CC BY
9
0 биологической активности экзосом нейральных стволовых клеток (НСК) весьма ограничены.
Целью работы было изучение возможности использования экзосом НСК мыши для предотвращения когнитивных нарушений у мышей через 1 месяц после гамма-облучения головы в дозе 8 Гр.
Экзосомы были получены из кондиционированной среды НСК мыши методом дифференциального ультрацентрифугирования и охарактеризованы по размеру, концентрации белка и наличию специфических экзосомальных маркеров (009, 0063, 186101). Экзосомы в дозе 5 мкг по белку вводили интраназально мышам С57В1/6 в течение 4 недель с интервалом 1-2 суток, начиная со вторых суток после гамма-облучения головы в дозе 8 Гр (установка «ГУТ-200М», источник — кобальт-60). Через 1 месяц после облучения оценивали поведение (тест «открытое поле») и эпизодическую память (тест «распознавание нового объекта») контрольных и облученных животных и облученных животных, получавших препараты экзосом НСК.
Использованные препараты везикул НСК имели средний размер частиц 40-70 нм, 99,5% из них имели маркеры С09+С063+Т8Э101 +, что соответствует экзосомам. При анализе поведения в тесте «открытое поле» у мышей через
1 месяц после гамма-облучения головы в дозе 8 Гр обнаружено снижение общего пройденного пути, средней скорости и количества стоек, уменьшение длительности пребывания в промежуточной и центральной зонах арены и увеличение длительности пребывания в пристеночной зоне в сравнении с контролем. В то же время значения исследуемых параметров поведения облученных мышей, которым вводили экзосомы НСК, были на уровне необлученного контроля. При проведении теста «распознавание нового объекта» у облучённых животных выявлено снижение эпизодической памяти, выраженное в схожем времени обследования нового и известного объектов через 24 часа после обучения. Напротив, контрольные и облученные мыши, которым вводили экзосомы НСК, проводили статистически значимо больше времени, исследуя новый объект: индекс распознавания составил 0,36 ± 0,0б и 0,34 ± 0,10 соответственно.
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования экзосом НСК для предотвращения отдалённых пострадиационных нарушений поведения и когнитивных функций при интраназальном введении. Работа выполнена при поддержке НИЦ «Курчатовский институт» (приказ от 28.10.21 г. № 2757).
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В КЛЕТКАХ АКТИВИРОВАННОЙ МИКРОГЛИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИХ ЭКЗОСОМ
М.Г. Ратушняк, Д.А. Шапошникова, О.В. Высоцкая, Ю.П. Семочкина
НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: ratushnYak_marYa@mail.ru
Ключевые слова: нейральные стволовые клетки, экзосомы, микроглия, цитокины, экспрессия генов.
В основе появления когнитивных нарушений при ней-родегенеративных заболеваниях, черепно-мозговых травмах, а также в отдаленный период после облучения опухолей головного мозга при лучевой терапии лежит развитие нейровоспаления, обусловленного активацией микроглии (МГ). МГ характеризуется высокой пластичностью, выполняет защитную функцию, обеспечивая формирование
иммунного ответа, и регулирует функции нейронов, участвуя в удалении старых и образовании новых синапсов. При активации МГ секретирует провоспалительные цито-кины и активные метаболиты кислорода и азота, что активирует астроциты и может приводить к повреждению нейронов. Возможным способом стимуляции процессов регенерации и уменьшения нейровоспаления может быть использование нейральных стволовых клеток (НСК) и экзосом НСК. Показано, что препараты НСК человека и их экзосом обладали терапевтическим действием при экспериментальном инсульте и облучении мозга мышей благодаря регуляции активности МГ. Целью настоящей работы стало исследование возможности снижения уровня экспрессии генов провоспалительных цитокинов в клетках активированной ЛПС МГ линии 81М-А9 при действии НСК и их экзосом. Для анализа влияния НСК и их экзосом на активированные клетки МГ их (1 х 106 клеток) активировали ЛПС (5 нг/мл) в течение 4 часов, отмывали от ЛПС и культивировали совместно с НСК (1 х106 клеток). Препараты экзосом НСК получали из кондиционированной среды НСК методом дифференциального ультрацентрифугирования и характеризовали по размеру, концентрации белка и наличию специфических маркеров — СЮ9 и СЮ63. Для анализа влияния экзосом на уровень экспрессии генов в активированных ЛПС клетках МГ к ним добавляли экзосомы НСК в концентрации 0,515 мкг/мл по белку и культивировали в течение 24 ч, затем клетки замораживали при -80°С для последующего ПЦР-анализа экспрессии генов цитокинов.
