CC BY
40
УДК 18:632.488.42:575
использование ДнК-ТЕхнологий для создания сортов риса устойчивых к пирикуляриозу
Е.В. ДУБИНА1, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (e-mail: lenakrug1@rambler.ru)
B.Н. ШИЛОВСКИЙ1, доктор сельскохозяйственных наук, главный научный сотрудник
Г.Л. ЗЕЛЕНСКИЙ1, доктор сельскохозяйственных наук, ведущий научный сотрудник
Е.С. ХАРЧЕНКО1, старший научный сотрудник М.Г. РУБАН1, научный сотрудник
C.В. ГАРКУША1, доктор сельскохозяйственных наук, директор
Л.В. ЕСАУЛОВА1, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник
Е.П. МАКСИМЕНКО2, директор 1Всероссиский научно-исследовательский институт риса, пос. Белозёрный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация
2ЭСП «Красное», ул. Комсомольская, 21, пос. Рисоо-пытный, Красноармейский р-н, Краснодарский край, 353826, Российская Федерация
Резюме. Разработка основ методологии маркер-вспомогательной селекции риса на устойчивость к Pyricularia oryzae Cav. (Magnaporthe grisea (Herbert) Barr Yaegashi & Udagawa, анаморф Pyricularia grisea, пирикуляриоз), а также формирование современных генресурсов устойчивых к этому заболеванию - одна из приоритетных задач мировой селекции риса. На основе использования современных технологий молекулярного ДНК-маркирования реализовано введение и пирамидирование генов резистентности к пирикуляриозу Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33 в отечественные сорта риса для придания им длительной устойчивости к заболеванию. В ходе работы с помощью маркерного контроля донорныхаллей создан ценный селекционный материал с пирамидированными генами резистентности к пирикуляриозу (Pi-2, Pi-b, Pi-ta), (Pi-2, Pi-b, Pi-33), который по результатам фитопатологи-ческого тестирования устойчив к смеси изолятов патогенна, выделенных на территории Краснодарского края. Перенос доминантных аллелей каждого гена в потомстве контролировался кодоминантными тесно сцепленными SSR-маркерами, созданными во ВНИИ риса. Для повышения экономической эффективности маркерной селекции предложена система мультиплексной ПЦР, позволяющая идентифицировать одновременно два гена (Pi-1+Pi-2, Pi-33+Pi-ta, Pi-ta+Pi-b) резистентности к M. grisea в геномной ДНК гибридных растений при постановке одной ПЦР. Её использование позволит значительно сократить затраты расходных материалов и время на выполнение анализа.
Ключевые слова: рис, пирикуляриоз, маркерная селекция, ПЦР, SSR-маркеры.
Для цитирования: Использование ДНК-технологий для создания сортов риса устойчивых к пирикуляриозу/Е.В. Дубина,
B.Н. Шиловский, Г.Л. Зеленский, Е.С. Харченко, М.Г. Рубан,
C.В. Гаркуша, Л.В. Есаулова, Е.П. Максименко//Достижения науки и техники АПК. 2015. Т.29. №12. С. 40-42.
Болезни сельскохозяйственных культур - один из факторов, серьёзно ограничивающих продуктивность растениеводства во всём мире. Ежегодный ущерб, причиняемый фитопатогенными микроорганизмами, по разным оценкам, составляет от 10 до 20% общей продукции отрасли в мире [1].
Один из серьёзных лимитирующих биотических стрессовых факторов для риса - пирикуляриоз (возбудитель несовершенный гриб Pyricularia oryzae Cav. (Magnaporthe grisea (Herbert) Barr). Всемирный институт микологии зарегистрировал это заболевание
более чем в 80 странах и в последние годы отмечена его высокая вредоносность во всех рисосеющих регионах [2]. Патоген поражает все надземные органы растения, что приводит к потере 20-60% урожая, а в годы эпифитотий к его полной гибели.
В 2013 г. эпифитотийная ситуация сложилась на рисовых полях Краснодарского края. Пирикуляриозом оказалось поражено более 20% посевов культуры. Потери урожая зерна составили 100-104 тыс. т.
Основная причина большой вредоносности болезни - отсутствие устойчивых сортов. Вновь создаваемые сорта быстро теряют устойчивость к новым расам патогена, так как высокая изменчивость гриба M. grisea опережает эволюцию растения-хозяина. Объединение нескольких эффективных генов устойчивости на генетической основе лучших и вновь создаваемых сортов - это результативная стратегия селекции на устойчивость к высоковариабельным грибным патогенам [3].
