CC BY
39
УДК 631.527.3:633.18
УСОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ МЕТОДА ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К ПИРИКУЛЯРИОЗУ РИСА Р1-ТА, Р1-В
И.А. ШИЛОВ1, доктор биологических наук, зав. лабораторией (ishilov@rambler.ru)
О.С. КОЛОБОВА1, старший научный сотрудник Ю.В. АНИСКИНА1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
Т.В. ШАЛАЕВА1, стажёр-исследователь Н.С. ВЕЛИШАЕВА1, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник
П.Н. КОСТЫЛЕВ2, доктор сельскохозяйственных наук, зав. лабораторией (p-kostylev@mail.ru)
Е.В. ДУБИНА3, кандидат биологических наук, ведущий научный сотрудник (lenakrug1@rambler.ru)
всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии, ул. Тимирязевская, 42, Москва, 127550, Российская Федерация
2Всероссийский научно-исследовательский институт зерновых культур им. И.Г. Калиненко, Научный городок, 3, Зерноград, 347740, Российская Федерация
3Всероссийский научно-исследовательский институт риса, пос. Белозёрный, 3, Краснодар, 350921, Российская Федерация
Резюме. Для определения аллельного состояния генов устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta и Р1-Ь давно разработаны маркеры полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мы создали технологию анализа аллельного состояния этих генов методом ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ). Исследовали 17 гибридов риса второго поколения, полученных от скрещивания растений-доноров устойчивости к пирикуляриозу с российскими сортами в стратегии пирамидирования (300 растений). Для дизайна праймеров и зондов на ген Pi-ta использовали нуклео-тидные последовательности доминантной (сорт Yashiro-тосШ, АР207842) и рецессивной аллелей (сорт Tsuyake, AY196754). Для идентификации аллельного состояния гена Pi-b модифицировали известные праймеры (Супрун И.И., Ильницкая Е.Т., Мухина Ж.М., 2007) - добавили 1 нуклеотид на 3'-конец для оптимизации температуры отжига. Для дизайна зондов использовали нуклеотидные последовательности ЛВ026839 с геном устойчивости Pi-b и неустойчивой формы ЛР004048. ПЦР проводили в 25 мкл раствора, содержащего ПЦР-буфер, 1,25 ед. Тaq ДНК-полимеразы, 100 мкмоль dNTP, по 10 пкмоль каждого праймера, 5 пкмоль зондов и 5 мкл раствора ДНК. Амплификацию осуществляли при 95 оС, 10 мин, 40 циклов. У устойчивых гомозиготных доминантных по гену Pi-ta растений отмечен рост флуоресценции по каналу РАМ; у восприимчивых гомозиготных растений - по каналу R6G; у гибридных гетерозигот - по обоим каналам. У устойчивых гомозиготных по гену Pi-b растений наблюдали рост флуоресценции по каналу ROX; у восприимчивых гомозиготных - по каналу R6G; у гетерозигот - по обоим каналам. Использование флуоресцентных меток зондов позволило применить 96-луночный планшет и роботизированную раскапывающую станцию. Разработанные системы использовали во ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко при создании устойчивых к пирикуляриозу сортов риса. Найдено 13 растений, гомозиготных одновременно по генам Pi-ta и Pi-b и гомозиготные формы, несущие эти гены по отдельности.
Ключевые слова: рис, донор, устойчивость к пирикуляриозу, гены Pi-ta, Pi-b, гибрид, маркер, ПЦР-РВ. Для цитирования: Усовершенствование метода идентификации генов устойчивости к пирикуляриозу риса Pi-ta и Pi-b /И.А. Шилов, О.С. Колобова, Ю.В. Анискина, Т.В. Шалаева,
Н.С. Велишаева, П.Н. Костылев, Е.В. Дубина //Достижения науки и техники АПК. 2016. Т. 30. № 8. С. 45-48.
Пирикуляриоз - одно из самых вредоносных заболеваний риса, распространенное во всех регионах выращивания культуры. Недобор урожая при поражении растений может составлять от 15 до 40%. Возбудитель - несовершенный гриб Pyricularia oryzae Cav. (Magnaporthe grisea (Herbert) Barr.).
