CC BY
57
DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11105 УДК 631.575.1:633.18
технология массового скрининга риса на наличие генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2 и Pi-33 на основе мультиплексного микросателлитного анализа*
и. А. Шилов1, доктор биологических наук,
профессор ран, заведующий лабораторией
(e-mail: ishilov@rambler.ru)
Ю. в. АниСкинА1, кандидат биологических
наук, ^арший научный сотрудник
н. С. вЕлиШАЕвА1, кандидат биологических
наук, ^арший научный сотрудник
о. С. колоБовА1, ^арший научный сотрудник
т. в. Шалаева1, стажер-исследователь
П. н. коСтылЕв2, доктор
сельскохозяйственных наук, профессор,
заведующий лабораторией (e-mail:
p-kostylev@mail.ru)
Е. в. дУБинА3, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: lenakrug1@rambler.ru)
всероссийский институт сельскохозяйственной биотехнологии, ул. Тимирязевская, 42, Москва, 127550, Российская Федерация 2Аграрный научный центр «Донской», пос. Научный городок, 3, Зерноград, 347740, Российская Федерация
3Всероссийский научно-исследовательский институт риса, пос. Белозерный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация
Резюме. Исследования проводили с целью разработки технологии мультилокусного микросателлитного анализа для широкомасштабного скрининга селекционных образцов риса на наличие трех генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33. Предложенная система мультиплексного ПЦР-анализа сцепленных с соответствующими генами устойчивости микросателлитных локусов Rm224 (Pi-1), Rm527 (Pi-2) и Rm72 и Rm310 (Pi-33) позволяет анализировать образцы одновременно на наличие трех генов устойчивости и тем самым сокращать сроки генетического анализа и затраты на его выполнение. Длину полученных ПЦР-фрагментов определяли по результатам разделения электрофорезом высокого разрешения в автоматическом генетическом анализаторе «Нанофор-05» с использованием технологии флуоресцентной детекции. Такой подход позволил определить длину исследуемых микросателлитных фрагментов с точностью до одного нуклеотида. В результате генетического анализа линий-доноров устойчивости экспериментально установлены точные длины микросателлитных маркеров, определяющих наличие соответствующих генов устойчивости к пирикуляриозу: фрагмент локуса Rm224 длиной 137 п.н., выявленный у линии-донора гена Pi-1 C104-Lac; фрагмент локуса Rm527 длиной 239 п.н., выявленный у линии-донора гена Pi-2 C101-A-51; фрагменты 165 п.н. локуса Rm72 и 95 п.н. локуса Rm310, выявленные у линии-донора гена Pi-33 C101-Lac. Эти донорные линии в дальнейшем были задействованы в качестве положительных контролей при исследовании селекционных образцов риса. Генетический анализ 1200 селекционных образцов риса, проведенный с использованием разработанной технологии, позволил выявить растения с маркерами генов устойчиво-
сти Pi-1, Pi-2 и Pi-33 в гетерозиготном и гомозиготном состоянии. Предлагаемая технология может быть внедрена в практику маркер-вспомогательной селекции риса, поскольку проведение анализа в формате 96-луночного планшета может быть автоматизировано, что повышает точность, а также позволяет проводить широкомасштабный скрининг на наличие генов устойчивости к пирикуляриозу. Ключевые слова: рис (Oryza sativa L.), устойчивость к пирикуляриозу, донор, гены Pi-1, Pi-2, Pi-33, селекция с помощью маркеров, микросателлитные маркеры, мультиплексный ПЦР-анализ, анализ фрагментов ДНК. Для цитирования: Технология массового скрининга риса на наличие генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2 и Pi-33 на основе мультиплексного микросателлитного анализа / И. А. Шилов, Ю. В. Анискина, Н. С. Велишаева и др. // Достижения науки и техники АПК. 2018. Т. 32. № 11. С. 21-25. DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11105.
Пирикуляриоз, вызываемый патогеном Pyricularia oryzae Cav. (Magnaporthe grisea (Herbert) Barr), - серьезное заболевание риса (Oryza sativa L.), распространенное во всех регионах рисосеяния. Поражение посевов пирикуляриозом может приводить к значительному сокращению урожая (до 45...100 %) [1].