Применение современных биотехнологических методов ДНК-маркирования облегчает селекционную работу в таком направлении и позволяет ускоренными темпами создавать источники с генами резистентности к заболеванию [4]. Это необходимо для повышения конкурентоспособности отечественных сортов, выращивание которых позволит сократить до минимума применение химических средств защиты и обеспечить
pipiyPi Р, россикнн* ¿UMDpUin
ЛДО6 A01QWTE0
Pipi +
ВС1 Pipi, pipi
р
г*Ърнд.40ф патаистио
1 Р' íripi i
ВС.2 Pipi>pipi
гяЕрцдо» -oí о иг г по
1 ftpi Ipipi f
ВСЭ Pipi* pipi
ÍTtCp *яп 10 I Pipi: I pi p
крпое üiMHHiuiHwt
BC3F1 hpi*pj> i
1 PÍPÍ p.p-
I
BOFJ ¡Pi-il x K.3F1 fPi-t»l
BCiFi Я KSF1 [Pi-b)
acifl (Н-ЫЧ-5Ц * btSFl |Pi-ti]
SüFi
eofi SttFipud i
Рис. 1. Схема переноса генов Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-z, Pi-40 в генотипы отечественных сортов риса из линий-доноров.
рис. 2. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-33+Pi-ta: 18272375 - гибридные растения; С101 - линия C101Lac (донор гена Pi-33); IR-36 - линия IR-36 (донор гена Pi-ta); Ф^а) - сорт Флагман.
пищевую безопасность продукции отрасли. Кроме того, бесфунгицидные технологии в рисоводстве улучшат чистоту вод оросительных систем и, в конечном счете, окажут благотворное влияние на флору и фауну бассейна реки Кубань.
Цель наших исследований - оценка возможности использования метода мультиплексной идентификации генов расоспецифической устойчивости риса к пирикуляриозу Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-ta, Pi-b, позволяющего определять одновременно несколько генов резистентности к M.grisea (Herbert) Barr в геномной ДНК гибридных растений при постановке одной ПЦР.
Условия, материалы и методы. Донорами для введения генов устойчивости к пирикуляриозу в ген-плазму российских сортов риса Флагман и Снежинка, а также линий КП-163 и ВНИИР-5242 стали сорта и линии зарубежной селекции IR- 36 (ген Pi-ta), BL-1 (ген Pi-b), Maratelli (ген Pi-z), C101LAC (гены Pi-1+Pi-33), C101A-51 (ген Pi-2), IR 83260-1-1-1-5-B (ген PI-40). Схема переноса генов Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-z, Pi-40 в генотипы отечественных сортов риса из линий-доноров представлена на рис. 1.
По каждой комбинации было проведено три бек-кросса, поскольку известно, что восстановление генома рекуррентного родителя (RP) при возвратных скрещиваниях в ВС3 составляет 93,75 % [5].
Для контроля наличия в экспериментальных растениях доминантных аллелей донорных генов устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta, Pi-z, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33, Pi-40 проводили микросателлитный анализ на основе метода полимеразной цепной реакции (П^). В работе использовали внутригенные [6], а также микро-сателлитные кодоминантные молекулярные маркеры, сцепленные с указанными генами, взятые из базы данных генетических ресурсов NCBI, доступной на web-странице http://blast.ncbi. nlm.nih.gov/Blast.cgi [7].
При гибридизации растений осуществляли пнев-мокастрацию материнских форм и опыление «ТВЕЛЛ»-методом [8]. Pастения выращивали в вегетационных сосудах на вегетационной площадке и в камерах искусственного климата с учетом продолжительности фаз вегетационного периода.
Образцы ДНК выделяли из свежесрезанной части
листовой пластинки гибридных растений на стадии 45 листьев методом СТАВ, который заключается в использовании гексадецил-триметиламмония бромида в качестве детергента в лизирующем буфере [9].
ПЦР проводили по стандартной методике, но с предварительной оптимизацией её параметров. Для разработки системы муль-типраймерной ПЦР при подборе комбинаций молекулярных маркеров, вносимых в реакционную смесь, учитывали их температуру отжига; разницу в размерах ПЦР-продуктов, синтезируемых в ходе амплификации с праймерными парами; самокомплементарность их последовательностей.
