CC BY
379
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 616.155.1-073.175
Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Цветаева Н.В., Никулина О.Ф., Атауллаханов Ф.И.
МЕТОД ИССЛЕДОВАНИЯ РАСПРЕДЕЛЕНИЯ ЭРИТРОЦИТОВ ПО ПЛОТНОСТИ. ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
ФГБУ Гематологический научный центр Минздрава России, 125167, Москва
Описан фталатный метод исследования распределения эритроцитов по плотности (РЭПП) и продемонстрированы его возможности. РЭПП осуществляется путем центрифугирования крови в микрогематокритных капиллярах в присутствии смесей диметил- и дибутилфталатов известной плотности. Описано получение клинически значимых параметров РЭПП — средней плотности эритроцитов, ширины РЭПП, легкой и тяжелой фракций эритроцитов, максимума кривой РЭПП. Рассмотрены причины отклонения РЭПП от нормы при различных патологических состояниях. Подробно описан синдром дегидратации эритроцитов. Описан простой и доступный метод получения РЭПП. Показано, что анализ РЭПП позволяет определить характер происходящих с эритроцитами изменений. Мониторинг параметров РЭПП позволяет оценить динамику патологического процесса и эффективность терапии.
Ключевые слова: эритроциты; распределение эритроцитов по плотности; синдром дегидратации эритроцитов.
E.S. Shurkhina, V.M. Nesterenko, N.V. Tsvetayeva, O.F. Nikulina, F.I. Ataullakhanov
THE METHOD OF ANALYSIS OF DISTRIBUTION OF ERYTHROCYTES BY DENSITY: PRACTICAL GUIDELINES
The article describes the phthalate method of analysis of distribution of erythrocytes by density and demonstrates its possibility. The distribution of erythrocytes by density is implemented using centrifugation of blood in micro-hematocrit capillaries in presence of compounds of dimethyl- and dibuthylphthalates of known density. The acquisition of such clinically reliable parameters of distribution of erythrocytes by density as mean density of erythrocytes, width of distribution of erythrocytes by density, light and heavy fraction of erythrocytes and maximum of curve of distribution of erythrocytes by density is described. The causes of deviation of distribution of erythrocytes by density from standard values under various pathological conditions are considered. The syndrome of dehydration of erythrocytes is described in details. The simple and accessible method of acquisition of distribution of erythrocytes by density is described. It is demonstrated that analysis of distribution of erythrocytes by density makes it possible to determine character of changes occurring with erythrocytes. The monitoring of parameters of distribution of erythrocytes by density allows evaluating dynamics of pathological process and effectiveness of therapy.
Keywords: erythrocytes; distribution of erythrocytes by density; syndrome of dehydration of erythrocytes.
Введение. Циркулирующие в крови эритроциты не являются одинаковыми, а отличаются друг от друга по объему, площади поверхности, деформируемости, содержанию и концентрации гемоглобина, морфологии и по многим другим параметрам. В норме различия между эритроцитами определяются их возрастом. При патологии свойства популяции эритроцитов меняются. Количественную характеристику популяции эритроцитов можно получить, измеряя их распределения по свойствам — по объему, форме, осмотической резистентности, плотности и т.д. В настоящей работе дано подробное описание метода получения распределения эритроцитов по плотности (РЭПП), приведены примеры РЭПП, характерные для различных патологий, клинически значимые параметры РЭПП, которые можно использовать для диагностики, оценки эффективности терапии и выявления доклинических признаков заболевания.
Материалы и методы. РЭПП получают путем гравитационного разделения суспензии эритроцитов с помощью маркеров плотности — не смешивающихся с водой жидкостей или частиц, обладающих известной плотностью [1]. Мы использовали для разделения эритроцитов по плотности смеси диметил- и дибутилфталатов [2].
Кровь для исследований берется из локтевой вены. В качестве антикоагулянта используется литиевая или натриевая соль гепарина (15—20 МЕ на 1 мл крови). Для исследования достаточно 4 мл крови. Пробирка должна быть заполнена кровью более чем на 50% и плотно закрыта для предотвра-
Для корреспонденции:
Шурхина Екатерина Семеновна, науч. сотр. Адрес: 125167, Москва, Новый Зыковский пр., 4 E-mail: shurkhina@mail.ru
щения газообмена. В стерильной пробирке кровь может храниться 5—6 ч при комнатной температуре. При длительном хранении рН крови может снижаться вследствие увеличения лактата.
