CC BY
15
значимых зонах. Распространённое в клинической практике применение коллагенсодержащих мембран не всегда позволяет восстановить нужный объем десны. Цель работы — разработка новой тканеинженерной конструкции (ТИК) для повышения эффективности восстановления объема мягких тканей десны при дентальной имплантации.
Экстракты коллагенсодержащих мембран Mucoderm (Botiss Biomaterials, Германия) и децеллюляризованного перикарда быка не обладали цитотоксическим действие, не снижали метаболическую (AlamarBlue assay) и пролифе-ративную (PicoGreen asaay) активность мультипотентных мезенхимных стромальных клеток (МСК) десны человека. Дополнительным подтверждением сохранения метаболической активности МСК в присутствии исследуемых образцов послужили результаты теста на высвобождение лактатдеги-дрогеназы. К обоим образцам МСК десны человека успешно адгезировались и формировали монослои живых клеток за 3 и 7 суток на поверхности Mucoderm и Перикарда, соответственно (LiveDead assay). Генно-терапевтический препарат «Неоваскулген» (ФГБУ ГНЦ МЗ РФ), форма плаз-миды, кодирующей эндотелиальный фактор роста сосудов, в максимальной концентрации 1,2мг/мл снижал метаболическую активность МСК десны человека на 60% и снижал уровень пролиферации клеток в два раза относительно контроля в ростовой среде без добавок.
Эффективность восстановления мягких тканей десны сравнивали после проведения аугментации слизистой десны закрытым способом с имплантацией материалов под лоскут кроликам породы Серый великан (n=9), разделенным на 4 группы по имплантированным образцам: 1) перикард, заселенный МСК 2) Mucoderm, заселенный МСК 3) перикард, 4) Mucoderm. Биодеградацию и тканевую реакцию оценивали методом морфометрического анализа. К 10 суткам оба варианта ТИК на основе коллагеновых мембран прошли частичную краевую резорбцию без выраженных признаков тканевой реакции на имплантат, соединительнотканная капсула состояла из незрелой грануляционной ткани с единичными очагами нейтрофилов.
Таким образом, использование коллагеновых материалов в сочетании с МСК и(или) стимулирующим васкуляризацию генно-терапевтическим препаратом может стать альтернативой аутотрансплантации мягких тканей для увеличения толщины десны, что актуально в современной стоматологии при дентальной имплантации. Исследование выполнено за счет средств гранта Российского научного фонда (проект № 18-15-00401).
ВЛИЯНИЕ GDF11 НА МОРФОФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК ПРИ СТАРЕНИИ
А.Ю. Ратушный, Д.К. Матвеева, М.И. Ездакова
ФГБУН ГНЦ РФ Институт медико-биологических проблем РАН, Москва, Россия
e-mail: ratushkin@mail.ru
Ключевые слова: мезенхимальные стромальные клетки (МСК), ASC52telo, GDF11, клеточное старение.
В настоящее время GDF11 активно исследуют в связи с его потенциальными геропротекторными свойствами и возможным применением в терапевтических целях. В нашей модели было изучено его влияние на «молодые» и сенесцентные мезенхимальные стромальные клетки человека, морфофункциональное состояние которых значительно различается.
Эксперименты проводили на иммортализованной стандартной линии МСК - ASC52telo (АТСС® 8030-4000™). Клетки были предоставлены на некоммерческой основе из клеточного депозитария МГУ им. М.В. Ломоносова в рамках проекта «Ноев ковчег». Клеточное старение индуцировали при помощи митомицина С (МмС).
При индукции клеточного старения отмечены характерные морфофункциональные изменения уже через 3 дня. Через 7 и 10 дней увеличение размера становилось более выраженным. Аутофлуоресценция увеличивалась в 7, в 12 и в 15 раз, соответственно, что указывает на накопление липофусцина. Активность лизосомального компар-тмента также увеличивалась в 4-6 раз. Активность мито-хондриального компартмента повышалась не более чем в 1,5 раза. Генерация АФК была увеличена в 1,5-5 раз.
В экспериментах было 4 группы МСК — «молодые» (МмСУЭйП 1-) и сенесцентные (МмС+/ОйИ 1-) клетки без добавления ЭйИ1, а также «молодые» (МмС-/ЭйР11+) и сенесцентные (МмС+/ЭйР1 1 +) клетки с добавлением ЭйШ (10 нг/мл). Анализ проводили через 10 дней.
