оценивались путем формирования и дифференцировки эмбрио-идных телец in vitro [7]. В течение 7 дней после посева в
формирующихся эмбриоидных тельцах выявлялись разные уровни экспрессии GPR125 с четкими границами между GPR125+ и GPR125- областями. Полностью сформированные колонии содержали HNF3b+ (FOXA2+) клетки, являющиеся производными энто- или эктодермы, цитокератин-позитив-ные или GFAP+ клетки, являющиеся производными эктодермы, и клетки, экспрессирующие миозин скелетных мышц и являющиеся производными мезодермы.
Подкожная трансплантация GPR125lacZ/lacZ MASCs имму-нодефицитным мышам приводила к формированию тератом (в 14 из 14 случаев). Гистологический и иммуногисто-химичекий анализ тератом показал наличие производных всех трех зародышевых листков. Введение GPR125lacZ/lacZ MASCs в полость бластоцист приводило к формированию химерных эмбрионов с эффективностью 22% (8 эмбрионов из 37 бластоцист).
Анализ экспрессии транскрипционных факторов GPR125lacZ/lacZ MASCs в сравнении с ЭСК, СпСПК и мышиными эмбриональными фибробластами показал высокий уровень экспрессии Oct4, Nanog и Sox2 в MASCs и ЭСК. Минимальная экспрессия типичных маркеров сперматогенных стволовых клеток, Plzf, Ret и Stra8, наблюдалась у MASCs, тогда как высокая степень экспрессии этих факторов, как и ожидалось, обнаруживалась у СпСПК. Удивительно, что некоторые герминально-ассоциированные факторы транскрипции (например, Dazl) практически не экспрессировались в MASCs, как и некоторые типичные факторы транскрипции ЭСК (Gdf3, Esg1, Rex1). Различия в экспрессии этих генов свидетельствуют, что MASCs являются отдельным типом стволовых клеток.
Таким образом, авторы исследования охарактеризовали GPR125 как поверхностный клеточный маркер, характеризующий популяцию самообновляющихся c-kit-PLZF+ СпСПК, которые способны восстанавливать сперматогенез при трансплантации мышам и конвертироваться в GPR125+ MASCs при длительном культивировании. Полученные данные позволяют утверждать, что GPR125+сперматоген-ные клетки являются клетками-предшественниками MASCs.
ЛИТЕРАТУРА:
1. Nagano M., Ryu B.Y., Brinster C.J. et al. Maintenance of mouse male germ line stem cells in vitro. Biol. Reprod. 2003; 68: 2207-14.
2. Kanatsu-Shinohara M., Ogonuki N., Inoue K. et al. Long-term proliferation in culture and germline transmission of mouse male germline stem cells. Biol. Reprod. 2003; 69: 612-16.
3. Kanatsu-Shinohara M., Inoue K., Lee J. et al. Generation of pluripotent stem cells from neonatal mouse testis. Cell 2004; 119: 1001-12.
4. Guan K., Nayernia K., Maier L.S. et al. Pluripotency of spermatogonial stem
cells from adult mouse testis. Nature 2006; 440: 1199-203.
5. Valenzuela D.M., Murphy A.J., Frendewey D. et al. High-throughput engineering of the mouse genome coupled with high-resolution expression analysis. Nature Biotechnol. 2003; 21: 652-9.
6. Kuroda N., Nakayama H., Miyazaki E. et al. Distribution and role of CD34-positive stromal cells and myofibroblasts in human normal testicular stroma. Histol. Histopathol. 2004; 19: 743-51.
7. Keller G. Embryonic stem cell differentiation: emergence of a new era in biology and medicine. Genes Dev. 2005; 19: 1129-55.
Подготовили: C.A. Сергеев, Ю.Б. Дьякова По материалам: Seande M, James D., Shmelkov S. et al. Generation of functional multipotent adult stem cells from GPR1251 germline progenitors. Nature 2007; 449: 346-52
Клеточная трансплантология и тканевая инженерия Том III, № 2, 2008
A