Эффективный способ защиты растений от поражения патогеном - создание сортов с генами устойчивости к заболеванию. Наиболее эффективная стратегия его реализации - пирамидирование, которое предусматривает создание хозяйственно-ценных сортов, обладающих комбинацией из нескольких генов устойчивости [2]. Их совместное действие способствует увеличению и расширению спектра устойчивости к пирикуляриозу, а также обеспечивает более длительную устойчивость к патогену, по сравнению с линиями, имеющими отдельные гены устойчивости [3, 4]. На сегодняшний день известно около 100 генов устойчивости к пирикуляриозу, многие из которых клонированы и картированы, и могут быть использованы в маркерной селекции риса [5].
Селекция с использованием ДНК-маркеров (marker assisted selection - MAS) - мощный инструмент для пирамидирования двух или более генов устойчивости к пирикуляриозу [6, 7, 8]. Преимущество этого подхода перед классическими методами селекции на основе фенотипического отбора заключается в возможности контролировать наличие в одном растении нескольких генов устойчивости, фенотипические эффекты которых маскируют один другой [9]. Использование молекулярных маркеров позволяет значительно ускорить процесс создания устойчивых сортов.
Большинство генов устойчивости к пирикуляриозу, идентифицированных у риса, обеспечивают резистентность растений к ограниченному числу рас
* Работа выполнена в рамках государственного задания по теме «Разработка технологий нового поколения для масштабного генетического анализа растительных форм сельскохозяйственных культур с целью ускорения селекционного процесса» (проект № 0574-2018-0007).
Таблица 1. Анализируемые комбинации скрещивания риса
№ п/п Комбинация скрещивания
1 (^-58 х Кубояр 3) х (Аметист * Мороберекан) X Pi-1+2+33, Ил.14
2 Рм+2+33, рыхлая метелка X Pi-1+33+ta+b (1225)
3 РМ+2+33 гомо, №5 X Боярин
4 РМ+2+33 гомо, №5 X Кубояр
5 РМ+2+33 гомо, Ил.14 X Кубояр
6 Pi-1+2+33+ta+b (5 генов гомо) 1396 X П40 (2-1-24-4-B)
7 Pi-1+2+33+ta+b (5 генов гомо) 1396 X П40 (1-1-1-5-B)
8 Pi-1+2+33+ta+b (5 генов гомо) 1396 X Магнат (К-100)
9 Pi-1+2+33+ta+b (5 генов гомо) 1396 X Кубояр
10 Дон 8765, устойчив к пирикулярии X Магнат (К-100)
11 Дон 8765, устойчив к пирикулярии X Магнат (К-121)
12 Компактная метелка, крупное зерно X Магнат (8925)
13 Магнат (К-100) X Кубояр
14 Нейтрон X Магнат (8925)
15 П40 (1-1-1-5-В) X Кубояр
патогена. Тем не менее установлено, что гены устойчивости риса к пирикуляриозу РМ, Ри2, Ри33 детерминируют устойчивость широкого спектра и поэтому служат важным ресурсом для селекции [10].
Микросателлитные маркеры, тесно сцепленные с генами РМ, Ри2, Ри33 были выявлены на генетическом материале линий С104^ас, С101-А-51, С101^ас соответственно, которые сейчас эффективно используют в селекции в качестве доноров устойчивости [11, 12, 13]. Микросателлитные маркеры характеризуются кодоминантным типом наследования, что позволяет получить представление о гомозиготном или гетерозиготном состоянии генов устойчивости. Тесное сцепление между геном и маркером обеспечивает минимальное генетическое расстояние между ними, что служит необходимым условием успешной селекции с использованием маркеров. Для правильной интерпретации аллельного состояния соответствующего гена устойчивости ключевое значение имеет точность определения длины маркерных фрагментов.
Ранее уже была показана эффективность используемых микросателлитных маркеров при определении генов устойчивости к пирикуляриозу РМ, Ри2 и Ри33. Однако в этих исследованиях анализ каждого гена осуществляли отдельно по соответствующему микроса-теллитному локусу и для анализа длин микросателлитных фрагментов применяли электрофорез в 3 %-ном агарозном геле или в 8 %-ном полиакриламидном геле [14, 15, 16]. Такие подходы не обладают достаточной разрешающей способностью для определения точной длины фрагмента, что может привести к ошибкам и негативно отразиться на селекционном процессе.