Объемы дибутилфталата (У1 ) и диметилфталата (У2) для приготовления смеси требующейся плотности (ах) рассчитываются по формуле:
d = -
d1V1 + d2V2 V + V,
где d1 — плотность дибутилфталата — 1,045 г/мл; d2 — плотность диметилфталата — 1,190 г/мл. Плотность каждой последующей смеси фталатов (0+) отличается от плотности предыдущей смеси фталатов (аЩ) на 0,004 г/мл.
Стеклянный гематокритный капилляр (длина 70—75 мм) заполняется смесью фталатов на 3—4 мм, а затем исследуемым образцом крови (высота столбика около 50 мм). Кровь перед этим следует перемешать, осторожно перевернув пробирку не менее пяти раз. Затем открыть пробирку с кровью и, держа ее в наклонном положении, обмакнуть в нее кончик капилляра (кончик, который перед этим обмакивался в смесь фталатов). Заполнение капилляра кровью остановить, когда до конца капилляра останется около 20 мм. Сухой конец капилляра герметизируется с помощью специальной пасты или запаивается.
Центрифугирование заполненных кровью капилляров осуществляется в микрогематокритной центрифуге (8—12 тыс. об/мин в течение 7—8 мин). В этих условиях эритроциты, имеющие плотность выше, чем плотность смеси фта-латов, оказываются в нижней части капилляра и отделяются от более легких клеток и плазмы смесью фталатов (рис. 1).
Фталатный метод Данон-Мариковского
I
и
И!!!!!
10 11 12
_) Смесь д и метил- и дибутилфталата
Рис. 1. Разделение эритроцитов по плотности в гематокрит-ных капиллярах, содержащих смеси фталатов. Слева — гематокритный капилляр, заполненный смесью фталатов и кровью до центрифугирования. Справа — 7 гематокритных капилляров, содержащих кровь и смеси фталатов различной плотности (от 1,088 до 1,112 г/мл) после центрифугирования (нумерация капилляров в порядке возрастания плотности смеси фталатов).
Высота столбика эритроцитов, находящегося над фтала-том Т (верхняя фракция) и под фталатом В (нижняя фракция), измеряется с точностью 0,1 мм и находится процентное содержание верхней фракции эритроцитов для каждого гема-токритного капилляра (7%).
Т% = Т /(7+В)100.
Определяется процент клеток, выходящих за пределы нормы: Ь — легкая фракция, состоящая из ретикулоцитов (с1<1,088 г/мл); Б — тяжелая фракция, состоящая из дегидратированных клеток, сферо- и микросфероцитов (сС>1,112 г/мл).
Затем строится интегральное распределение эритроцитов по плотности: по оси X откладывается плотность смеси фталатов, а по оси У — Т% (рис. 2).
Это рабочий график, который используется для получения средней плотности эритроцитов и ширины РЭПП. Для этого кривая аппроксимируется функцией Больцмана (сиг-моида) и находятся: ( — средняя плотность эритроцитов; Ж — ширина РЭПП — интервал плотности, в который попадает 60% эритроцитов (исключаются 20% самых легких и 20% самых тяжелых клеток). На рис. 2 ( = 1,100 г/мл; Ж = 0,005 г/мл (1,102—1,097 г/мл). ^
Для получения дифференциального распределения эритроцитов по плотности, которое в дальнейшем называется просто РЭПП, по оси X откладывается плотность [(«+1) - «]/2 , а по оси У — объмный процент эритроцитов, попадающий в интервал плотности [(«+1) - «].
% ■
T %,
n 3
Объемный % эритроцитов = Т«+1
где Т« и Т«+1 — фракции эритроцитов, оказывающиеся после центрифугирования над смесью фталатов с плотностями (3п и ( ,, г/мл соответственно.
1тах — максимум на кривой РЭПП — максимальное количество эритроцитов, выраженное в процентах, попадающих в интервал плотности [(«+1) - «] г/мл;
Результаты и обсуждение. 1. Параметры РЭПП в норме. На рис. 3 приведены дифференциальные распределения эритроцитов по плотности, а в таблице параметры РЭПП, полученные для условно здоровых мужчин и женщин в возрасте от 22 до 40 лет. В норме эритроциты распределены по плотности в интервале 1,086—1,112 г/мл [3]. Самые легкие клетки — ретикулоциты, средний объем которых на 24—35% больше среднего объема эритроцитов, а концентрация гемоглобина примерно на 17% ниже, чем в зрелом эритроците.
