CC BY
51
УДК 612ЛШЛ17.2+616.ШЛ1+616Л51.5]:612.592
СВЯЗЬ ДЕФОРМИРУЕМОСТИ ЭРИТРОЦИТОВ С ГЛИКИРОВАНИЕМ ГЕМОГЛОБИНА И ОБРАЗОВАНИЕМ МИКРОВЕЗИКУЛ
Григорий Яковлевич ЛЕВИН, Екатерина Геннадьевна СУХАРЕВА
ФГБУ Приволжский федеральный медицинский исследовательский центр Минздрава России 603155, г. Нижний Новгород, Верхневолжская наб., 18/1
Цель исследования - изучение зависимости степени гликирования НЬ и выраженности эритроцитарной микро-везикуляции от изменения деформируемости эритроцитов. Материал и методы. Эритроциты хранили при +4 оС в течение 28 суток. Использовали методы ультрацентрифугирования, определения содержания гликированного гемоглобина НЬА1с и деформируемости эритроцитов. Результаты и их обсуждение. В процессе консервации эритроцитов содержание в них, в их мембранах и микровезикулах НЬА1с увеличивается. Выявлена корреляционная зависимость между степенью возрастания НЬА1с, микровезикуляцией и снижением деформируемости эритроцитов.
Ключевые слова: гликированный гемоглобин НЬА1с, деформируемость эритроцитов, эритроцитарные микровезикулы, консервация эритроцитов.
Гемоглобин (НЬ) не только играет решающую роль в газообмене, но в значительной степени определяет также деформируемость эритроцитов, а значит, и микроциркуляцию. Нормальные эритроциты способны значительно деформироваться при прохождении через капилляры, не меняя при этом своего объема и площади поверхности, что поддерживает процессы диффузии газов на высоком уровне на протяжении всего микро-циркуляторного русла различных органов [1]. Деформируемость эритроцитов обусловлена такими факторами, как внутренняя вязкость (концентрация внутриклеточного НЬ), клеточная геометрия, эластические и вязкостные свойства мембраны, которые также в определенной степени связаны с наличием в ней НЬ, особенно его гликированной формы. Известно, что в процессе старения эритроцита содержание в нем НЬ изменяется, при этом концентрация НЬА1с нарастает [7]. Однако содержание НЬА1с, особенно внутримембранно-го, и связь его с деформируемостью эритроцитов в процессе консервации остается малоизученной.
В процессе старения эритроциты теряют часть мембраны за счет образования микровезикул (МВ). Ключевым событием в данном процессе является ослабление взаимодействия между цитоскелетом и плазматической мембраной [11]. Центральную роль в этом играет повышение
концентрации внутриклеточного Са2+ с последующим ингибированием флиппазы, поддерживающей асимметрию липидов, активацией скрам-блазы, ответственной за обмен липидов между внутренней и внешней сторонами мембраны [4]. Образование МВ, которое приводит к потере части мембраны, может являться, по-видимому, одной из причин ухудшения деформируемости эритроцитов при их консервации. Показано, что при хранении эритроцит теряет до 30 % своего объема и до 20 % Hb [3]. Известно, что in vivo МВ удаляются печенью, мышечной тканью, селезенкой, почками [13], однако при консервации эритроцитов, в условиях in vitro, МВ могут накапливаться и играть определенную роль в пост-трансфузионных реакциях. Способствовать этим процессам может гликирование Hb, увеличение концентрации HbA1c, особенно в мембранах эритроцитов, а также, что взаимосвязано, снижение деформируемости эритроцитов и изменение их морфологии. Эти вопросы остаются практически не изученными.
Целью настоящего исследования являлось изучение зависимости степени гликирования Hb, как внутриклеточного, так и внеклеточного, и выраженности эритроцитарной микровезикуляции в процессе консервации от изменения деформируемости эритроцитов.