При создании пирамидированных линий для повышения эффективности отбора селекционных форм риса, содержащих необходимые гены устойчивости к пирикуляриозу, требуется широкомасштабный анализ растений (500...1000 образцов) на наличие каждого гена устойчивости. Однако существующие подходы достаточно продолжительны, трудоемки и нетехнологичны, поскольку их сложно автоматизировать.
Цель наших исследований - разработка технологии широкомасштабного скрининга селекционных форм риса на наличие трех генов устойчивости к пирикуляриозу (РМ, Ри2, Ри33) на основе мультиплексной ПЦР в 96-луночном планшете и последующей флуоресцентной детекцией ПЦР-фрагментов посредством капиллярного электрофореза, которая позволит повысить эффективность селекции и значительно ускорить процесс создания устойчивых сортов риса.
Условия, материалы и методы. Для анализа использовали линии риса, созданные в ФГБНУ «Аграрный научный центр «Донской»» (г. Зерноград, Ростовская область) в результате скрещивания отечественных сортов с зарубежными донорами устойчивости (табл. 1). Положительные контроли - линии-доноры исследуемых генов устойчивости C104-Lac (ген Pi-1), C101-A-51 (ген Pi-2), C101-Lac подвида Indica (ген Pi-33), отрицательный контроль - сорт Боярин, у которого отсутствуют аллели, определяющие устойчивость по перечисленным генам.
Для определения аллельного состояния по генам устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2 и Pi-33 было отобрано и проанализировано около 1200 растений.
Геномную ДНК выделяли из зеленых листьев двухнедельных проростков методом экстракции с использованием цетилтриметиламмоний бромида (CTAB) и хлороформа [17]. Растительные образцы растирали в фарфоровых ступках с жидким азотом, добавляли по 500 мкл экстракционного буфера (100 мМ трис-HCl, pH 8,0 (Sigma, США); 1,4 М NaCl (Sigma); 20 мМ ЭДТА (Sigma); 2 % СТАВ (Sigma), переносили в пластиковые пробирки вместимостью 1,5 мл и инкубировали при 65 oC в течение 60 мин. Далее добавляли 500 мкл хлороформа («Реахим», Россия), перемешивали и центрифугировали при 15 000 g в течение 5 мин. Верхнюю фазу переносили в пробирки с 50 мкл 10 % СТАВ-буфера (10 % СТАВ, 0,7 М NaCl), перемешивали и инкубировали 10 мин при 60 oC. Затем добавляли 500 мкл хлороформа, перемешивали и центрифугировали при 15 000 g в течение 5 мин. Верхнюю фазу переносили в пробирки с 30 мкл 5 М CH3COOK (AppliChem, США), добавляли 1 мл 96 %-ного этилового спирта, перемешивали и инкубировали при -20 oC в течение 60 мин. После этого пробы центрифугировали при 15 000 g 10 мин, осадок промывали в 200 мкл 75 %-ного этилового спирта, сушили и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера (производитель трис-HCl и ЭДТА - Sigma).
Для выявления генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 исследовали полиморфизм сцепленных с ними микросателлитных локусов [5]. Наличие гена устойчивости Pi-1 определяли по локусу Rm224, Pi-2 - по локусу Rm527, Pi-33 - по локусам Rm72 и Rm310 (табл. 2). Нуклеотидные последовательности праймерных пар для анализа микросателлитных локусов доступны на сайте gramene.com.
Амплификацию растительной ДНК со специфичными праймерами проводили в реакционной смеси
Таблица 2. Микросателлитные локусы для анализа генов устойчивости Ri-1, Pi-2, Pi-33.
R-ген Донор Хромосома Локус Последовательности праймеров, 5 ^ 3'
Pi-1 C104-Lac 11 Rm224 F: ATCGATCGATCTTCACGAGG
R: GTTTCTTGCTATAAAAGGCATTCGGG
Pi-2 C101-A-51 6 Rm527 F: GGCTCGATCTAGAAAATCCG
R: GTTTCTTTGCACAGGTTGCGATAGAG
Pi-33 C101-Lac 8 Rm72 F: CCGGCGATAAAACAATGAG
R: GTTTCTGCATCGGTCCTAACTAAGGG
Rm310 F: CCAAAACATTTAAAATATCATG
R: GTTTCTGCTTGTTGGTCATTACCATTC
объемом 25 мкл следующего состава: 67 мМ трис-HCl, pH 8,8; 16,6 мМ (NH4)2SO4 (AppliChem); 2,5 мМ MgCl2 (AppliChem); 5 ед/мкл Taq-ДНК-полимеразы («ДНК-Технология», Россия), 25 мМ dNTP («Медиген», Россия), 5...10 пмоль каждого праймера в зависимости от уровня флуоресценции («Синтол», Россия) и 2 мкл раствора ДНК. Амплификацию осуществляли в термоциклере (CFX-96 Bio-Rad, США) по следующей программе: 1) 95 oC - 5 мин; 2) 30 циклов: 94 oC - 30 с, 55 oC - 30 с, 72 oC - 30 с; 3) 72 oC - 5 мин. Наличие продуктов амплификации подтверждали путем электрофореза в 2 %-ном агарозном геле с окрашиванием бромистым этидием (Helicon, Россия).