При старении плотность эритроцитов увеличивается. Это объясняется тем, что за время жизни эритроцита (при условии сохранения целостности мембраны) содержание в нем гемоглобина практически не изменяется [4], а объем постепенно уменьшается вследствие дегидратации [5], что приводит к увеличению концентрации внутриклеточного гемоглобина, а следовательно, к увеличению плотности эритроцитов [6]. Небольшое различие между РЭПП у женщин и мужчин (см. рис. 3) объясняется омоложением популяции эритроцитов у женщин вследствие ежемесячной кровопотери.
2. Факторы, влияющие на результат измерения РЭПП. Объем эритроцитов зависит от рН и осмолярности окружающей эритроцит среды. В кислой среде объем эритроцитов увеличивается, а в щелочной — уменьшается [7]. In vitro кровь защелачивается вследствие выхода СО2 и плотность эритроцитов увеличивается (рис. 4).
Для того чтобы значение рН крови не менялось в течение нескольких часов, нужно хранить образец в закрытой пробирке, заполненной кровью более чем на 50%, или в шприце, оставив пузырек воздуха для перемешивания. Во время заполнения капилляров рН крови меняется не более чем на 0,05. При длительном хранении значение рН крови определяется содержанием СО2 и лактата. В норме рН взятой из вены крови находится в интервале значений рН 7,2—7,3 (измерения проводились на анализаторе КЩС при 37оС). При некоторых патологиях рН крови больных может меняться (например, ацидоз при диабете). В таком случае рекомендуется измерять рН крови после заполнения капилляров и сопоставлять результаты с РЭПП контрольных эритроцитов, полученном при таком же значении рН. Можно исследовать эритроциты отмытые стандартным буферным раствором. При этом следует учитывать, что отмывка может привести
100 -
СП о.
-е-
S" я о е
£ s 60Н
0 =г с о
а. ,s t
1
х о
Q.
ш
80-
40
20-
0-
Sigmoidal(Boltzman) fit
lnit(A1)-1,8366 3,13 Final(A2) 97,767 2,48 XatY50(x0) 1,0999 3.29E-4 Width(dx) 0,0018054 3,31 E-4
XatY20 1,09739 XatY80 1,10239
1,085 1,090 1,095 1,100 1,105 1,110 1,115 Плотность смеси, г/мл
Рис. 2. Интегральное распределение эритроцитов по плотности.
Точка — экспериментальные результаты, сплошная линия — аппроксимация функцией Больцмана.
Зрелые эритроциты
1,08
1,12
Рис. 3 норме.
1,09 1,10 1,11
Плотность эритроцитов, г/мл ■о - Норма муж. —♦— Норма жен.
Распределение эритроцитов по плотности (РЭПП) в
1,09 1,10 1,11 Плотность эритроцитов, г/мл --•■■■■ Норма
-о- рН 7,30; рС02 47,4% -о- рН 7,59; рС02 15,1% -♦- рН 7,68; рС02 9,7%
Рис. 4. Изменение РЭПП при контакте крови с воздухом. 1 — венозная кровь, хранившаяся в закрытом флаконе; 2 — перемешивание крови в открытом флаконе в течение 20 мин; 3 — перемешивание крови в открытом флаконе в течение 80 мин.
50
40
З'
о о.
а.
т
30
„с- 20
ю О
10
■■■■□■■■■ Норма
ж —•— До операции
А —о— Через 2 над
после операции
V. - \ 2
1,13
1,07 1,08 1,09 1,10 1,11 1,12 Плотность эритроцитов, г/мл
Рис. 5. РЭПП больного до и через 2 нед после операции, сопровождающейся кровопотерей 900 мл.
Легкая фракция эритроцитов (Ь) до операции — 1,4 об.%, после операции — 23,1 об.%; ширина РЭПП (Ж) до операции 0,007 г/мл, после операции — 0,011 г/мл.
к изменению свойств популяции эритроцитов (уменьшить агрегацию, спровоцировать гемолиз и т.д.), что приведет к потере информации.
В норме осмолярность крови поддерживается в интервале 280—290 мОсм. При патологии осмолярность крови больных может меняться. В таком случае рекомендуется исследовать эритроциты, отмытые стандартным буферным раствором, или сопоставлять результаты с РЭПП контрольных эритроцитов, полученном при таком же значении осмолярности.