Оценивали распределение по фазам клеточного цикла (8иЬЭ1 тест) и клоногенную активность. Показано, что воздействие МмС полностью останавливает пролифера-тивную активность. ЭйР11 + культуры не отличались по количеству колоний от ЭйШ- образцов. 8иЬЭ1 тест также не выявил выраженного влияния ЭйП 1 на распределение «молодых» клеток (МмС-) по фазам клеточного цикла.
Жизнеспособность МмС+ клеток была снижена приблизительно на 10% вне зависимости от добавления ЭйП 1. Оценка морфологических показателей Р8С-А и 88С-А выявила увеличение данных показателей при обработке МмС. Добавление ЭйШ приводило к небольшому снижению Р8С-А и 88С-А как МмС-, так и МмС+ клеток. Также через 10 дней экспозиции анализировали активность внутриклеточных компартментов, уровень окислительного стресса и аутофлуоресценцию клеток. Обработка МмС приводила к повышению всех исследованных параметров. Влияние ЭйП 1 было сла-бовыраженным. Тем не менее, отмечен ряд эффектов, обратный эффектам МмС, касающийся, в первую очередь, аутофлуоресценции, активности лизосомального компартмента и окислительных процессов. Работа выполнена при поддержке гранта РНФ 21-75-10117.
ПРЕДОТВРАЩЕНИЕ ОТДАЛЕННЫХ КОГНИТИВНЫХ НАРУШЕНИЙ У МЫШЕЙ ПОСЛЕ ГАММА-ОБЛУЧЕНИЯ ГОЛОВЫ С ПОМОЩЬЮ ИНТРАНАЗАЛЬНОГО ВВЕДЕНИЯ ЭКЗОСОМ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК
М.Г. Ратушняк, А.С. Жирник, А.А. Парфёнова, Ю.П. Семочкина, О.Д. Смирнова
НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: ratushnyak_marya@mail.ru
Ключевые слова: нейральные стволовые клетки, экзосомы, гамма-излучение, головной мозг, облучение головы, когнитивные функции, мыши
Перспективным направлением регенеративной медицины является использование экзосом — мембранных везикул, секретируемых различными клетками и содержащих целый комплекс биологически активных веществ. Терапевтическая эффективность экзосом мезенхималь-ных стволовых клеток показана на моделях различных заболеваний и при ряде патологий. В то же время данные
0 биологической активности экзосом нейральных стволовых клеток (НСК) весьма ограничены.
Целью работы было изучение возможности использования экзосом НСК мыши для предотвращения когнитивных нарушений у мышей через 1 месяц после гамма-облучения головы в дозе 8 Гр.
Экзосомы были получены из кондиционированной среды НСК мыши методом дифференциального ультрацентрифугирования и охарактеризованы по размеру, концентрации белка и наличию специфических экзосомальных маркеров (009, 0063, 186101). Экзосомы в дозе 5 мкг по белку вводили интраназально мышам С57В1/6 в течение 4 недель с интервалом 1-2 суток, начиная со вторых суток после гамма-облучения головы в дозе 8 Гр (установка «ГУТ-200М», источник — кобальт-60). Через 1 месяц после облучения оценивали поведение (тест «открытое поле») и эпизодическую память (тест «распознавание нового объекта») контрольных и облученных животных и облученных животных, получавших препараты экзосом НСК.
Использованные препараты везикул НСК имели средний размер частиц 40-70 нм, 99,5% из них имели маркеры С09+С063+Т8Э101 +, что соответствует экзосомам. При анализе поведения в тесте «открытое поле» у мышей через
1 месяц после гамма-облучения головы в дозе 8 Гр обнаружено снижение общего пройденного пути, средней скорости и количества стоек, уменьшение длительности пребывания в промежуточной и центральной зонах арены и увеличение длительности пребывания в пристеночной зоне в сравнении с контролем. В то же время значения исследуемых параметров поведения облученных мышей, которым вводили экзосомы НСК, были на уровне необлученного контроля. При проведении теста «распознавание нового объекта» у облучённых животных выявлено снижение эпизодической памяти, выраженное в схожем времени обследования нового и известного объектов через 24 часа после обучения. Напротив, контрольные и облученные мыши, которым вводили экзосомы НСК, проводили статистически значимо больше времени, исследуя новый объект: индекс распознавания составил 0,36 ± 0,0б и 0,34 ± 0,10 соответственно.
Полученные данные свидетельствуют о возможности использования экзосом НСК для предотвращения отдалённых пострадиационных нарушений поведения и когнитивных функций при интраназальном введении. Работа выполнена при поддержке НИЦ «Курчатовский институт» (приказ от 28.10.21 г. № 2757).
РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ ПРОВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЦИТОКИНОВ В КЛЕТКАХ АКТИВИРОВАННОЙ МИКРОГЛИИ ПОД ДЕЙСТВИЕМ НЕЙРАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК И ИХ ЭКЗОСОМ
М.Г. Ратушняк, Д.А. Шапошникова, О.В. Высоцкая, Ю.П. Семочкина
НИЦ Курчатовский институт, Москва, Россия
e-mail: ratushnYak_marYa@mail.ru
Ключевые слова: нейральные стволовые клетки, экзосомы, микроглия, цитокины, экспрессия генов.
В основе появления когнитивных нарушений при ней-родегенеративных заболеваниях, черепно-мозговых травмах, а также в отдаленный период после облучения опухолей головного мозга при лучевой терапии лежит развитие нейровоспаления, обусловленного активацией микроглии (МГ). МГ характеризуется высокой пластичностью, выполняет защитную функцию, обеспечивая формирование
иммунного ответа, и регулирует функции нейронов, участвуя в удалении старых и образовании новых синапсов. При активации МГ секретирует провоспалительные цито-кины и активные метаболиты кислорода и азота, что активирует астроциты и может приводить к повреждению нейронов. Возможным способом стимуляции процессов регенерации и уменьшения нейровоспаления может быть использование нейральных стволовых клеток (НСК) и экзосом НСК. Показано, что препараты НСК человека и их экзосом обладали терапевтическим действием при экспериментальном инсульте и облучении мозга мышей благодаря регуляции активности МГ. Целью настоящей работы стало исследование возможности снижения уровня экспрессии генов провоспалительных цитокинов в клетках активированной ЛПС МГ линии 81М-А9 при действии НСК и их экзосом. Для анализа влияния НСК и их экзосом на активированные клетки МГ их (1 х 106 клеток) активировали ЛПС (5 нг/мл) в течение 4 часов, отмывали от ЛПС и культивировали совместно с НСК (1 х106 клеток). Препараты экзосом НСК получали из кондиционированной среды НСК методом дифференциального ультрацентрифугирования и характеризовали по размеру, концентрации белка и наличию специфических маркеров — СЮ9 и СЮ63. Для анализа влияния экзосом на уровень экспрессии генов в активированных ЛПС клетках МГ к ним добавляли экзосомы НСК в концентрации 0,515 мкг/мл по белку и культивировали в течение 24 ч, затем клетки замораживали при -80°С для последующего ПЦР-анализа экспрессии генов цитокинов.
При культивировании клеток 81М-А9 с ЛПС обнаружено увеличение экспрессии генов провоспалительных цитокинов. Со-культивирование НСК с контрольным клеткам МГ не влияло на уровень экспрессии генов Т1\1Ра, 1_-1 р и 1_-6, а с активированными — приводило к снижению их экспрессии в 1,5 (|_-6) — 2 (ТЫРа и 1_-1 р) раза, хотя она оставалась значимо увеличенной по сравнению с контрольными клетками МГ. Добавление экзосом НСК в концентрациях 5, 10 и 15 мкг/мл по белку не влияет на экспрессию ТЫРа в активированных ЛПС клетках микроглии, а экспрессия 1_-1Ь снижается не значительно. Полученные результаты свидетельствуют о способности НСК регулировать активность клеток активированной МГ, обеспечивая противовоспалительное действие. При этом действие НСК на активированные клетки МГ не определяется прямым действием секретируемых ими экзосом, а связано с иными механизмами. Работа выполнена при поддержке НИЦ «Курчатовский институт» (приказ от 28.10.21 г. № 2757).
РАСТВОРИМЫЕ ФАКТОРЫ МАКРОФАГОВ ЧЕЛОВЕКА СТИМУЛИРУЮТ ПРОЛИФЕРАТИВНУЮ АКТИВНОСТЬ КЛЕТОК SH-SY5Y В УСЛОВИЯХ, МОДЕЛИРУЮЩИХ ИШЕМИЮ IN VITRO
И.М. Ращупкин, А.А. Максимова, Е.Я. Шевела
ФГБНУ НИИ фундаментальной и клинической иммунологии, Новосибирск, Россия
e-mail: iwwwanbets@mail.ru
Ключевые слова: макрофаги, нейрорегенерация, нейро-протекция, ишемия, клетки SH-SY5Y.
Макрофаги человека (Мф) играют важную роль в регуляции процессов нейрорегенерации, одним из компонентов которой является пролиферация ней-ральных предшественников [1]. Известно, что Мф свойственна пластичность, т. е. способность изменять свой