Анализ флуоресцентно-меченых ПЦР-фрагментов проводили на базе ЦКП «Биотехнология» ВНИИСБ методом высокоразрешающего электрофореза в денатурирующих условиях с использованием генетического анализатора Нанофор-05 («Синтол», ФГБНУ ИАП, Россия), согласно инструкции к прибору. Для анализа длин фрагментов 1 мкл ПЦР-продукта смешивали с 1 мкл маркера молекулярной массы S-450 («Синтол») и 8 мкл формамида Super DI (MCLab, США), после чего проводили денатурацию фрагментов в течение 5 мин при 95 oC.
Размер ПЦР-фрагментов устанавливали с помощью программного обеспечения «ДНК Фрагментный анализ» (ФГБНУ ИАП РАН, Россия).
результаты и обсуждение. Для широкомасштабного исследования селекционных образцов риса на наличие генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, сцепленных с соответствующими генами устойчивости микросателлитных локусов Rm224 (Pi-1), Rm527 (Pi-2) и Rm72 и Rm310 (Pi-33), была разработана система мультиплексного ПЦР-анализа в 96-луночном планшете. Такой подход позволяет проанализировать каждый образец ДНК одновременно по четырем микросателлитным локусам. Амплификация каждого микросателлитного локуса осуществляется со специфичными праймерами, один из которых мечен определенным флуоресцентным красителем (FAM, R6G, TAMRA или ROX), что позволяет анализировать ПЦР-фрагменты отдельно по соответствующему каналу детекции (табл. 3). Длина полученных ПЦР-фрагментов определяется с точностью до одного нуклеотида в результате разделения электрофорезом высокого разрешения в капиллярах на автоматическом генетическом анали-
заторе Нанофор-05, с использованием технологии флуоресцентной детекции.
На оцифрованных генетических профилях образцов риса, полученных с использованием разработанной мультиплексной системы, каждый пик представляет собой ПЦР-фрагмент определенной длины. Цвет пика соответствует каналу детекции и определяет принадлежность фрагмента к тому или иному локусу: FAM (синий) - локус Rm224, R6G (зеленый) - Rm527, TAMRA (черный) - Rm72, ROX (красный) - Rm310.
Для подтверждения наличия гена устойчивости необходимо контролировать наличие сцепленного с ним маркерного фрагмента определенной длины. Поэтому был проведен генетический анализ линий-доноров исследуемых генов устойчивости и экспериментально установлены точные длины микросателлитных маркеров наличия генов устойчивости к пирикуляриозу. Так, в качестве маркера наличия гена устойчивости РМ был принят фрагмент длиной 137 п.н., выявленный в локусе Rm224 у линии-донора гена РМ С104^ас; маркером наличия гена устойчивости Ри2 - фрагмент длиной 239 п.н., выявленный в локусе Rm527 у линии-донора гена Ри2 С101 -А-51; маркерами наличия гена устойчивости Ри33 - фрагменты длиной 95 п.н. и 165 п.н., выявленные в локусах Rm310 и Rm72 соответственно у линии-донора гена Ри33 С101^ас. Эти донорные линии использовали в дальнейшем в качестве положительных контролей. Таким образом, были определены точные генетические характеристики микросателлитных маркеров, на которые необходимо ориентироваться для выявления генов устойчивости при анализе предоставленных селекционных образцов риса.
В результате анализа селекционных образцов риса было установлено, что исследуемые микросателлитные локусы представлены не двумя аллельными вариантами, соответствующими наличию / отсутствию гена устойчивости к пирикуляриозу, как изначально предполагали, а 4...5 ПЦР-фрагментами разной длины, отдельные из которых различаются всего на 2 нуклеотида (см. табл. 3).