Левин Г.Я. - д.м.н., проф., заслуженный деятель науки РФ, руководитель отделения гравитационной хирургии и гемодиализа, е-mail: levin@unn.ac.ru
Сухарева Е.Г. - младший научный сотрудник отделения гравитационной хирургии и гемодиализа, e-mail: ekaterina.syhareva@gmail.com
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ
Источником МВ являлись эритроциты, выделенные из крови 40 здоровых доноров следующим образом. Кровь заготавливали в растворе гемоконсерванта ЦФДА-1 (Green Cross Médical Corp., Республика Корея) в соотношении 4:1, центрифугировали в течение 7 минут при 300 g, удаляли обогащенную тромбоцитами плазму, оставшуюся кровь центрифугировали в течение 20 минут при 2500 g, отбирали оставшуюся плазму, удаляли лейкоцитарно-тромбоцитарную пленку. Эритроцитарную массу делили на 2 части. В первую часть (неотмытые эритроциты) добавляли гемоконсервант в соотношении 4:1 и хранили при +4 оС в течение 7, 14, 21 и 28 суток. Вторую часть эритроцитарной массы трижды отмывали физиологическим раствором (центрифугировали при 2585 g в течение 20 минут). Затем в нее также добавляли гемоконсервант (4:1) и хранили в тех же условиях (отмытые эритроциты).
На 7, 14, 21, 28 сутки хранения выделяли эритроцитарные МВ. Для этого к эритроцитам добавляли 1 мл трис-HCl буфера (pH 7,4) и центрифугировали при 2585 g в течение 20 минут. Надосадочную жидкость очищали от клеточного дебриса путем центрифугирования в течение 15 минут при 5000 g [8]. МВ осаждали с помощью ультрацентрифугирования на центрифуге Sorvall MX 150 Micro-Ultracentrifuge (Thermo Scientific, США) при 100000 g в течение 60 минут [6], осадок растворяли в Гемолитике («ЭЛТА», Россия).
На 7, 14, 21, 28 сутки хранения из эритроцитов также выделяли их мембраны следующим образом. 0,5 мл эритроцитов лизировали в 1,5 мл дистиллированной воды и центрифугировали при 21380 g в течение 20 минут. Затем надосадочную жидкость удаляли, вновь добавляли 1,5 мл дистиллированной воды, в ней ресуспензировали осадок и центрифугировали при тех же параметрах. Отмывание мембран от Hb таким образом повторяли 9 раз, пока надосадочная жидкость не становилась прозрачной.
Количество HbA1c в эритроцитах, их мембранах и МВ определяли с помощью набора «Гли-когемотест» («ЭЛТА», Россия) согласно инструкции, содержание Hb - гемихромным методом: 0,02 мл эритроцитарной массы, мембран или МВ растворяли в 5 мл 0,06%-го раствора додецил-сульфата Na, через 20 минут после полного растворения регистрировали оптическую плотность при X = 540 нм на спектрофотометре Spekol UV VIS (Zeiss, Германия).
Деформируемость эритроцитов определяли с помощью ригидометра [2]. Принцип его работы
заключается в следующем: суспензию эритроцитов помещают между двумя коаксиальными цилиндрами, создается ламинарный поток, в котором клетки деформируются (вытягиваются), и фиксируют в этом положении с помощью 0,8%-го раствора глютаральдегида. В поле зрения светового микроскопа подсчитывали количество деформированных (вытянутых) и недеформирован-ных эритроцитов, степень их деформируемости выражали в процентах от общего числа подсчитанных клеток.
Морфологию эритроцитов определяли на микроскопе Primo Star (Carl Zeiss, Германия). В поле зрения подсчитывали 100 клеток в 3 параллельных пробах, изменение формы эритроцитов (количество дискоцитов, эхиноцитов, сто-матоцитов, сфероцитов) в процессе хранения выражали в процентах от общего числа подсчитанных клеток.
Результаты исследований обработаны с использованием методов непараметрической статистики с применением критерия парных сравнений Вилкоксона и коэффициента ранговой корреляции Спирмена (rS).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Исследовали содержание НЬА1с в г/л и в процентах (по отношению к общему содержанию Hb) при консервации эритроцитов в течение 28 суток при 4 оС как в самих красных клетках крови, так и в их мембранах, а также в выделенных из них МВ.
Установлено, что соотношение концентраций НЬА1с и общего Hb в эритроцитах значительно изменяется в процессе консервации. К 7 суткам хранения содержание НЬА1с по отношению к общему Hb увеличивалось как в неотмытых, так и в отмытых эритроцитах (табл. 1). Количество НЬА1с, выраженное в г/л, возрастает в процессе консервации эритроцитов в еще большей степени, причем разница в степени возрастания в отмытых и неотмытых эритроцитах еще более значительна (см. табл. 1).
