CC BY
44
с тела жертвы. В тампонах и мазках было установлено наличие спермы. По делу проходили четыре подозреваемых, образцы которых предоставлены для исследования.
Анализ по мультилокусным системам выявил совпадение ДНК-профиля одного из подозреваемых с профилем спермы на вещественных доказательствах. Одновременно в генотипе данного подозреваемого было установлено отсутствие Х-специфического фрагмента гена амелогенина, что может указывать на мутацию в этой области. Данный пример экспертизы с AMEL-X-отрицательным мужчиной не привел к ошибкам в интерпретации результатов. Более сложной может оказаться ситуация с AMEL-Y-отрица-тельным мужчиной.
Следующая экспертиза является примером такого случая. Для проведения молекулярно-генетической экспертизы по факту изнасилования в отделение поступили мазки из влагалища потерпевшей женщины и предметы ее одежды, а также биообразцы потерпевшей и подозреваемого N. В мазке с содержимым влагалища потерпевшей, на предметах ее одежды обнаружены сперматозоиды. С целью отделения сперматозоидов от клеток эпителия в пробах проводили процедуру дифференцирующего лизиса, в результате которого были получены «фракции сперматозоидов» (содержащие преимущественно ДНК сперматозоидов). Половую принадлежность следов устанавливали с использованием системы сегмента гена амелогенина человека. Продукты амплификации (106, 112 пар нуклеотидов, п.н.) оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (8 % Т, 1,6 % С), окрашенном азотнокислым серебром. В ходе установления половой принадлежности проб ДНК, полученных из следов спермы, а также из образца подозреваемого N по системе сегмента гена амелогенина человека, установлен однофрагментный профиль (106 п.н.), что формально свидетельствует о принадлежности генетического материала женщине. Анализ матричной активности ДНК исследуемых объектов проводили с помощью полимераз-ной цепной реакции с использованием количественной энзиматической амплификации Quantifiler* Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США). Применение указанного набора позволяет установить концентрацию геномной ДНК в препарате и одновременно концентрацию мужской ДНК. Мишенью на Y-хромосоме служит в данном случае участок гена SRY, который находится на расстоянии 4 Mb от гена амелогенина. Результаты анализа показали, что в препаратах, полученных из следов спермы, содержится аутосомная ДНК человека и ДНК Y-хромосомы в количестве, достаточном для дальнейшего сравнительного анализа по системам генетической идентификации. Типирование полиморфных STR-локу-сов ядерной ДНК из объектов и из образцов для сравнительного исследования проводили с помощью наборов реагентов AmpFlSTR™ Identifiler Plus PCR[1]Amplification Kit производства фирмы Applied Biosystems, США. Разделение и детекцию флюоресцентно меченых амплифи-цированных фрагментов проводили с использованием прибора ABI PRISM* 310 и программного обеспечения производства фирмы Applied Biosystems, США. Длину амплифицированных фрагментов определяли по отношению к внутренним стандартам длины (Size Standard GeneScan 500lIZ), которые входят в состав наборов, с помощью программного обеспечения GeneMapper™ Software Version 3.2.1. В препаратах ДНК, полученных из следов спермы, выявлен комплекс генетических признаков, характерный для генотипа подозреваемого N, при этом в области Y-хромосомы сигнал отсутствовал. Аналогичная картина наблюдалась на электорофореграмме с результатом анализа образца подозреваемого N.
Из литературных данных известно, что определенный процент мужчин в популяции может нести мутацию, затрагивающую область гена амелогенина на коротком плече Y-хромосомы. Таковыми, как правило, являются микроделеции, не затрагивающие существенных генетических детерминант таких мужчин.