При культивировании клеток 81М-А9 с ЛПС обнаружено увеличение экспрессии генов провоспалительных цитокинов. Со-культивирование НСК с контрольным клеткам МГ не влияло на уровень экспрессии генов Т1\1Ра, 1_-1 р и 1_-6, а с активированными — приводило к снижению их экспрессии в 1,5 (|_-6) — 2 (ТЫРа и 1_-1 р) раза, хотя она оставалась значимо увеличенной по сравнению с контрольными клетками МГ. Добавление экзосом НСК в концентрациях 5, 10 и 15 мкг/мл по белку не влияет на экспрессию ТЫРа в активированных ЛПС клетках микроглии, а экспрессия 1_-1Ь снижается не значительно. Полученные результаты свидетельствуют о способности НСК регулировать активность клеток активированной МГ, обеспечивая противовоспалительное действие. При этом действие НСК на активированные клетки МГ не определяется прямым действием секретируемых ими экзосом, а связано с иными механизмами. Работа выполнена при поддержке НИЦ «Курчатовский институт» (приказ от 28.10.21 г. № 2757).
РАСТВОРИМЫЕ ФАКТОРЫ МАКРОФАГОВ ЧЕЛОВЕКА СТИМУЛИРУЮТ ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК SH-SY5Y В УСЛОВИЯХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ИШЕМИЮ IN VITRO
И.М. Ращупкин, А.А. Максимова, Е.Я. Шевела
ФГБНУ НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
e-mail: iwwwanbets@mail.ru
Ключевые слова: макрофаги, нейрорегенерация, нейро-протекция, ишемия, клетки SH-SY5Y.
Макрофаги человека (Мф) играют важную роль в регуляции процессов нейрорегенерации, одним из компонентов которой является пролиферация ней-ральных предшественников [1]. Известно, что Мф свойственна пластичность, т. е. способность изменять свой
функциональный фенотип в ответ на различные сигналы микроокружения [2]. Однако влияние различно активированных Мф на нейрогенез практически не изучено.
Целью данной работы явилась сравнительная оценка влияния Мф с оппозитными фенотипами — классически активированных M1(IFN-y) и альтернативно активированных М2а(11_-4) — на пролиферативную активность клеток SH-SY5Y в условиях депривации ростовых/сывороточных факторов.
Материалы и методы. Мф генерировали из монону-клеарных клеток периферической крови доноров в присутствии 50 нг/мл GM-CSf и 10% FBS в течение 7 суток, добавляя 200 МЕ/мл IFN-y и 20 нг/мл IL-4 на 5 сутки, соответственно для M1 и M2a. Кондиционную среду (КС) культур Мф использовали в концентрации 30% (V/v). Моделирование условий ишемии in vitro осуществляли посредством частичной депривации ростовых/сывороточных факторов (1% FBS). В качестве модели нейраль-ных предшественников были использованы клетки линии нейробластомы человека SH-SY5Y, пролиферативную активность которых оценивали WST-тестом.
Результаты. Уже на 3 сутки культивирования в условиях депривации (1 % FBS) пролиферативная активность клеток SH-SY5Y значимо снижалась в сравнении со стандартными условиями (10% FBS, позитивный контроль) (p<0,05). В присутствии КС обоих исследуемых типов Мф уровень пролиферации повышался более, чем в 1,5 раза (p<0,05) и превосходил не только депри-вационный, но и позитивный контроль, причём эффект КС М2а был значимо более выражен в сравнении с М1 (p<0,05). На позднем сроке культивирования (7 сутки) в условиях депривации клетки также пролиферировали менее активно в сравнении со стандартными условиями (p<0,05). Добавление КС Мф обоих типов приводило к восстановлению пролиферативной активности: в случае М1 — до уровня позитивного контроля, а в случае М2а — достоверно выше позитивного контроля (p<0,05).
Таким образом, растворимые факторы Мф — как с М1, так и с М2а фенотипом — оказывают стимулирующий эффект на пролиферативную активность клеток SH-SY5Y в условиях, моделирующих ишемию in vitro. Наиболее выражен данный эффект у Мф с М2 фенотипом, что позволяет рассматривать их как Мф с высоким нейрорегенераторным потенциалом.