В процессе консервации эритроцитов содержание в их мембранах HbA1c также нарастает (как в процентах от общего Hb, так и в г/л) по сравнению с мембранами свежевыделенных клеток. Увеличение концентрации НЬА1с в мембранах неотмытых эритроцитов происходит в большей степени, чем в мембранах отмытых эритроцитов (табл. 2). Установлено, что степень нарастания содержания НЬА1с в процессе консервации в мембранах эритроцитов выше, чем в самих эритроцитах.
Таблица 1
Содержание НЬ и НЪА1с в эритроцитах при их консервации
Время консервации, сут Отмытые Неотмытые
НЪА^, % НЬ, г/л НЬА1с, г/л НЪА^, % НЬ, г/л НЬА1с, г/л
Контроль 6,33 ± 0,18 182 ± 7,3 11,5 ± 0,76 6,33 ± 0,15 182 ± 2,3 11,5 ± 0,22
1 6,88 ± 0,21* 221 ± 6,7* 15,2 ± 0,92* 6,74 ± 0,12* 186 ± 3,1 12,5 ± 0,27*
7 7,66 ± 0,24* 264 ± 3,2* 20,2 ± 0,88* 7,23 ± 0,23* 194 ± 4,4* 14,0 ± 0,78*
14 8,31 ± 0,12* 285 ± 5,4* 23,7 ± 1,11* 8,54 ± 0,14* 214 ± 6,5* 18,3 ± 0,49*
21 10,16 ± 0,54* 310 ± 5,3* 31,5 ± 2,04* 9,87 ± 0,30* 239 ± 2,1* 23,6 ± 0,37*
28 12,72 ± 0,63* 339 ± 7,5* 43,1 ± 2,48* 10,61 ± 0,04* 249 ± 4,3* 26,4 ± 0,54*
Примечание. Здесь и в табл. 2 * - отличие от величины соответствующего показателя в контроле статистически значимо при р < 0,05.
Таблица 2
Содержание НЪ и НЪА1с в мембранах эритроцитов при их консервации
Время консервации, сут Отмытые Неотмытые
НЬА1с, % НЬ, г/л НЬА1с, г/л НЬА1с, % НЬ, г/л НЬА1с, г/л
Контроль 6,15 ± 0,14 6 ± 0,3 0,37 ± 0,02 6,15 ± 0,10 6 ± 0,6 0,37 ± 0,05
1 6,99 ± 0,05* 8 ± 0,4 0,56 ± 0,05* 6,12 ± 0,07 13 ± 0,5* 0,80 ± 0,04*
7 7,10 ± 0,04* 12 ± 0,5* 0,85 ± 0,04* 6,55 ± 0,16* 16 ± 0,7* 1,03 ± 0,06*
14 7,92 ± 0,20* 14,0 ± 0,3* 1,13 ± 0,02* 6,90 ± 0,08* 19 ± 0,1* 1,31 ± 0,02*
21 8,84 ± 0,43* 21 ± 0,7* 1,84 ± 0,10* 8,00 ± 0,06* 22 ± 0,5* 1,73 ± 0,04*
28 9,97 ± 0,23* 23 ± 0,5* 2,29 ± 0,09* 11,16 ± 0,21* 26 ± 0,7* 2,94 ± 0,18*
Таблица 3 Содержание НЪ и НЪА1с в МВ эритроцитов при их консервации
Время консервации, сут Отмытые Неотмытые
НЬА1с, % НЬ,г/л НЬА1с, г/л НЬА1с, % НЬ, г/л НЬА1с, г/л
1 4,13 ± 0,26 3 ± 0,4 0,12 ± 0,05 4,04 ± 0,21 3 ± 0,2 0,12 ± 0,02
7 7,49 ± 0,19* 6 ± 0,5* 0,45 ± 0,04* 5,20 ± 0,19* 3 ± 0,3 0,18 ± 0,03*
14 7,85 ± 0,10* 8 ± 0,2* 0,60 ± 0,03* 7,08 ± 0,17* 5 ± 0,5* 0,35 ± 0,03*
21 10,23 ± 0,37* 11 ± 0,1* 1,12 ± 0,02* 8,93 ± 0,30* 7 ± 0,3* 0,62 ± 0,02*
28 10,20 ± 0,09* 12 ± 0,3* 1,26 ± 0,04* 9,86 ± 0,28* 8 ± 0,2* 0,78 ± 0,02*
Примечание. * - отличие от величины соответствующего показателя на 1 сутки хранения статистически значимо при р < 0,05.