Для уточнения положения обнаруженной делеции проводили анализ STR-маркеров Y-хромосомы (набор реагентов Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit, Applied Biosystems, США). Гаплотип Y-хромосомы, выявленный в препаратах ДНК из следов спермы, полностью совпал с гаплотипом Y-хромосомы подозреваемого. Причем в локусе DYS458 у подозреваемого и в исследованных пробах отсутствовал аллельный вариант, что позволило уточнить локализацию делеции (маркер DYS458 расположен на коротком плече Y-хромосомы близко к гену амелогенина Yp 11.2).
ВЫВОДЫ
Широко используемый в экспертной практике метод установления половой принадлежности биологических следов человеческого происхождения с использованием амелогенинового теста не всегда может считаться безупречным и имеет ряд ограничений, что подтверждают реальные случаи из практики. Как следствие, половая принадлежность мужского биологического материала может быть ошибочно отнесена к женскому генетическому полу. Такая проблема особенно актуальна для случаев, когда преступник неизвестен или его образец недоступен для сравнительного исследования. Во всех случаях необходимо применять комплексный подход, используя дополнительные системы анализа, локализованные на Y-хромосоме.
СУОЕБНО-ЭКСПЕРТНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО NGS-АНАЛИЗАТОРА MISEQFGX
к.м.н. Е.Ю.Земскова1, С.В. Исупов2,
Т.В. Тимошенко1, д.б.н., проф. П.Л. Иванов1
• 1ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н., проф. А. В. Ковалев), г. Москва
• 2ООО «Альбиоген», г. Москва
• Аннотация: В работе представлен первый в России опыт использования генетического NGS-анализатора - на примере специализированной аналитической платформы MiSeqFGx (Illumina, США) - для целей судебно-экспертного анализа ДНК.
• Ключевые слова: NGS-технологии, генетический анализатор MiSeqFGx, молекулярно-ге-нетическая экспертиза
ВВЕДЕНИЕ
Недавнее появление технологий массового параллельного секвенирования, относящееся к активно разрабатываемой в последнее время области технологий «секве-нирования следующего поколения», или NGS (англ. Next Generation Sequencing), позволило открыть новые горизонты для криминалистического ДНК-анализа и судебно-экспертной практики. К новым возможностям относится одновременный анализ сразу очень большого числа моле-кулярно-генетических маркеров: STR, митохондриальной ДНК и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), что, в частности, позволяет эффективно работать с деградиро-
ванной ДНК, а также определять фенотип и биогеографическое происхождение.
Целью настоящего исследования явилось изучение возможностей технологии массового параллельного се-квенирования в судебно-экспертной практике на примере использования первого специализированного «судебно-экспертного» NGS-анализатора MiSeqFGx (Illumina, США).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для анализа были взяты 10 препаратов ДНК, полученных из образцов буккального эпителия, и еще 10 препаратов ДНК, полученных из разнотипных объектов, среди которых кровь, фрагменты костных останков, а также смесь спермальной и эпителиальной фракций и эпителиальная ткань. Использовали специализированный набор реагентов для пробоподготовки ForenSeq DNA Signature Prep Kit и штатное программное обеспечение ForenSeq Universal Analysis Software (Illumina, США).
Титульные исследования проводились на приборе MiSeq FGx (Illumina, США) в демонстрационной лаборатории компании ООО «Альбиоген», являющейся официальным представителем компании Illumina на территории Российской Федерации, в рамках научно-методического сотрудничества ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России и компании ООО «Альбиоген».
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для 18 образцов из 20 был получен полный генетический профиль по 128 локусам для женских генотипов и 152 локусам для мужских генотипов (дополнение за счет 24 локусов Y-хромосомы). Для 11 образцов было выявлено наличие внутриаллельных полиморфизмов (SNP), что является дополнительной дискриминирующей информацией.
Отдельно отмечаем, что для каждого из 10 взятых в исследование индивидуальных образцов буккального эпителия наряду с высокоинформативным мультилокусным профилем полиморфизма ДНК удалось установить фено-типические признаки донора: цвет волос и цвет глаз.