Введение генов резистентности к пирикуляриозу в высокопродуктивные сорта риса отечественной селекции - наиболее результативная стратегия борьбы с этим заболеванием [1]. Для формирования устойчивости к расам возбудителя пирикуляриоза на юге России эффективны гены Pi-ta и Pi-b [2]. Их активно используют при создании новых сортов во ВНИИ риса и ВНИИ зерновых культур. Использование молекулярных маркеров позволяет ускорить и удешевить отбор нужных генотипов, что особенно важно в процессе пирамидирования генов резистентности.
Ген Pi-ta относят к семейству NBS-LRR R-генов. Он содержит 928 пар нуклеотидов и кодирует ци-топлазматический рецептор распознавания гена вирулентности. Доминантная и рецессивная аллели этого гена имеют однонуклеотидный полиморфизм в положении 918, приводящий к замене серина на аланин. Это вызывает нарушению узнавания белка комплементарного гена авирулентности Avr-Pita [3]. Для растений с обнаруженным маркером доминантной аллели гена Pi-ta показана устойчивость к пирикуляриозу в фитопатологических тестах [3, 4]. Кроме того, этот факт подтвержден при создании трансгенных растений с введенной доминантной аллелью [5] .
Детекция полиморфизма G/T служит методом различения доминантной и рецессивной аллели на молекулярном уровне [5]. Полиморфизм выявляют с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР) с аллель-специфическими праймерами по различию длин получаемых фрагментов в агарозном геле [6]. Кроме того, существует автоматизированный, но более дорогостоящий способ оценки размера ПЦР-продуктов с использованием капиллярного электрофореза с флуоресцентно-мечеными прай-мерами [7].
Ген Pi-b состоит из 417 пар нуклеотидов и также относится к семейству NBS-LRR. В отличие от Pi-ta, он не имеет четко выраженного сайта связывания с геном авирулентности и, возможно, служит медиатором для запускадругих генов устойчивости[8]. Неустойчивая форма содержит нефункциональный псевдоген из-за наличия стоп-кодона в открытой рамке считывания. Наиболее масштабное исследование связи присутствия гена, характеризующих его маркеров и устойчивости к различным расам проведено на базе коллекции Университета Арканзаса [9]. При изучении коллекции ВНИИ риса выявлен один источник гена Pi-b, который в последующем и использовали в селекционном процессе [10]. На
п п п п
Аллель G
Рис.1. Схема аллель-специфичной ПЦР-РВ при определении полиморфизма в/Т в гене Р1-1а на примере детекции доминантной гомозиготы.
основании различия в последовательностях устойчивой и неустойчивой форм создан ДНК-маркер гена устойчивости Р1-Ь, позволяющий различать формы по длине ПЦР-продуктов в агарозном геле [11].
Однако при анализе большого количества образцов электрофоретическая детекция становится трудоемкой и содержит риск контаминации, поэтому мы приняли решение о необходимости усовершенствования метода определения с возможностью его автоматизации в формате 96-луночного планшета.
Цель исследований - перевести разработанные в лаборатории маркеры в формат ПЦР в реальном времени с TaqMan-зондами, позволяющими идентифицировать различные аллельные состояния в генах Р1-1а и Р1-Ь.
Условия, материалы и методы. Для детекции однонуклеотидного полиморфизма гена Р1-1а использовали два зонда, содержащие полиморфизм в или Т, меченные различными флуоресцентными красителями. Во время отжига происходила гибридизация зонда с последовательностью ДНК по принципу комплементарности. В ходе элонгации Тац ДНК-полимераза расщепляла гибридизовавшийся зонд: в результате флуорофор и гаситель пространственно разобщались, что приводило к росту флуоресценции в каждом цикле ПЦР. Зонд, содержащий иной вариант
полиморфизма, неэффективно гибридизировался с последовательностью при заданной температуре, поэтому оставался неразрушенным, и роста флуоресценции не наблюдали (рис. 1). У гетерозигот в реакции участвовали оба зонда, рост флуоресценции фиксировали по двум каналам детекции.
Полиморфизм гена Pi-b определяли в реакции ПЦР в реальном времени (ПЦР-РВ) с праймерами и зондами, одни из которых специфичны последовательности доминантного гена устойчивости, другие - отличающейся последовательности неустойчивых форм. Образование продукта в ПЦР свидетельствует о наличии той или иной последовательности и фиксировалось как рост флуоресценции по одному из каналов в случае гомозигот, и по двум - в случае гетерозигот.
Для выявления аллельного состояния по генам устойчивости к пирикуляриозу исследовали 17 гибридов риса второго поколения (см. табл.), полученных от скрещивания растений-доноров устойчивости к этому заболеванию с современными российскими сортами в стратегии пирамидирования (всего 300 растений).