При изучении содержания НЬА1с в МВ, выделенных из эритроцитов в процессе их консервации, установлено, что она приближается к концентрации НЬА1с в мембранах эритроцитов (табл. 3), повышаясь по мере увеличения длительности консервации эритроцитов. Однако степень нарастания более выражена в МВ, выделенных из отмытых эритроцитов (см. табл. 3).
В связи с важной ролью НЬ, а особенно НЬА1с, в деформируемости эритроцитов мы исследовали ее динамику в процессе консервации отмытых и неотмытых эритроцитов. Как показа-
ли проведенные исследования, деформируемость эритроцитов снижается уже к 7 суткам консервации, причем более значительно у предварительно отмытых красных клеток крови (на 30,4 % относительно контроля,р < 0,05). Это значение достигается у предварительно неотмытых эритроцитов лишь к 21 суткам (р < 0,05). В процессе консервации эритроцитов их деформируемость продолжает ухудшаться, а к 28 суткам она практически сравнивается у неотмытых и отмытых (в обеих пробах содержание деформированных клеток составляет в среднем 31 %).
Вопрос о роли увеличения концентрации вну-тримембранного Hb, прежде всего НЬА1с, в снижении взаимодействия между цитоскелетом и плазматической мембраной и образованием МВ остается малоизученным. Особенно важной становится эта проблема при консервации эритроцитов, при которой, как показано нами, происходит значительное увеличение везикуляции. Нами установлено, что количество МВ, выделенных из отмытых и неотмытых эритроцитов на 7 сутки консервации, соответственно в 2,7 и 2,0 раза больше, чем на первые сутки. В наших исследованиях показано, что в процессе консервации эритроцитов в них увеличивается концентрация НЬА1с, причем в большей степени в предварительно отмытых эритроцитах. Можно полагать, что это связано с повреждением эритроцитов при их многократном отмывании, а значит - с более ранними и более выраженными изменениями, происходящими в процессе консервации.
В мембранах неотмытых эритроцитов количество НЬА1с увеличивается в меньшей степени, чем в мембранах отмытых эритроцитов. Это могло быть связано со следующим. Образование МВ, по данным ряда авторов, представляет собой защитный механизм для удаления молекул, связанных с участками мембраны эритроцита, в том числе и измененного Hb и его токсических производных, что позволяет задерживать несвоевременное удаление здоровых эритроцитов из кровотока. Это приводит к продлению жизни эритроцитов in vivo [12]. Процесс везикуляции значительно сильнее в отмытых эритроцитах, при этом в большей степени удаляется из эритроцитов и переходит в МВ связанный с мембранами НЬА1с. Количество НЬА1с в МВ, выделенных из эритроцитов в процессе их консервации, постоянно нарастает. Однако принципиальной разницы в содержании НЬА1с (по отношению к общему Hb или выраженном в г/л) в МВ, выделенных из отмытых и неотмытых эритроцитов, не обнаружено. Связано это, прежде всего, с разницей в их концентрации. Количество МВ, выделенных из отмытых эритроцитов, в 1,3 раза превышает их количество из неотмытых эритроцитов на 7 сутки консервации и в 1,5 раза - на 28 сутки консервации. При пересчете концентрации НЬА1с на равное число МВ оказывается, что она значительно больше в МВ, выделенных из отмытых эритроцитов.
Разница в степени увеличения концентрации НЬА1с в эритроцитах и в их мембранах, выраженной в г/л и в процентах по отношению к общему Hb, объясняется следующим. В процессе консервации размер эритроцитов существенно умень-
шается, к 28 суткам число сфероцитов достигает 27 %, следовательно, при центрифугировании суспензии эритроцитов осаждается большее число консервированных эритроцитов по сравнению со свежевыделенными. Поэтому увеличение концентрации НЬА1с в эритроцитах и их мембранах в процессе консервации, выраженное в г/л, происходит в большей степени, чем выраженное в процентах по отношению к общему НЬ.