Поскольку аллельное состояние гена устойчивости определяется косвенно по длине сцепленного с ним микросателлитного локуса, точность определения длины микросателитных фрагментов имеет ключевое значение для правильной интерпретации наличия или отсутствия соответствующего гена устойчивости.
Локус Краситель R-ген Донор Маркер, выявленный у донора R-гена, п.н. Аллели, выявленные у исследуемых образцов, п.н.
Rm224 FAM Pi-1 C104-Lac 137 125, 137, 147, 161
Rm527 R6G Pi-2 C101-A-51 239 223, 227, 239, 243, 245
Rm72 TAMRA Pi-33 C101-Lac 165 165, 173, 183, 205, 210
Rm310 ROX Pi-33 C101-Lac 95 95, 123, 125, 127, 129
Таблица 3. результаты мультиплексного анализа наличия генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2 и Pi-33.
рисунок. Аллельное состояние генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2 и Pi-33 у исследуемых линий риса: a) гомозигота «2» - наличие 2 аллелей, определяющих устойчивость, в гомозиготном состоянии в генах Pi-1, Pi-2 и Pi-33; б) гетерозигота «1» - наличие 1 аллеля устойчивости по генам Pi-1 и Pi-33; в) гомозигота «0» - отсутствие аллелей устойчивости по генам Pi-1, Pi-2 и Pi-33.
Генотип Rm224 Rm527 Rm72 Rm310
a Гомозигота «2» 137 239 165 95
137 239 165 95
b Гетерозигота «1» 125 223 165 95
137 239 205 129
c Гомозигота «0» 125 223 205 129
125 223 205 129
Используемые в ранее предложенных методах выявления генов устойчивости Pi-1, Pi-2, Pi-33 электрофорез в 3 %-ном агарозном геле или в 8 %-ном полиакриламидном геле не обладают достаточной разрешающей способностью и позволяют оценивать относительную длину фрагмента эмпирически. Это может привести к ошибочным результатам анализа наличия генов устойчивости и последующим проблемам в селекционной работе.
Разработанная технология на основе мультиплексного ПЦР-анализа в 96-луночном планшете с применением электрофореза высокого разрешения и флуоресцентной детекции позволяет определять длину микросателлитных фрагментов с точностью до одного нуклеотида и получать оцифрованные генетические профили, значительно повышая точность отбора устойчивых селекционных форм при исследовании большого количества растительных образцов.
По результатам генетического анализа 1200 селекционных образцов риса, проведенного с использованием новой технологии, благодаря кодоминант-ному типу наследования микросателлитных маркеров среди исследуемых селекционных образцов были выявлены растения с маркерами генов устойчивости Pi-1, Pi-2 и Pi-33 в гомозиготном и гетерозиготном состоянии (см. рисунок, a, b).
В результате широкомасштабного скрининга селекционных образцов риса с применением тех-
нологии мультилокусной ПЦР-идентификации генов устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33 в сочетании с разработанной ранее безэлектрофо-резной технологией анализа аллельного состояния генов устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-ta и Pi-b на основе ПЦР в реальном времени [18] были отобраны линии риса с пятью генами устойчивости к пирикуляриозу в гомозиготном и гетерозиготном состоянии.
выводы. В результате проведенных исследований разработана технология широкомасштабного скрининга образцов риса на наличие генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33. Для проведения анализа образцов риса одновременно по трем генам устойчивости разработана система мультиплексного ПЦР-анализа сцепленных с соответствующими генами устойчивости микросателлитных локусов Rm224 (Pi-1), Rm527 (Pi-2), Rm72 и Rm310 (Pi-33).
Применение электрофореза высокого разрешения для разделения полученных ПЦР-фрагментов и флуоресцентной детекции в автоматическом генетическом анализаторе «Нанофор-05» позволило определить длины исследуемых микросателлитных маркеров с точностью до одного нуклеотида.
Автоматизация процессов выделения ДНК и раскапывания ПЦР-проб в формат 96-луночного планшета с последующей детекцией ПЦР-продуктов на автоматическом генетическом анализаторе «Нанофор-05»
позволили значительно повысить точность генетического анализа и расширить возможности применения технологии для проведения широкомасштабного скрининга на наличие генов устойчивости к пирикуляриозу.