Для проведения исследований с помощью ПЦР-анализа с электрофоретической детекцией отобрали контрольные формы риса (IR-58 и Мороберекан), содержащие доминантные гены Pi-ta, Pi-b, и сорт Боярин, имеющий рецессивные аллели (см. табл.). У полученных ПЦР-продуктов определяли нуклео-тидную последовательность на генетическом анализаторе ABI PRISM 3130XL (ЦКП «Биотехнология» ФБГНУ ВНИИСБ).
ДНК выделяли из замороженных листьев растений модифицированным методом CTAB [12]. Кусочки зеленых листьев размером 1-1,5 см2 растирали в ступке с жидким азотом. Затем добавляли 500 мкл экстракционного буфера (100 мМ Tris-HCl, pH 8,0, 1,4М NaCl, 20 мМ ЭДТА, 2% СТАВ), переносили в
Таблица. Анализируемые комбинации скрещивания риса
№ I Комбинация скрещивания
1349 (^-58 х Кубояр 3)х(Аметист х Мороберекан) X РМ+2+33, Ил.14
1362 Р1 1+2+33, рыхлая метелка X РМ+33+1а+Ь (1225)
1365 РМ+2+33 гомо, №5 X Боярин
1401 РМ+2+33 гомо, №5 X Кубояр
1373 РМ+2+33 гомо, Ил.14 X Кубояр
1384 РМ+33+1а+Ь (4 гена гомо) 1225 X Магнат (К-100)
1404 РМ+2+33+1а+Ь (5 генов гомо) 1396 X Магнат (К-100)
1363 РМ+2+33+1а+Ь (5 генов гомо) 1396 X П40 (2-1-24-4-В)
1371 РМ+2+33+1а+Ь (5 генов гомо) 1396 X П40 (1-1-1-5-В)
1407 РМ+2+33+1а+Ь (5 генов гомо) 1396 X Кубояр
1355 Аметист х Мороберекан (Р1-Ь) X Кубояр
1368 Дон 8765, устойчив к пирикулярии X Магнат (К-100)
1381 Дон 8765, устойчив к пирикулярии X Магнат (К-121)
1396 Компактная метелка, крупное зерно X Магнат (8925)
1357 Магнат (К-100) X Кубояр
1346 Нейтрон X Магнат (8925)
1352 П40 (1-1-1-5-В) X Кубояр
пластиковые пробирки 1,5 мл и инкубировали при B5 °C в течение 45 мин, периодически перемешивая. Осаждали нерастворимую фракцию при 13000 оборотов/мин (об./мин) в течение 5 мин и переносили супернатант в новые пробирки с 5 мкл РНКазы А в концентрации 10 мг/мл. Инкубировали 15 мин при B5 °C и добавляли 500 мкл хлороформа. Интенсивно перемешивали и центрифугировали при 13000 об./мин в течение 5 мин. Верхнюю фазу переносили в чистые пробирки с 10%-ным СТАВ-буфером (10% СТАВ, 0,7M NaCl). Смесь перемешивали и инкубировали 10 мин при B0 °C. Затем добавляли 500 мкл хлороформа, интенсивно перемешивали и центрифугировали при 13000 об./мин в течение 5 мин. Верхнюю фазу переносили в чистые пробирки с 30 мкл 5 мМ KCH3COOH, добавляли 1 мл 96%-ного этилового спирта, перемешивали и инкубировали при минус 20 °C в течение 20 мин. Центрифугировали при 13000 об./мин 10 мин, осадок промывали в 200 мкл 75% этилового спирта, подсушивали и растворяли в 100 мкл ТЕ-буфера.
Для дизайна праймеров и зондов на ген Pi-ta использовали нуклеотидные последовательности доминантной (сорт Yashiro-mochi, AF207842) и рецессивной аллелей (сорт Tsuyake, AY19B754). Были синтезированы праймеры и зонды для детекции точечной мутации методом ПЦР в реальном времени: PaF (5'-CCA GGT TAC AAC TTACAA GGA-3'), PaR (5'-AGA GGATTC CGGTAG CAT ACA-3'), PaG (5'-FAM-CTT CTA TCT TTA CCT GCT ATG CAT-RTQ1-3'), PaT (5'-R6G-CTT CTA TCT TTA CCT TCT ATG CAT C-BHQ2-3') («Синтол», Россия).