При исследовании динамики деформируемости эритроцитов в процессе их консервации установлено ее прогрессивное и значительное снижение, причем более выраженное в предварительно отмытых и хранящихся в консерванте эритроцитах. Одной из причин этой разницы является, по-видимому, нарушение структуры мембран эритроцитов, связанное с более значительным образованием МВ в отмытых эритроцитах, что указывалось ранее. В условиях банка крови на первый план в изменении деформируемости выступает уменьшение объема эритроцитов, связанное с потерей части мембраны на образование МВ.
При исследовании изменения морфологии эритроцитов установлено следующее. В процессе консервации прогрессивно уменьшается количество дискоцитов, нарастает число сфероцитов, эхиноцитов и в меньшей степени стоматоцитов. Уже в первую наделю консервации развивается выраженный анизоцитоз. При небольших сроках консервации диск-сферическая трансформация эритроцитов значительно более выражена в отмытых красных клетках крови (р < 0,05, в сравнении с контролем). В поздние сроки (к 21 суткам хранения) морфология отмытых и неотмытых эритроцитов практически сравнивается (р < 0,05, при сравнении процента содержания дискоцитов, эхиноцитов, стоматоцитов и сфероцитов в отмытой и неотмытой пробах).
Известно, что деформируемость эритроцитов зависит от сложного взаимодействия клеточного объема, площади поверхности, внутриклеточной вязкости и вязкоэластических свойств мембраны [5, 9]. Ухудшение деформируемости эритроцитов в процессе консервации происходит параллельно с нарастанием количества МВ, а также с увеличением гликирования НЬ как в самих эритроцитах, так и в их мембранах. Показано, что существенным фактором ухудшения деформируемости эритроцитов при сахарном диабете является значительное увеличение внутриэритроцитарной вязкости, связанное с изменением свойств НЬ вследствие его гликирования [10]. Такой же процесс происходит и при консервации эритроцитов. Не менее важную роль в снижении деформиру-
емости эритроцитов играет повышение содержания НЬА1с в мембранах эритроцитов при их консервации, что обусловливает ухудшение их вязкоэластических свойств. Нами установлена высокая корреляционная взаимосвязь между изменением деформируемости эритроцитов, количеством МВ и содержанием НЬА1с как в самих эритроцитах, так и в их мембранах. В процессе консервации красных клеток крови наибольшая корреляция выявлена между динамикой деформируемости эритроцитов в процессе консервации и содержанием НЬА1с как в самих эритроцитах, так и в мембранах отмытых эритроцитов -г3 = -0,95 (р < 0,05). Коэффициент корреляции между этими показателями в неотмытых эритроцитах был чуть меньше г3 = -0,87 (р < 0,05). Кроме того, обнаружена тесная корреляционная зависимость между числом МВ и динамикой деформируемости эритроцитов в процессе консервации, г3 = -0,93 (р < 0,05). Таким образом, доказана четкая взаимосвязь между гликированием НЬ в процессе консервации эритроцитов, ухудшением деформируемости красных клеток крови и образованием эритроцитарных МВ.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В процессе консервации эритроцитов содержание в них и в их мембранах НЬА1с прогрессивно увеличивается, причем в большей степени в предварительно отмытых красных клетках крови. Это является одной из важных причин повыше -ния количества выделяющихся из эритроцитов МВ и нарастания концентрации в них НЬА1с. При консервации эритроцитов значительно снижается деформируемость эритроцитов, причем в большей степени при их предварительном отмывании. Выявлена тесная корреляционная зависимость между степенью снижения деформируемости эритроцитов в процессе их консервации и степенью возрастания в них НЬА1с. Резкое снижение деформируемости эритроцитов при их консервации обусловлено не только ухудшением вязкоэластичных свойств их мембраны, но также повышением внутриклеточной вязкости и нарушением геометрии красных клеток крови. Можно заключить, что гликирование НЬ и увеличение его содержания, прежде всего в мембранах эритроцитов, является важной причиной возрастания микровезикуляции и снижения деформируемости эритроцитов в процессе их консервации.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Зинчук В.В. Деформируемость эритроцитов: физиологические аспекты // Успехи физиол. наук. 2001. 32. (3). 66-78.