С использованием разработанной технологии проведен генетический анализ 1200 селекционных образцов риса и выявлены растения с маркерами генов устойчивости РМ, Ри2и Ри33 в гетерозиготном и гомозиготном состоянии.
Литература.
1. Создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с помощью ДНК-маркеров/П. И. Костылев, А. А. Редькин, Е. В. Краснова и др. // Вестник РАСХН. 2014. № 1. 26-28.
2. Повышение устойчивости риса к пирикулярии путем пирамилирования нескольких генов с маркерным контролем / П. И. Костылев, Е. В. Краснова, А. А. Редькин и др. // Вестник защиты растений. 2016. № 89 (3). С. 86-87.
3. Girish Kumar K., Hittalmani S., Srinivasachary К. Marker assisted backcross gene introgression of major genes for blast resistance in rice //Advances in Rice Blast Research. 2000. Pp. 43-53.
4. Gene combinations in rice for the development of durable resistance to Pyricularia grisea in Colombia / F. J. Correa-Victoria, D. Tharreau, C. Martinez, etc. //Proc. 3rd Int. Temperate Rice Conference. Punta del Este. 2003 [Электронный ресурс]. URL: http:// ciat-library.ciat.cgiar.org/Articulos_Ciat/epmr/poster_16_empr07.pdf (дата обращения: 21.09.2018).
5. Blast resistance genes and their selection markers in rice (Oryza sativa L.) / Y. Koide, N. Kobayashi, D. Xu, etc. //JIRCAS Working Report. 2009. Vol. 63. Pp. 95-122.
6. Jena K. K., Moon H. P., Mackill D. J. Marker assisted selection - a new paradigm in plant breeding// Korean J. Breed. 2003. Vol. 35. Pp. 133-140.
7. Fine mapping and DNA marker-assisted pyramiding of the three major genes for blast resistance in rice / S. Hittalmani, A. Parco, T. V. Mew, etc.//Theor. Appl. Genet. 2000. Vol. 100. Pp. 112-1128.
8. Development of DNA markers suitable for marker assisted selection of three Pi genes conferring resistance to multiple Pyricularia grisea pathotypes/ R. Fjellstrom, A. C. Conaway-Bormans, A. M. McClung, etc. // Crop Science. 2004. Vol. 44. Pp. 1790-1798.
9. Объединение генов устойчивости риса к пирикуляриозу в генотипах российских сортов с использованием маркерной селекции / П. И. Костылев, Е. В. Краснова, А. А. Редькин и др. // Экологическая генетика. 2017. № 15 (3). С. 54-63.
10. Genetic characterization and fine mapping of the blast resistance locus Pigm( t) tightly linked to Pi2 and Pi9 in a broad-spectrum resistant Chinese variety/ Y. Deng, X. Zhu, Y. Shen, etc. // Theor. Appl. Genet. 2006. Vol. 113. Pp. 705-713.
11. Ильницкая Е. Т. Молекулярное маркирование в селекции риса на устойчивость к пирикуляриозу: дис. ... канд. биол. наук. Краснодар, 2007. 99 с.
12. Identification and fine mapping of Pi33, the rice resistance gene corresponding to the Magnaporthe grisea avirulence gene ACE1 /B. Berruyer, H. Adreit, J. Milazzo, GaillardS., etc.//Theor. Appl. Genet. 2003. Vol. 107. Pp. 1139-1147.
13. Blast resistance in rice: a review of conventional breeding to molecular approaches / G. Miah, M. Y. Rafii, M. R. Ismail, etc. // Mol Biol Rep. 2013. Vol. 40 (3). Pp. 2369-88.
14. Marker-assisted introgression of three dominant blast resistance genes into an aromatic rice cultivar Mushk Budji/A. H. Khan, A. B. Shikari, R. Vaishnavi, etc.//Scientific Reports. 2018. Vol. 8. Pp. 4091.
15. Development and identification of novel rice blast resistant sources and their characterization using molecular markers / S. J. S. Rama Devi, Kuldeep Singh, B. Umakanth, etc.// Rice science. 2015. Vol. 22 (6). Pp. 300-308.
16. Интрогрессия генов резистентности к пирикуляриозу как фактор стабилизации устойчивости растений риса к заболеванию / Е. В. Дубина, В. Н. Шиловский, С. В. Гаркуша и др. // Вестник защиты растений. 2016. № 90-4. С. 19-24.