Литература:
1. Xiong X., Liu L., Yang Q. Prog Neurobiol. 2016. V 142. P. 23-44.
2. Locati M., Cúrtale G., Mantovani A. Annu Rev Pathol. 2020.
V 15. P. 123-147.
СВЕРХЭКСПРЕССИЯ ЦИКЛИЧЕСКОЙ РНК ГЕНА SGMS1 ЧЕЛОВЕКА ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ ЕЕ ВЗАИМОДЕЙСТВИЙ С МАЛЫМИ РНК
Ю.А. Ремизова1, 2, О.Ю. Сударкина1, С.А. Лимборская1, Л.В. Дергунова1, И.Б. Филиппенков1
1 ФГБУ Институт молекулярной генетики, НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
2 ФГАОУ ВО РНИМУ им. НИ. Пирогова" Министерства здравоохранения Российской Федерации, Москва, Россия
e-mail: utoshkautoshka@gmail.com
Ключевые слова: циклические РНК, малые РНК, микроРНК, ген сфингомиелинсинтазы 1 (SGMS1) человека, сверхэкспрессия, ОТ-ПЦР в реальном времени, люциферазный репортер.
Циклические РНК (циклоРНК) представляют собой ковалентно замкнутые молекулы некодирующих РНК, характеризующиеся устойчивостью к действию экзонуклеаз. Их образование зачастую сопряжено с взаимодействием инвертированных повторов в РНК-предшественнике, что обеспечивает формирование кольцевой структуры при сплайсинге. Функциональная значимость циклоРНК в настоящее время активно изучается. Отдельным циклоРНК приписывают способность эффективно взаимодействовать с малыми РНК и нивелировать их активность [1].
Целью работы является изучение роли циклоРНК, образование которых было обнаружено нами ранее в числе транскриптов гена SGMS1 человека [2, 3]. Кодируемый данным геном фермент сфингомиелинсинтаза 1 принимает участие в регуляции внутриклеточного везикулярного транспорта, пролиферации клеток, апоптозе и других процессах, в том числе, связанных с регенеративными механизмами клетки.
В работе впервые была осуществлена сверхэкспрессия одной из 13 циклоРНК гена SGMS1 — circSGMS1_7, содержащей участок кодирующей и 5'-нетранслируемой области данного гена. Экспрессионная конструкция, включающая вставку с искусственно созданными инвертированными повторами по ~800 п.н. с двух сторон от циклоРНК-по-следовательности, была клонирована в плазмиду pcDNA3.1(+) и трансфецирована в клетки HEK293. В результате, по данным ОТ-ПЦР в реальном времени, увеличение экспрессии circSGMS1_7 составило 58 раз относительно ее исходного уровня в клетках. При этом котрансфекция синтетического РНК-мимика малой интерферирующей РНК si-SGMS1_7 снизила уровень сверхэкспрессии циклоРНК в 4 раза.
В числе микроРНК, потенциально способных взаимодействовать с circSGMS1_7, с помощью базы данных STarMirDB была выбрана hsa-mir-4669. С использованием репортерной конструкции, содержащей слитый с последовательностью циклоРНК ген люци-феразы, мы показали снижение активности фермента в 5 и 1,7 раз при введении мимиков si-SGMS1_7 и hsa-mir-4669 соответственно. При этом сверхэкспрессия circSGMS1_7 в системе препятствовала снижению активности фермента. Результат является первым экспериментальным свидетельством взаимодействия малых РНК с циклоРНК гена SGMS1 человека.
Таким образом, экспрессионная система циклоРНК гена SGMS1 может быть использована для изучения механизмов внутриклеточной регуляции с участием ци-клоРНК и малых РНК. Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Москвы в рамках научного проекта № 21-34-70048.
Литература:
1. Hansen T.B., Jensen T.I., Clausen B.H. et al. Nature. 2013. V.
495. № 7441. P. 384-8.
2. Filippenkov I.B., Sudarkina O.Y., Limborska et al. RNA Biol.
2015. V. 12. № 9. P. 1030-42.
3. Filippenkov I.B., Sudarkina O.Y., Limborska et al. Gene. 2018. V.
654. P. 14-2.