2. А.с. № 1363065. Россия. Устройство для деформации эритроцитов в сдвиговом потоке / Г.Я. Левин, В.Г. Яхно, Н.Н. Царевский, Н.П. Котя-ева; опубл. 30.12.87.
3. Bosch F.H., Were J.M., Roerdinkholder-Stoelwinder B. et al. Characteristics of red blood cell populations fractionated with a combination of counter flow centrifugation and Percoll separation // Blood. 1992. 79. 254-260.
4. Cerella C., Diederich M., Ghibelli L. The dual role of calcium as messenger and stressor in cell damage, death, and survival // Int. J. Cell Biol. 2010. 2010. doi: 10.1155/2010/546163.
5. Chien S. Red cell deformability and its relevance to blood flow // Ann. Rev. Physiol. 1987. 49. 177-192.
6. Chung S.-M., Bae O.-N., Lim K.-M. et al. Lysophosphatidic acid induces thrombogenic activity through phosphatidylserine exposure and procoagulant microvesicle generation in human erythrocytes // Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 2007. 27. S414-S421.
7. Cohen R.M., Franco R.S., Khera P.K. et al. Red cell life span heterogeneity in hematologically normal people is sufficient to alter HbA1c // Blood. 2008. 112. (10). 4284-4291.
8. Dey-Hazra E., Hartel B., Kirsch T. et al. Detection of circulating microparticles by flow cytometry: influence of centrifugation, filtration of buffer, and freezing // Vasc. Health Risk Manag. 2010. 6. 11251133.
9. Mohandas N., Chasis J.A. Red blood cell deformability, membrane material properties and shape: regulation by transmembrane, skeletal and cytolic proteins and lipids // Semin. Hematol. 1993. 30. 171-192.
10. Sorette M.R., Lavenant M.G., Clark M.R. Ektacytometric measurement of sickle cell defor-mability as a continuous function of oxygen tension // Blood. 1987. 69. (1). 316-323.
11. Tissot J.-D., Rubin O., Canellini G. Analysis and clinical relevance of microparticles from red blood cells // Cur. Opin. Hematol. 2010. 17. 571-577.
12. Willekens F.L.A., Werre J.M., Groenen-Döpp Y.A.M. et al. Erythrocyte vesiculation: a self-protective mechanism? // Br. J. Haematol. 2008. 141. 549-556.
13. Willekens F.L.A., Werre J.M., Kruijt J.K. et al. Liver Kupffer cells rapidly remove red blood cell-derived vesicles from the circulation by scavenger receptors // Blood. 2005. 105. 2141-2145.
RELATIONSHIP BETWEEN ERYTHROCYTE DEFORMABILITY WITH GLYCATION OF HEMOGLOBIN AND THE FORMATION OF MICROVESICLES
Grigory Yakovlevich LEVIN, Ekaterina Gennad'evna SUKHAREVA
Privolzhsky Federal Research Medical Centre of Minzdrav of Russia 603155, Nizhny Novgorod, Verhne-Volzhskaya nab., 18/1
Purpose of the research: to study the level of dependence of hemoglobin glycation and erythrocyte microvesiculation severity on changes in erythrocytes. Materials and Methods: erythrocytes were stored at 4 °C for 28 days. The methods of ultracentrifugation, determination of HbAlc and deformability of erythrocytes have been used.. Results: The content of HbAlc in the erythrocyte, in their membranes and in the micro vesicles has been increased in the process of erythrocytes conservation. The correlation between the degree of increase of HbA1c, microvesiculation and decrease of erythrocyte deformability has been revealed.
Key words: glycated hemoglobin, erythrocyte deformability, erythrocyte micro vesicles, conservation of erythrocytes.
Levin G.Ya. - doctor of medical sciences, professor, honored worker of science, head of department of gravitation surgery and hemodialysis
Sukhareva E.G. - junior researcher of department of gravitation surgery and hemodialysis