Количество клеток, прошедших через слой фталата, зависит от времени центрифугирования, скорости вращения ротора центрифуги и его температуры. Повышение температуры, влияющее на фазовый состав липидного бислоя и проницаемость мембраны для катионов, может привести к изменению плотности как эритроцитов, так и фталатов. Поэтому нужно следить за тем, чтобы микрогематокрит-ная центрифуга не перегревалась. Оптимальным является использование термостатируемой микрогематокритной центрифуги. Перед внедрением метода следует получить результаты для контрольной группы доноров в выбранных условиях.
3. Отклонение РЭПП от нормы. Возможные причины. В норме РЭПП является близким к нормальному (симметричному) распределению (см. рис. 3). При различных патологиях нарушается симметрия и меняются параметры РЭПП.
При ретикулоцитозе (гемолитические анемии, активация эритропоэза после кровопотери и т.д.) увеличивается легкая фракция эритроцитов — Ь, состоящая из ретикулоцитов и молодых эритроцитов, что приводит к уменьшению сред-
■■>■■■ Норма -•— Кровь -о— Отмытые эритроциты
1,09 1,10 1,11 1,12 Плотность эритроцитов, г/мл
Рис. 6. РЭПП больного с увеличенной агрегацией эритроцитов. В крови 1тах = 68,5 об.%; Ж = 0,003 г/мл.
ней плотности эритроцитов — а и увеличению ширины РЭПП — Ж (рис. 5). ср
Агглютинация и агрегация эритроцитов приводят к уменьшению Ж и увеличению 1тах (рис. 6). Это происходит потому, что при слипании легких и тяжелых эритроцитов образуются конгломераты с усредненной плотностью. Агрегация и агглютинация (опосредованная антителами агрегация) эритроцитов наблюдаются при воспалениях, кардиоваску-лярных заболеваниях, уремии, вирусных инфекциях, аутоиммунной гемолитической анемии и при ряде других заболеваний. На рис. 6 изображено РЭПП больного с сосудистой патологией, у которого была увеличена агрегация эритроцитов (время образования линейных агрегатов 5,8 с, норма 7,6±0,24 с; гидродинамическая прочность агрегатов 38,4 с-1, норма 31,9±1,4 с-1). После отмывки эритроцитов агрегаты распадаются и РЭПП приближается к норме.
Увеличение плотности эритроцитов наблюдается при увеличении уровня внутриклеточного ионизированного кальция. В состоянии покоя в цитоплазме эритроцитов поддержи-
Параметры РЭПП в норме
Наименование параметра (пояснения в тексте) Мужчины Женщины
а, г/мл ср' 1,099±0,001 1,098±0,001
Ь, % (это ретикулоциты, молодые эритроциты или гипохромные эритроциты) 0,7±0,5 0,8±0,4
Д % (это гиперхромные эритроциты — дегидратированные клетки, сферо- и микросфероциты) 0,3±0,3 0,5±0,5
Ж, г/мл (характеризует гетерогенность популяции эритроцитов) 0,006±0,001 0,005±0,001
1тах, % (максимальное количество эритроцитов, выраженное в процентах, попадающих в узкий интервал плотности (0,004 г/мл))
Причины увеличения 1тах:
— увеличение агрегации (часто при флегмонах, фурункулах, карбункулах) или агглютинации (на начальном этапе АИГА) эритроцитов;
— активация эритропоэза, приводящая к увеличению в крови клеток одного возраста;
— патологические изменения формы и поверхностных свойств клеток, влияющие на их разделение по плотности 43,7±4,0 51,8± 5,4
ш
е
5 Я О а.
ю О
■о-- Норма
1,08
1,12
1,09 1,10 1,11
Плотность эритроцитов, г/мл
Рис. 7. РЭПП больного с гнойным воспалением коленного
1,09 1,10 1,11 1,12
Плотность эритроцитов, г/мл -О- Норма -о- СЦ-20%; D 27,2% W-0,010 г/мл -•- МСЦ-55%; D48,6% W-0,020 г/мл
Рис. 8. РЭПП 2 больных с наследственной сфероцитарной анемией.
Сфероциты (СЦ) и микросфероциты (МСЦ) — гиперхромные сферические эритроциты, равномерно окрашенные (без центрального просветления) в мазке крови и различающиеся по размеру.