Амплификацию осуществляли в ДНК-ампли-фикаторе «Терцик», оптимизировав при этом условия ПЦР: начальная денатурация - 5 мин. при 94°С - 1 цикл; денатуация 35 с при 94°С; отжиг праймеров 45 с при 60° С; синтез 30 с при 72°С - 35 циклов; синтез 5 мин. при 72°С - 1 цикл.
Продукты реакции амплификации разделяли с использованием метода электрофореза в 8%-ном полиакриламидном геле. Визуализацию результата электрофоретического разделения продуктов ПЦР осуществляли с использованием бромистого этидия (BrEt, 2,7-диамино-10-этил-9-фенилфенатридинийбромид, хомидий бромид), который способен интеркалировать в двойную спираль ДНК и усиливать флюоресценцию в проходящем УФ свете. Гелевые пластины помещали на 20-40 мин в раствор бромистого этидия 5 мкг/мл и фотографировали в УФ свете.
результаты и обсуждение. На основе отечественных сортов был получен обширный спектр линий с генами резистентности к патогену Pi-1, Pi-33, Pi-b, Pi-2, Pi-ta, Pi-z, Pi-40.
В результате исследований с использованием результатов мультиплексной ПЦР на наличие в генотипе одновременно двух генов устойчивости к пирикуляриозу (Pi-ta+Pi-33) мы установили, что у образцов под №№ 1838, 1842, 1843, 1854 и 2370, несущих доминантные аллели этих генов, присутствует специфичный для них ПЦР-продукт (рис. 2).
Использование комбинации праймерных пар на гены Pi-ta+Pi-b (рис. 3) показало, что анализируемые
рис. 3. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-ta+Pi-b. 63-40 -гибридные растения; В1 - линия В1-1 (донор гена Pi-b); ^ - линия ^-36 (донор гена Pi-ta).
рис. 4. Мультиплексная ПЦР на гены устойчивости к пирикуляриозу Pi-1+Pi-2: 1825-2400 -гибридные растения; С101 - линия C101Lac (донор гена Pi-1); А-51 - линия С101А-51 (донор гена Pi-2); Ф(1) - сорт Флагман.
гибридные образцы №№18 и 59 несут их доминантную аллель; растения под №№ 62, 19, 10 - гетерозиготы по гену Pi-ta. Остальные растения несут аллели материнской формы (сорт Флагман) и подлежат выбраковке.
По результатам апробации комбинации пар прай-меров, фланкирующих маркерные участки целевых генов Pi-1 и Pi-2, установлено, что образец № 2400 несёт доминантную аллель гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-1 (рис. 4), все остальные анализируемые образцы несут аллель материнской формы (сорт Флагман); у образцов №№ 1825-1820, 2389, 2399, 2392,
2376, 2381 присутствует ПЦР-продукт, специфичный для доминантной аллели гена устойчивости к пирикуляриозу Pi-2.
Разработанная технология идентификации одновременно нескольких генов устойчивости к пири-куляриозу внедрена в систему маркерной селекции по созданию резистентных к патогену генресурсов риса. С её применением созданы гибридные формы, несущие одновременно доминантные аллели двух генов резистентности.
выводы. Использование разработанных систем мультипраймерной ПЦР позволяет с необходимой точностью идентифицировать присутствие в генотипе одновременно двух генов устойчивости - Pi-1 + Pi-2; Pi-ta + Pi-b; Pi-33 + Pi-ta. Это, в свою очередь, дает возможность значительно сократить затраты расходных материалов и время на выполнение анализа образцов с пирамидированными генами резистентности к Magnaporthe grisea, что повышает эффективность ДНК-маркерной селекции.
Литература.
1. Lievens B., Thomma B.P. Recent developments in pathogen detection arrays: Implications for fungal plant pathogens and use in practice // Phytopathology. Vol. 95. No. 12. 2005. Pp. 1374-1380.
2. Ляховкин А.Г. Рис. Мировое производство и генофонд.- 2-е изд., перераб. и доп. -СПб.: «профи-информ», 2005.- 288 с.
3. Identification of Major Blast Resistance Genes in Korean Rice Varieties (Oryza sativa L.) Using Molecular Markers / Young-Chan Cho, Soon-WookKwon, Im-Soo Choi, Sang-KyuLee, Jong-Seong Jeon, Myung-Kyu Oh, Jae-Hwan Roh, Hung-Goo Hwang, Sae-June Yang, Yeon-Gyu Kim // Journal of Crop Science and Biotechnology. 2010. №10 (4). Pp. 265-276.