ПЦР проводили в 25 мкл раствора, содержащего ПЦР-буфер, 1,25 ед. Taq ДНК-полимеразы, 100 мкмоль dNTP (ООО НПО ДНК-Технология, Россия), по 10 пкмоль каждого праймера, 5 пкмоль зондов и 5 мкл раствора ДНК. Амплификацию осуществляли в детектирующем термоциклере (CFX-BioRad, США) по программе: 95 °C - 10 мин (94 оС - 10 с, B0 оС - 30 с), 40 циклов.
Для идентификации аллельного состояния гена Pi-b за основу взяли известные праймеры [13] и модифицировали их с добавлением 1 нуклеотида на 3'-конец для оптимизации температуры отжига. Для дизайна зондов использовали нуклеотидные последовательности AB02B839 с геном устойчивости Pi-b и неустойчивой формы AP004048. Синтезировали праймеры и зонды: PbF1(5'-GAA CAG CTT GCT CGG AAT CCA A-3'), PbR2 (5'-TAC TGC ATT GTG CAG CTT GTG C-3'), PbR3 (5'-TAC ATC GAC CAG CTA TTT GCC G-3'), PbR (5'-R6G-TGC CGG ACC TGA GCT GCC ACA TAT GC-BHQ1-3'), PiBD2 (5'-ROX-GCC GTG CTC CAT ACT ATC CTA CAA GTG A-BHQ2-3'), («Синтол», Россия). Условия ПЦР были такими же, как и для амплификации гена Pi-ta.
Результаты и обсуждение. Секвенирование образцов контрольных форм риса (IR-58 и Моробе-рекан), содержащих доминантные гены Pi-ta, Pi-b, и
сорта Боярин, имеющего рецессивные аллели, доказало наличие однонуклеотидного полиморфизма в/Т в гене Р1-1а и различие в последовательности доминантной и рецессивной аллели гена Р1-Ь.
Последующий анализ указанных контрольных образцов методом ПЦР в реальном времени продемонстрировал рост флуоресценции у гомозиготных доминантных по гену Р1-1а устойчивых растений (в-состояние) только по каналу FAM. У гомозиготных восприимчивых растений (Т-состояние) наблюдали рост флуоресценции только по каналу Я6в. У гибридных гетерозигот, обладающих обеими аллелями, зафиксирован рост по двум каналам флуоресценции FAM и (рис. 2). Это подтверждает аллель-специфическую гибридизацию зондов и корректную работу метода на контрольных образцах ДНК.
Рис. 2. Хроматограммы сиквенса образцов с обозначением точки полиморфизма гена Р1-1а и соответствующий ему график подъема флуоресценции в ПЦР-РВ: А - по каналу FAM для гомозиготы в; В - по каналам FAM и для гетерозиготы в/Т; С - по каналу для гомозиготы Т.
Также мы провели анализ контрольных образцов по гену Р1-Ь. У устойчивых растений, гомозиготных по этому гену, наблюдали рост флуоресценции только по каналу ЯОХ. У восприимчивых гомозиготных растений усиление флуоресценции имелось только по каналу Я6в. У гетерозигот зарегистрирован рост по двум каналам флуоресценции - ЯОХ и Я6в.
Автоматизация детекции результатов ПЦР дала возможность использовать формат 96-луночного планшета и применить для его автоматического заполнения раскапывающую станцию DT-Stream (ООО НПО «ДНК-Технология», Россия).
Разработанные системы задействовали для анализа растений во ВНИИ зерновых культур им. И.Г. Калиненко при создании устойчивых к пи-рикуляриозу сортов риса. С их использованием отобрали гомозиготные по двум и более генам формы, соответствующие комплексу положительных хозяйственно-ценных признаков в схемах селекционного процесса. В результате исследования 300 растений было выявлено 28 гомозигот и 41 гетерозигота по гену Р/Ча, 61 гомозигота и 20 гетерозигот - по гену Р1-Ь, 13 образцов имели оба гена устойчивости в гомозиготной форме. Несколько ценных форм, устойчивых к пирикуляриозу, корот-костебельных, с периодом вегетации 110-120 дн., высокой урожайностью и качеством крупы после оценки и браковки подготовлены для размножения и контрольного сортоиспытания [14, 15, 16].