ВЫВОДЫ
В настоящей работе на примере аналитической платформы MiSeqFGx (Illumina, США) представлен первый в нашей стране опыт использования NGS-анализатора для целей судебно-экспертной практики. Первые оценки позволяют говорить о высокой эффективности анализа, а также о высоком качестве и надежности получаемых экспертных результатов. Высокоэффективный набор реагентов ForenSeq DNA Signature Prep Kit (Illumina, США) позволяет анализировать одновременно более 200 генетических маркеров, включая аутосомные STR-локусы, STR-локусы X- и Y-хромосомы и идентификационные SNP и при этом получать информацию не только ПДАФ-типа, но и ППАФ - то есть о полиморфизме нуклеотидной последовательности ДНК. Отдельно стоит отметить возможность получения фенотипических и этногеографических данных, что в перспективе позволит расширить возможности ДНК-идентификации.
■ СУДЕБНО-ЭКСПЕРТНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ ГЕНЕТИЧЕСКОГО АНАЛИЗАТОРА ПОЛНОГО ЦИКЛА RAPIDHIT 200
к.м.н. Е.Ю. Земскова1, С.В. Исупов2, Т.В. Тимошенко1, д.б.н., проф. П.Л. Иванов1 • 1 ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н., проф. А. В. Ковалев), г. Москва
• 2 ООО «Альгимед», г. Москва
• Аннотация: Работа посвящена новому направлению в судебно-экспертном анализе ДНК, а именно технологии «быстрой ДНК», осуществляемой с применением автоматизированных рабочих станций «полного цикла», которые обеспечивают выполнение всех необходимых аналитических процедур с минимальным участием эксперта. Целью исследования явилось изучение возможностей технологии «быстрой ДНК» в судебно-экспертной практике на примере использования автоматизированной станции полного цикла RapidHIT 200 (IntegenX, США). Полученные результаты показали, что система «быстрой ДНК» RapidHIT 200 способна обеспечить получение качественных STR-профилей хромосомной ДНК.
• Ключевые слова: технология «быстрой ДНК», генетический анализатор RapidHIT 200, молекулярно-генетическая экспертиза
ВВЕДЕНИЕ
На современном этапе для выполнения судебной молекулярно-генетической экспертизы необходимы специально оборудованные лабораторные помещения, высококвалифицированные специалисты и целый парк специализированной аппаратуры. Весь процесс может занимать до нескольких дней. Чтобы преодолеть эти трудности, последние несколько лет идет разработка и валидация технологии так называемой «быстрой ДНК» (англ. Rapid DNA) - судебно-экспертного анализа ДНК, осуществляемого с применением высокоавтоматизированных рабочих станций «полного цикла», которые обеспечивают выполнение всех необходимых аналитических процедур с минимальным участием эксперта.
Лидерами в данной области стали американские компании IntegenX и General Electric (NetBio), которые создали аналитические платформы RapidHIT 200 и DNAscan. Отличительной чертой этих инструментов является полная автоматизация процесса от образца до получения результатов: это интегрированные платформы, которые обеспечивают в автоматическом режиме процесс выделения ДНК, амплификацию STR-локусов, капиллярный электрофорез и первичный анализ генетического профиля.
Целью данного исследования явилось изучение возможностей технологии «быстрой ДНК» в судебно-экспертной практике на примере использования одной из таких автоматизированных станций полного цикла RapidHIT 200 (IntegenX, США).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования использовали 16 образцов буккального эпителия и 29 образцов крови. Вся серия экспериментов проводилась на базе отдела моле-кулярно-генетических экспертиз ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России с использованием автоматизированной станции RapidHIT 200 (IntegenX, США), предоставленной на апробацию компанией ООО «Альгимед», которая является официальным представителем IntegenX на территории Российской Федерации.
RapidHIT 200 позволяет анализировать до 7 образцов одновременно в течение менее 2 часов. Используемые наборы реагентов представляют собой одноразовые картри-
