СВЕРХЭКСПРЕССИЯ ЦИКЛИЧЕСКОЙ РНК ГЕНА SGMS1 ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С МАЛЫМИ РНК Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

МАТЕРИАЛЫ V НАЦИОНАЛЬНОГО КОНГРЕССА ПО РЕГЕНЕРАТИВНОЙ МЕДИЦИНЕ

197

функциональный фенотип в ответ на различные сигналы микроокружения [2]. Однако влияние различно активированных Мф на нейрогенез практически не изучено.

Целью данной работы явилась сравнительная оценка влияния Мф с оппозитными фенотипами — классически активированных M1(IFN-y) и альтернативно активированных М2а(11_-4) — на пролиферативную активность клеток SH-SY5Y в условиях депривации ростовых/сывороточных факторов.

Материалы и методы. Мф генерировали из монону-клеарных клеток периферической крови доноров в присутствии 50 нг/мл GM-CSf и 10% FBS в течение 7 суток, добавляя 200 МЕ/мл IFN-y и 20 нг/мл IL-4 на 5 сутки, соответственно для M1 и M2a. Кондиционную среду (КС) культур Мф использовали в концентрации 30% (V/v). Моделирование условий ишемии in vitro осуществляли посредством частичной депривации ростовых/сывороточных факторов (1% FBS). В качестве модели нейраль-ных предшественников были использованы клетки линии нейробластомы человека SH-SY5Y, пролиферативную активность которых оценивали WST-тестом.

Результаты. Уже на 3 сутки культивирования в условиях депривации (1 % FBS) пролиферативная активность клеток SH-SY5Y значимо снижалась в сравнении со стандартными условиями (10% FBS, позитивный контроль) (p<0,05). В присутствии КС обоих исследуемых типов Мф уровень пролиферации повышался более, чем в 1,5 раза (p<0,05) и превосходил не только депри-вационный, но и позитивный контроль, причём эффект КС М2а был значимо более выражен в сравнении с М1 (p<0,05). На позднем сроке культивирования (7 сутки) в условиях депривации клетки также пролиферировали менее активно в сравнении со стандартными условиями (p<0,05). Добавление КС Мф обоих типов приводило к восстановлению пролиферативной активности: в случае М1 — до уровня позитивного контроля, а в случае М2а — достоверно выше позитивного контроля (p<0,05).

Таким образом, растворимые факторы Мф — как с М1, так и с М2а фенотипом — оказывают стимулирующий эффект на пролиферативную активность клеток SH-SY5Y в условиях, моделирующих ишемию in vitro. Наиболее выражен данный эффект у Мф с М2 фенотипом, что позволяет рассматривать их как Мф с высоким нейрорегенераторным потенциалом.

Литература:

1. Xiong X., Liu L., Yang Q. Prog Neurobiol. 2016. V 142. P. 23-44.

2. Locati M., Cúrtale G., Mantovani A. Annu Rev Pathol. 2020.

V 15. P. 123-147.

СВЕРХЭКСПРЕССИЯ ЦИКЛИЧЕСКОЙ РНК ГЕНА SGMS1 ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С МАЛЫМИ РНК

Ю.А. Ремизова1, 2, О.Ю. Сударкина1, С.А. Лимборская1, Л.В. Дергунова1, И.Б. Филиппенков1

1 ФГБУ Институт молекулярной генетики, НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия

2 ФГАОУ ВО РНИМУ им. НИ. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия

e-mail: utoshkautoshka@gmail.com

Ключевые слова: циклические РНК, малые РНК, микроРНК, ген сфингомиелинсинтазы 1 (SGMS1) человека, сверхэкспрессия, ОТ-ПЦР в реальном времени, люциферазный репортер.

Циклические РНК (циклоРНК) представляют собой ковалентно замкнутые молекулы некодирующих РНК, характеризующиеся устойчивостью к действию экзонуклеаз. Их образование зачастую сопряжено с взаимодействием инвертированных повторов в РНК-предшественнике, что обеспечивает формирование кольцевой структуры при сплайсинге. Функциональная значимость циклоРНК в настоящее время активно изучается. Отдельным циклоРНК приписывают способность эффективно взаимодействовать с малыми РНК и нивелировать их активность [1].

Целью работы является изучение роли циклоРНК, образование которых было обнаружено нами ранее в числе транскриптов гена SGMS1 человека [2, 3]. Кодируемый данным геном фермент сфингомиелинсинтаза 1 принимает участие в регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта, пролиферации клеток, апоптозе и других процессах, в том числе, связанных с регенеративными механизмами клетки.

В работе впервые была осуществлена сверхэкспрессия одной из 13 циклоРНК гена SGMS1 — circSGMS1_7, содержащей участок кодирующей и 5'-нетранслируемой области данного гена. Экспрессионная конструкция, включающая вставку с искусственно созданными инвертированными повторами по ~800 п.н. с двух сторон от циклоРНК-по-следовательности, была клонирована в плазмиду pcDNA3.1(+) и трансфецирована в клетки HEK293. В результате, по данным ОТ-ПЦР в реальном времени, увеличение экспрессии circSGMS1_7 составило 58 раз относительно ее исходного уровня в клетках. При этом котрансфекция синтетического РНК-мимика малой интерферирующей РНК si-SGMS1_7 снизила уровень сверхэкспрессии циклоРНК в 4 раза.

В числе микроРНК, потенциально способных взаимодействовать с circSGMS1_7, с помощью базы данных STarMirDB была выбрана hsa-mir-4669. С использованием репортерной конструкции, содержащей слитый с последовательностью циклоРНК ген люци-феразы, мы показали снижение активности фермента в 5 и 1,7 раз при введении мимиков si-SGMS1_7 и hsa-mir-4669 соответственно. При этом сверхэкспрессия circSGMS1_7 в системе препятствовала снижению активности фермента. Результат является первым экспериментальным свидетельством взаимодействия малых РНК с циклоРНК гена SGMS1 человека.

Таким образом, экспрессионная система циклоРНК гена SGMS1 может быть использована для изучения механизмов внутриклеточной регуляции с участием ци-клоРНК и малых РНК. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 21-34-70048.

Литература:

1. Hansen T.B., Jensen T.I., Clausen B.H. et al. Nature. 2013. V.

495. № 7441. P. 384-8.

2. Filippenkov I.B., Sudarkina O.Y., Limborska et al. RNA Biol.

2015. V. 12. № 9. P. 1030-42.

3. Filippenkov I.B., Sudarkina O.Y., Limborska et al. Gene. 2018. V.

654. P. 14-2.

Гены & Клетки XVII, №3, 2022