Выводы. Технологии анализа ДНК позволяют контролировать перенос желаемого гена в гибридных популяциях, получать гомозиготы, а также
сокращать размер выборок и время анализа. В результате исследований усовершенствованы методы идентификации аллельного состояния эффективных на юге России генов Pi-ta и Pi-b расоспецифической устойчивости к пирикуляриозу. Созданы системы праймеров и аллель-специфичных TaqMan-зондов
для оценки аллельного состояния исследуемых генов методом ПЦР в реальном времени. Автоматизация процесса позволила проанализировать большое количество образцов в формате 96-луночного планшета и выделить гомозиготные по целевым генам образцы.
Литература.
1. Jena K.K., Moon H.P., Mackill D.J. Marker assisted selection - a new paradigm in plant breeding // J. Breed. 2003. V. 35. Pp.133-140.
2. Коломиец Т.М. Отбор исходного материала риса для селекции на иммунитет к пирикуляриозу: автореф. дисс. ... канд. биол. наук. Голицино, 1990. 21 с.
3. Rice Pi-ta gene Confers Resistance to the Major Pathotypes of the Rice Blast Fungus in the United States/ Y. Jia, Z. Wang, R.G. Fjellstrom, A.K. Karen Moldenhauer, Md. A. Azam, J. Correll, F.N. Lee, Y. Xia, J.N. Rutger, Z.X. Wang // Phytopatology. 2004. V. 94. № 3. Pp. 296-301.
4. Создание новых резистентных форм Oryza sativa L. к Magnaporthe grisea (Herbert) Barr. с использованием методов молекулярного маркирования/Е.В. Дубина, В.Н. Шиловский, Г.Л. Зеленский, Е.С. Харченко, В.Я. Рубан, Л.В. Есаулова, Е.П. Максименко, И.Б. Никитина // Молодой ученый. 2015. № 9.2. С. 15-20.
5. A single amino acid difference distinguishes resistant and susceptible alleles of the rice blast resistance gene Pi-ta / G.T. Brian, Wu Kun-Sheng, L. Farrall, Y. Jia, H.P. Hersley, S.A. McAdams, K.N. Faulk, G.K. Donaldson, R. Tarchini, B. Valent// The Plant Cell. 2000. V. 12. Pp. 2033-2045.
6. A telomeric avirulence gen determines efficacy for the rice blast resistance gene Pi-ta / M. J. Orbach, L. Farrall, J.A. Sweigard, G.Ch. Forrest, B. Valent // The Plant Cell. 2000. V.12. Pp. 2021-2032.
7. Создание внутригенных молекулярных маркеров риса для повышения эффективности селекционного и семеноводческого процессов/Ж.М. Мухина, С.В. Токмаков, Ю.А. Мягких, Е.В. Дубина//Полиматический сетевой электронный научный журнал Кубанского государственного аграрного университета (Научный журнал КубГАУ). 2011. № 03 (67) [Электронный ресурс]. URL: http://ej.kubagro.ru/2011/03/pdf/19.pdf (дата обращения: 01.02.16).
8. Development and validation of SNP-based functional codominant markers for two major disease resistance genesin rice (O. sativa L.)/G. Ramkumar, G.D. Prahalada, S.L. Hechanova, R. Vinarao, K.K. Jena//Mol. Breeding. 2015. V. 35. Pp. 129.
9. Identification of the Rice Blast Resistance Gene Pib in the National Small Grains Collection / M. RoyChowdhury, Y. Jia, M.H. Jia, R. Fjellstrom, R.D. Cartwright//Phytopatology. 2012. V. 102. № 7. Pp. 700-706.
10. Оценка линий риса c генами Pi-b, Pi-Z и Pi-40 на устойчивость к краснодарской популяции возбудителя пирикулярио-за (Piricularia oryzae) /И.И. Супрун, Е.С. Харченко, Л.И. Серая, В.С. Ковалев// Научный журнал КубГАУ. 2012. № 76(02).
11. The Pib gene for rice blast resistance belongs to the nucleotide binding and leucine-rich repeat class of plant disease resistance genes / M. Yano, U. Yamanouchi et al.// The Plant Journal. 1999. V.19. Pp. 55-64.
12. Murray M.G., Thompson W.F. Rapid isolation of high molecular weight plant DNA // Nucleic Acids Research. 1980. V. 10. Pp. 4321-4325.
13. Супрун И.И., Ильницкая Е.Т., Мухина Ж. М. Создание внутригенного ДНК-маркера гена устойчвости к пирикуляриозу риса PI-B и его использование в практической селекции// Сельскохозяйственная биология. 2007. № 5. С. 63-66.