вается низкая концентрация ионов Са2+ (10-4 мМ). В ответ на внутри- или внеклеточные сигналы в определенных участках цитоплазмы увеличивается концентрация ионов Са2+, которые входят внутрь клетки из внеклеточного пространства или освобождаются из внутриклеточных запасов. Одним из последствий увеличения уровня внутриклеточного ионизированного кальция является открытие кальцийзависимых калиевых каналов (Гардос-каналов) [9, 10]. Гардос-канал — это белок, встроенный в мембрану эритроцита. Если канал открыт, то ионы калия по градиенту концентрации начинают выходить из клетки. Для сохранения электронейтральности и осмотического равновесия вместе с ионами калия из клетки выходят ионы хлора и молекулы воды. В результате клетка сжимается, ее плотность увеличивается.
К настоящему времени описано много факторов, провоцирующих открытие Гардос-каналов в исходно "здоровых" эритроцитах: свободные радикалы [11], цитокины (проста-гландин Е2, ET-1 (endothelin-1); IL-10 (interleukin-10); PAF (platelet activator factor) [12—14], некоторые лекарства: пропранолол [15], некоторые антибиотики и химиотерапев-тические препараты и т.д. Поэтому увеличение плотности эритроцитов (синдром дегидратации эритроцитов) наблюдается при многих заболеваниях — воспалениях (рис. 7), перегрузке организма железом [18 ], снижении антиокси-дантной защиты эритроцитов вследствие дефицита Г6ФД [3, 18 ] и т.д.
Если дегидратация сопровождается микровезикуляцией, образуются клетки с уменьшенным отношением поверхно-
ш о
З1
о о.
5
о.
т
ю О
60-
50-
40
Норма Больная Г. Больная К. Больная X.
1,08 1,09 1,10 1,11 1,12 Плотность эритроцитов, г/мл
Рис. 9. РЭПП 3 больных с пиропойкилоцитозом.
1,13
m о
я о а. I-
ю О
1,09 1,10 1,11 1,12
Плотность эритроцитов, г/мл
—•— Норма
2 года принимала препараты Ре, 4 мес перерыв -о- 06.02.02
Не принимала препараты Ре -о- 14.11.02
1 год принимала препараты Ре 20.05.04
Рис. 10. Динамика изменения РЭПП больной с ЖДА во время лечения.
сти к объему (сферо- и микросфероциты). Эти клетки обладают ухудшенной деформируемостью и секвестрируются селезенкой, что приводит к анемии. Как видно на рис. 8 и 9, при микросфероцитозе и пиропойкилоцитозе наблюдается значительное увеличение ширины РЭПП (Ж) и тяжелой фракции эритроцитов (П).
Если дегидратация не сопровождается микровезикуля-цией, то образуются эритроциты с увеличенной внутриклеточной вязкостью и увеличенным отношением площади поверхности к объему. Такие эритроциты обладают повышенной механической хрупкостью [16], что может приводить к повышению свободного гемоглобина. Они способны вызывать окклюзию капилляров, что наблюдается при серповидно-клеточной анемии [17].
Уменьшение содержания и концентрации гемоглобина в эритроцитах приводит к уменьшению их плотности, РЭПП сдвигается влево [3, 19]. Уменьшение плотности эритроцитов характерно для железодефицитной анемии (ЖДА) (рис. 10), сидеробластной анемии, гемоглобинопатий [19 ]. На рис.10 видно, что при ЖДА анализ РЭПП можно использовать для оценки эффективности терапии. После 2-летнего лечения препаратами железа РЭПП больной было близким к норме. Через 9 мес после прекращения лечения плотность эритроцитов уменьшилась. Одного года лечения препарата-
100-,
60 -,
♦■-- Норма -•— Кровь -п— Отмытые эритроциты
I ♦ '-f-г—и-1-1-•-Г»-'-Т-'"VT-V—I-'-1
1,080 1,085 1,090 1,095 1,100 1,105 1,110 1,115 1,120 1,125 Плотность эритроцитов, г/мл
Кровь АИГА МСЦ
1,080 1,090 1,100 1,110 1,120 1,130 1,085 1,095 1,105 1,115 1,125
Плотность эритроцитов, г/мл
Норма
1,080 1,085 1,090 1,095 1,100 1,105 1,110 1,115 1,120 1,125 Плотность эритроцитов, г/мл
♦■■■ Норма
1,080 1,090 1,100 1,110 1,120 1,130 1,085 1,095 1,105 1,115 1,125
Плотность эритроцитов, г/мл
Рис. 11. РЭПП на разных этапах АИГА. Пунктирной линией изображено РЭПП в норме, полученное для контрольной группы доноров.