17. Kidwell K. K., Osborn T. C. Simple Plant DNA Isolation Procedures// Plant Genomes: Methods for Genetic and Physical Mapping. Dordrecht, Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 1992. Рр. 1-13.
18. Усовершенствование метода идентификации генов устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta и Pi-b / И. А. Шилов,
0. С. Колобова, Ю. В. Анискина и др. //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 8. С. 45-48.
Technology of Mass Screening of Rice Samples for the Presence of Pi-1, Pi-2 and Pi-33 Resistance Genes on the Basis of Multiplex Microsatellite Analysis
1. A. Shilov1, Yu. V. Аniskina1, N. S. Velishaeva1, O. S. Kolobova1, т. V. Shalaeva1, P. I. Kostyilev2, E. V. Dubina3
'All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechmology, ul. Timiryazevskaya, 42, Moskva, 127550, Russian Federation 2Agrarian Scientific Center "Donskoj", pos. Nauchnyi gorodok, 3, Zernograd, 347740, Russian Federation 3All-Russian Research Institute of Rice Breeding, pos. Belozernyi, 3, Krasnodar, 350921, Russian Federation
Abstract. The investigation was carried out with the aim of developing a multilocus microsatellite analysis technology for large-scale screening of rice samples for the presence of three genes of resistance to rice blast Pi-1, Pi-2, Pi-33. The suggested system of multiplex PCR-analysis of microsatellite loci Rm224(Pi-1), Rm527(Pi-2), and Rm72and Rm310(Pi-33), linked to the resistance genes, enables to identify three resistance genes simultaneously and significantly reduces the cost and duration of genetic analysis. The length of the obtained PCR fragments was determined by the results of the separation with high-resolution electrophoresis in an automated genetic analyzer "Nanofor-05" using the technology of fluorescence detection. Such an approach made it possible to determine the length of the microsatellite fragments under study with an accuracy of one nucleotide. As a result of the genetic analysis of lines-donors of the resistance, the exact lengths of microsatellite markers, determining the presence of the corresponding genes of the resistance to rice blast, were experimentally established: a fragment of locus Rm224 with a length of 137 bp detected in line C104-Lac - the donor of gene Pi-1; a fragment of locus Rm527 with a length of 239 bp, detected in line C101-A-51- the donor of gene Pi-2; a fragment of locus Rm72 with a length of 165 bp and a fragment of locus Rm310 with a length of 95 bp, identified in line C101-Lac - the donor of gene Pi-33. These donor lines were used as positive controls in the examination of rice samples. Genetic analysis of 1200 breeding samples of rice, carried out using the developed technology, revealed plants with resistance gene markers Pi-1, Pi-2 and Pi-33 in the heterozygous and homozygous state. The proposed technology can be introduced into the practice of marker-assisted rice breeding since analysis in the format of a 96-well plate can be automated, which improves accuracy, and also allows for large-scale screening for the presence of genes for resistance to rice blast.
Keywords: rice (Oryza sativa L.); resistance to rice blast; donor; Pi-1, Pi-2, Pi-33 genes; marker-assisted selection; microsatellite markers; multiplex PCR analysis; DNA fragment analysis.
Acknowledgments: The work was carried out within the framework of the State Assignment "Development of New Technologies for High-Throughput Genetic Analysis of Agricultural Crops for Accelerating the Breeding Process" (Project 0574-2018-0007). Author Details: I. A. Shilov, D. Sc. (Biol.), professor of the RAS, head of laboratory (e-mail: ishilov@rambler.ru); Yu. V. Aniskina, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; N. S. Velishaeva, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; O. S. Kolobova, senior research fellow; Т. V. Shalaeva, research trainee; P. I. Kostyilev, D. Sc. (Agr.), prof., head of laboratory (e-mail: p-kostylev@mail.ru); E. V. Dubina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: lenakrug1@rambler.ru).
For citation: Shilov I. A., Aniskina Yu. V., Velishaeva N. S., Kolobova O. S., Shalaeva Т. V., Kostyilev P. I., Dubina E. V. Technology of Mass Screening of Rice Samples for the Presence of Pi-1, Pi-2 and Pi-33 Resistance Genes on the Basis of Multiplex Microsatellite Analysis. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2018. Vol. 32. No. 11. Pp. 21-25 (in Russ.). DOI: 10.24411/0235-2451-2018-11105.