14. Создание устойчивых к пирикуляриозу сортов риса с помощью ДНК-маркеров / П.И. Костылев, А.А. Редькин, Е.В. Краснова, Ж.М. Мухина, Е.В. Дубина//ВестникРАСХН. 2014. № 1. С.26-28.
15. Костылев П.И., Шилов И.А., Мухина Ж.М. Перенос пяти генов устойчивости риса к пирикуляриозу с помощью ДНК-маркеров // Вестник РАСХН. 2014. № 2. С. 33-35.
16. Контроль переноса пяти генов устойчивости риса к пирикуляриозу с помощью маркеров / П.И. Костылев, Ж.М. Мухина, А.В. Усатов, И.А. Шилов //Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины: материалы V междунар. научно-практич. конф. Ростов-на-Дону: Издательство ЮФУ, 2013. С.170-172.
IMPROVEMENT OF THE METHOD FOR IDENTIFICATION OF GENES OF RESISTANCE TO RICE
BLAST PI-TA AND PI-B
I.A. Shilov1, O. S. Kolobova1, Yu.V. Аniskina1, Т. V. Shalaeva1, N.S. Velishaeva1, P.I. Kostyilev2, E.V. Dubina3
1 All-Russia Institute of Agricultural Biotechnology, Timiryazevskaya ul., 42, Moskva, 127550, Russian Federation
2 All-Russian Research Institute of Grain Crops after I.G. Kalinenko, Nauchny Gorodok, 3, Zernograd, 347740, Russian Federation
3All-Russian Rice Research Institute, pos. Belozernyi, 3, Krasnodar, 350921, Russian Federation
Summary. Polymerase chain reaction (PCR) markers were developed long ago for the analysis of allelic status of blast resistance gene Pi-ta and Pi-b. We developed the technology to analyze the allelic status of these genes by RT-PCR. We studied 17 rice hybrids F2, obtained from the crossing of plants-donors of resistance to blast with Russian varieties in the strategy of pyramiding (300 plants). To design primers and probes for Pi-ta gene the nucleotide sequences of the dominant (variety Yashiro-mochi, AF207842) and recessive (variety Tsuyake, AY196754) alleles were used. To identify the allele state of Pi-b gene known primers (Suprun I.I., Il'nitskaya E.T., Mukhina Zh.M., 2007) were modified; we added one nucleotide on 3'-end to optimize the annealing temperature. To design probes we used nucleotide sequences AB026839 with resistance gene Pi-b and susceptible forms AP004048. PCR was carried out in 25 mcl of solution, containing PCR-buffer, 1.25 EU Taq-polymerase, 100 mcmol dNTP, 10 pmol of each primer, 5 pmol probes, 5 mcl of DNA solution. Amplification was carried out at 95 degrees, 10 min, 40 cycles. In resistant homozygous plants dominant for Pi-ta gene it was registered the growth of fluorescence in the FAM channel; in susceptible homozygous plants - in the R6G channel; in heterozygote - in both channels. The use of different fluorescent labels of probes enabled to use 96-well plates and a robotic pipette station. The developed systems were used in I.G. Kalinenko All-Russian Research Institute of Grain Crops during creation of rice varieties resistant to blast. It was selected 13 plants, homozygous for both genes Pi-ta and Pi-b, and homozygous forms, carrying these genes separately.
Keywords: rice, donor, blast resistance, Pi-ta gene, Pi-b gene, hybrid, marker, RT-PCR.
Author Details: I.A. Shilov, D.Sc. (Biol.), head of laboratory (e-mail: ishilov@rambler.ru); O.S. Kolobova, senior research fellow; Yu.V. Aniskina, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; T.V. Shalaeva, research trainee; N.S. Velishaeva, Cand. Sc. (Biol.), senior research fellow; P.I. Kostylev, D.Sc. (Agr.), head of laboratory (e-mail: p-kostylev@mail.ru); E.V. Dubina, Cand. Sc. (Biol.), leading research fellow (e-mail: lenakrug1@rambler.ru).
For citation: Improvement of the Method for Identification of Genes of Resistance to Rice Blast Pi-ta and Pi-b / I.A. Shilov, O. S. Kolobova, Yu.V. Aniskina, Т. V. Shalaeva, N.S. Velishaeva, P.I. Kostyilev, E.V. Dubina. Dostizheniya naukii tekhnikiAPK. 2016. V. 30. No. 8. Pp. 45-48 (in Russ.).