а — агглютинация; б — умеренная дегидратация эритроцитов; в — значительная дегидратация эритроцитов; г — ретикуло-цитоз (Ret 50%).
ми железа оказалось недостаточно для того, чтобы РЭПП вернулось к исходному значению.
Весь спектр изменений РЭПП наблюдается при аутоиммунной гемолитической анемии (АИГА) [8, 20]. Накопление антител на мембране приводит к снижению заряда эритроцитов и их слипанию — агглютинации, которая приводит к уменьшению ширины РЭПП и увеличению 1тах (рис. 11, а). Изменения исчезают после отмывки суспензии эритроцитов. Увеличение внутриклеточного ионизированного кальция под влиянием атакующего мембрану комплекса из компонентов комплемента приводит сначала к умеренному увеличению плотности эритроцитов (рис. 11, б), а затем к более выраженным изменениям, обусловленным сочетанием микровезику-ляции и дегидратации. В крови больных появляются клетки с плотностью более 1,114 г/мл, и РЭПП становится похожим на РЭПП при микросфероцитозе (рис. 11, в). Снижение гемоглобина приводит к ретикулоцитозу (увеличивается легкая фракция эритроцитов — Ь) (рис. 11, г).
Заключение. Анализ РЭПП позволяет расширить информацию о свойствах эритроцитов при различных патологиях, контролировать эффективность терапии, объяснить, какие механизмы ответственны за наблюдаемые изменения, что в дальнейшем может быть использовано для диагностики и коррекции терапии.
Исследование РЭПП позволяет выявить патологию на доклиническом этапе, т. е. когда еще нет падения гемоглобина,
ретикулоцитоза, признаков гемолиза и т.д. РЭПП меняется при всех видах анемий, при нарушениях обмена железа, при воспалениях, под влиянием ряда лекарств и т.д. Анализ параметров РЭПП позволяет оценить долю патологически измененных эритроцитов и степень их повреждения. Мониторинг изменений параметров РЭПП позволяет оценить динамику патологического процесса [20]. В ГНЦ исследование РЭПП включено в программу мониторинга больных АИГА. Наибольший интерес представляет оценка тяжелой фракции эритроцитов, поскольку увеличение тяжелой фракции является признаком активации патологического процесса. Авторы [17] выявили корреляцию между тяжелой фракцией эритроцитов и клиническими проявлениями при серповидно-клеточной анемии.
Однотипность изменений РЭПП при сфероцитозе, ова-лоцитозе, пиропойкилоцитозе и ксероцитозе (увеличение ширины РЭПП и тяжелой фракций эритроцитов) позволяют использовать этот тест для скрининговой диагностики мембранопатий. Исключение составляет стоматоцитоз. При этом заболевании РЭПП незначительно отличается от нормы. При анализе результатов следует учитывать, что средняя плотность эритроцитов является информативным показателем, если ширина РЭПП находится в пределах нормы. Если у больного увеличена ширина РЭПП за счет увеличения как легкой, так и тяжелой фракции эритроцитов, то средняя плотность может оказаться в пределах нормы.
ЛИТЕРАТУРА
1. Levine R.A., Wardlaw S.C. Detecting specific medical conditions from erythrocyte density distrubition in a centrifuged anticoagulated whole blood sample. US Patent 5705739 Issued on January 6, 1998.
2. Danon D., Marikovsky Y. Determination of density distribution of red cell population. J. Lab. Clin. Med. 1964; 64: 668—73.
3. Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Колодей C.B., Цветаева Н.В., Ермакова Т.А., Никулина О.Ф. и др. Распределение эритроцитов по плотности при различных видах анемий. Терапевтический архив. 2009; 81(1): 48—51.
4. Lew V.L., Raftos J.E., Sorette M., Bookchin R.M., Mohandas N. Generation of normal human red cell volume, hemoglobin content, and membrane area distributions by 'birth' or regulation? Blood. 1995; 86: 334—41.
5. Waugh R.E., Mohandas N., Jackson C.W., Mueller T.J., Suzuki T., Dale G.L. Rheologic properties of senescent erythrocytes: loss of surface area and volume with red blood cell age. Blood. 1992; 79: 1351—8.
6. Lutz H.U. Red cell density and red cell age. Blood Cells. 1988; 14: 76—80.
7. Swietach P., Tiffert T., Mauritz J.M.A., Seear R., Esposito A., Kaminski C.F. et al. Hydrogen ion dynamics in human red blood cells. J. Physiol. 2010; 588: 4995—5014.
8. Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Лисовская И.Л., Цветаева Н.В., Колодей C.B., Никулина О.Ф., Атауллаханов Ф.И. Выявление этапов аутоиммунной гемолитической анемии с помощью исследования деформируемости и плотности эритроцитов. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2004; 138(9): 316—9. (Shurkhina E.S., Nesterenko V.M., Lisovskaya I.L., Tsvetaeva N.V., Kolodei S.V., Nikulina O.F., Ataullakhanov F.I. Detection of stages of autoimmune hemolytic anemia by evaluating erythrocyte deformability and density. Bulletin of Experimental Biology andMedicine. 2004; 138 (9): 280—3. in Russian)
9. Gardos G., Szasz I., Sarkadi B. Effect of intracellular calcium on the cation transport processes in human red cells. Acta Biol. Med. Ger. 1977; 36: 823—9.
10. Tiffert T., Spivak J.L., Lew V.L. Magnitude of calcium influx required to induce dehydration of normal human red cells. Biochim. Biophys. Acta. 1988; 943: 157—65.
11. Gibson J.S., Muzyamba M.C. Modulation of Gardos channel activity by oxidants and oxygen tension: effects of 1-chloro-2,4-dinitrobenzene and phenazine methosulphate. Bioelectrochemistry. 2004; 62: 147—52.
12. Kaestner L., Tabellion W., Lipp P., Bernhardt I. Prostaglandin E(2-) activates channel-mediated calcium entry in human erythrocytes: an indicator for a blood clot formation supporting process. Thromb. Haemost. 2004; 92: 1269—72.
13. Rivera A., Rotter M.A., Brugnara, C. Endothelins activate Ca (2+)-gated K(+)channels via endothelin B receptors in CD-1 mouse erythrocytes. Am. J. Physiol. 1999; 277: 746—54.
14. Rivera A., Jarolim P., Brugnara C. Modulation of Gardos channel activity by cytokines in sickle erythrocytes. Blood. 2002; 99: 357— 603.
15. Glynn I.M., Warner A.E. Nature of the calcium dependent potassium leak induced by (+)-propranolol, and its possible relevance to the drug's antiarrhythmic effect. Br. J. Pharmacol. 1972; 44(2): 271—8.
16. Platt O.S., Lux S.E., Nathan D.G. Exercise-induced hemolysis in xerocytosis. Erythrocyte dehydration and shear sensitivity. J. Clin. Invest. 1981; 68: 631—8.
17. Bartolucci Pablo, Brugnara Carlo, Teixeira-Pinto Armando, Pissard Serge, Moradkhani Kamran, Jouault Hélène, Galacteros Frederic. Erythrocyte density in sickle cell syndromes is associated with specific clinical manifestations and hemolysis. Blood. 2012; 120: 3136—41.
18. Shurkhina E.S., Shcherbinina S.P., Kolodei S.V., Yermakova T.A. The influence of emoxipin on the red blood cell density at iron disorders. BiomarkersEnviron. 2001; 4 (Suppl. 1): 4—7.
19. Шурхина Е.С., Нестеренко В.М., Колодей С.В., Цветаева Н.В., Лисовская И.Л., Атауллаханов Ф.И. Деформируемость и плотность эритроцитов при микроцитарных гипохромных анемиях. Клиническая лабораторная диагностика. 2004; 9: 45.
20. Шурхина Е.С., Цветаева Н.В., Колодей С.В., Лисовская И.Л., Нестеренко В.М., Кузнецов С.В. и др. Плотность и деформируемость эритроцитов больного аутоиммунной гемолитической анемией с антифосфолипидным синдромом в разные периоды
течения болезни. Гематология и трансфузиология. 2003; 48(3): 19—22.
REFERENCES
1. Levine R.A., Wardlaw S.C. Detecting specific medical conditions from erythrocyte density distrubition in a centrifuged anticoagulated whole blood sample. US Patent 5705739 Issued on January 6, 1998.
2. Danon D., Marikovsky Y. Determination of density distribution of red cell population. J. Lab. Clin. Med. 1964; 64: 668—73.