4. Analysis of simple sequence repeat markers linked with blast disease resistance genes in a segregating population of rice (Oryza sativa) / Ashkani S., Rafii M.Y., Sariah M., Siti Nor Akmar A., Rusli I., Abdul Rahim H., Latif M.A. // Genetics and Molecular Research. 2011. №10 (3). Pp. 1345-1355.
5. Jena K.K., Moon H.P., Mackill D.J. Marker assisted selection - a new paradigm in plant breeding // Korean J. Breeding. 2003. V.35. Pp. 133 - 140.
6. Создание внутригенных молекулярных маркеров риса для повышения эффективности селекционного и семеноводческого процессов/Ж.М. Мухина, С.В. Токмаков, Ю.А. Мягких, Е.В. Дубина//Полиматический сетевой электронный научный журнал КубГАУ. 2011. № 67(03). URL: http://ej.kubagro.ru/get.asp?id=1441&t=0 (дата обращения 18.12.2015 г.)
7. Создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с помощью ДНК-маркеров / П.И. Костылев, А.А. Редькин, Е.В. Краснова, Е.В. Дубина, Ж.М.Мухина, Е.Т. Ильницкая, Е.М. Харитонов, Л.В. Есаулова//ВестникРАСХН. 2014. №1. С. 26-28.
8. Лось Г.Д. Перспективный способ гибридизации риса // Сельскохозяйственная биология. 1987. № 12. С.15-17.
9. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research. 1980. № 10. Pp. 4321-4325.
the use of dna-technologies to develop rice varieties resistant to blast
E.V. Dubina1, V.N. Shilovskiy1, G.L. Zelenskiy1, E.S. Kharchenko1, M.G. Ruban1, S.V. Garkusha1, L.V. Esaulova1, E.P. Maximenko2
'All-Russian Research Institute of Rice Breeding, pos. Belozerny, 3, Krasnodar, 350921, Russian Federation
2Elite Seed-Production Enterprise «Krasnoe», ul. Komsomolskaya, 21, pos. Risoopyitny, Krasnoarmeyskiy r-n, Krasnodarsky kray, 353826, Russian Federation
Summary. The development of basic methodologies of marker assisted breeding of rice resistant to Pyricularia oryzae Cav. (Magnaporthe grisea (Herbert) Barr Yaegashi & Udagawa (anamorphic Pyricularia grisea, rice blast disease)), as well as development of modern genetic resources resistant to this disease is one of the priority tasks in the world rice breeding. Using modern technologies of molecular DNA-marking it was realized the introduction and pyramiding of blast resistance genes Pi-ta, Pi-b, Pi-1, Pi-2, Pi-33 into domestic rice varieties for providing them long-term resistance to the disease. During our work with the help of marker control of donor alleles we obtained valuable breeding material with pyramided genes of resistance to the blast disease (Pi- 2, Pi-b, Pi-ta), (Pi-2 , Pi-b, Pi-33). According to the results of phytopathological test it is resistant to a mixture of pathogen isolates, selected in Krasnodar Krai. The transfer of dominant alleles of each gene in the progeny was controlled by codominant closely linked SSR- markers established in All-Russian Research Institute of Rice Breeding. To improve the economic efficiency of marker breeding, we proposed multiplex PCR system, enabling the identification of two genes (Pi-1 + Pi-2, Pi-33 + Pi-ta, Pi-ta + Pi-b) of resistance to M. grisea in the genomic DNA of hybrid plants during one PCR-reaction. The use of such reaction will significantly reduce the cost of consumables and time to perform the analysis. Keywords: rice, blast, marker assisted selection, PCR, SSR-markers.
Author Details: E.V. Dubina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: lenakrug1@rambler.ru); V.N. Shilovskiy, D. Sc. (Agr.), chief research fellow (e-mail: arrri_kub@mail.ru); G.L. Zelenskiy, D. Sc. (Agr.), leading research fellow (e-mail: zelensky08@mail.ru); E.S. Kharchenko, senior research fellow; M.G. Ruban, research fellow; S.V. Garkusha, D. Sc. (Agr.), director; L.V. Esaulova, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: l.esaulova@mail.ru); E.P. Maximenko, director (e-mil: evgenij.maksimenko.70@mail.ru) For citation: Dubina E.V, Shilovskiy V.N., Zelenskiy G.L., Kharchenko E.S., Ruban M.G., Garkusha S.V., Esaulova L.V, Maximenko E.P. The Use of DNA-Technologies to Develop Rice Varieties Resistant to Blast. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2015. V.29. No 12. Pp. 40-42 (In Russ.).