3. Shurkhina E.S., Nesterenko V.M., Kolodey S.V., Tsvetaeva N.V., Ermakova T.A., Nikulina O.F. et al. Density-specific distribution of erythrocytes in different types of anemia. Terapevticheskiy arkhiv. 2009. 81(1): 48—51. (in Russian)
4. Lew V.L., Raftos J.E., Sorette M., Bookchin R.M., Mohandas N. Generation of normal human red cell volume, hemoglobin content, and membrane area distributions by 'birth' or regulation? Blood. 1995; 86: 334—41.
5. Waugh R.E., Mohandas N., Jackson C.W., Mueller T.J., Suzuki T., Dale G.L. Rheologic properties of senescent erythrocytes: loss of surface area and volume with red blood cell age. Blood. 1992; 79: 1351—8.
6. Lutz H.U. Red cell density and red cell age. Blood Cells. 1988; 14: 76—80.
7. Swietach P., Tiffert T., Mauritz J.M.A., Seear R., Esposito A., Kaminski C.F. et al. Hydrogen ion dynamics in human red blood cells. J. Physiol. 2010; 588: 4995—5014.
8. Shurkhina E.S., Nesterenko V.M., Lisovskaya I.L., Tsvetaeva N.V., Kolodei S.V., Nikulina O.F. et al. Detection of Stages of Autoimmune Hemolytic Anemia by Evaluating Erythrocyte Deformability and Density. Bulleten' Experimental'noi biologii i meditsiny. 2004; 138 (9): 280—3.
9. Gardos G., Szasz I., Sarkadi B. Effect of intracellular calcium on the cation transport processes in human red cells. Acta Biol. Med. Ger. 1977; 36: 823—9.
10. Tiffert T., Spivak J.L., Lew V.L. Magnitude of calcium influx required to induce dehydration of normal human red cells. Biochim. Biophys. Acta. 1988; 943: 157—65.
11. Gibson J.S., Muzyamba M.C. Modulation of Gardos channel activity by oxidants and oxygen tension: effects of 1-chloro-2,4-dinitroben-zene and phenazine methosulphate. Bioelectrochemistry. 2004; 62: 147—52.
12. Kaestner L., Tabellion W., Lipp P., Bernhardt I. Prostaglandin E(2) activates channel-mediated calcium entry in human erythrocytes: an indicator for a blood clot formation supporting process. Thromb. Haemost. 2004; 92: 1269—72.
13. Rivera A., Rotter M.A., Brugnara, C. Endothelins activate Ca (2+)-gated K(+)channels via endothelin B receptors in CD-1 mouse erythrocytes. Am. J. Physiol. 1999; 277: 746—54.
14. Rivera A., Jarolim P., Brugnara C. Modulation of Gardos channel activity by cytokines in sickle erythrocytes. Blood. 2002; 99: 357— 603.
15. Glynn I.M., Warner A.E. Nature of the calcium dependent potassium leak induced by (+)-propranolol, and its possible relevance to the drug's antiarrhythmic effect. Br. J. Pharmacol. 1972; 44(2): 271—8.
16. Platt O.S., Lux S.E., Nathan D.G. Exercise-induced hemolysis in xerocytosis. Erythrocyte dehydration and shear sensitivity. J. Clin. Invest. 1981; 68: 631—8.
17. Bartolucci Pablo, Brugnara Carlo, Teixeira-Pinto Armando, Pissard Serge, Moradkhani Kamran, Jouault Hélène, Galacteros Frederic. Erythrocyte density in sickle cell syndromes is associated with specific clinical manifestations and hemolysis. Blood. 2012; 120: 3136—41.
18. Shurkhina E.S., Shcherbinina S.P., Kolodei S.V., Yermakova T.A. The influence of emoxipin on the red blood cell density at iron disorders. Biomarkers Environ. 2001; 4 (Suppl. 1): 4—7.
19. Shurkhina E.S., Nesterenko V.M., Kolodey S.V., Tsvetaeva N.V., Lisovskaya I.L., Anaullakhanov F.I. Erythrocyte deformability and density at microcytic hypochromic anemias. Klinicheskaya labora-tornaya diagnostika. 2004; 9: 45. (in Russian)
20. Shurkhina E.S., Tsvetaeva N.V., Kolodey S.V., Lisovskaya I.L., Nesterenko V.M., Kuznetsov S.V. et al. Density and deformability of red blood cells in a patient with autoimmune hemolytic anemia and antiphospolipid syndrome in different periods of the disease course. Gematologiya i transfuziologiya. 2003; 48 (3): 19—22. (in Russian)
Поступила 22.10.13 Received 22.10.13
