CC BY
21
ванной ДНК, а также определять фенотип и биогеографическое происхождение.
Целью настоящего исследования явилось изучение возможностей технологии массового параллельного се-квенирования в судебно-экспертной практике на примере использования первого специализированного «судебно-экспертного» NGS-анализатора MiSeqFGx (Illumina, США).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Для анализа были взяты 10 препаратов ДНК, полученных из образцов буккального эпителия, и еще 10 препаратов ДНК, полученных из разнотипных объектов, среди которых кровь, фрагменты костных останков, а также смесь спермальной и эпителиальной фракций и эпителиальная ткань. Использовали специализированный набор реагентов для пробоподготовки ForenSeq DNA Signature Prep Kit и штатное программное обеспечение ForenSeq Universal Analysis Software (Illumina, США).
Титульные исследования проводились на приборе MiSeq FGx (Illumina, США) в демонстрационной лаборатории компании ООО «Альбиоген», являющейся официальным представителем компании Illumina на территории Российской Федерации, в рамках научно-методического сотрудничества ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России и компании ООО «Альбиоген».
РЕЗУЛЬТАТЫ
Для 18 образцов из 20 был получен полный генетический профиль по 128 локусам для женских генотипов и 152 локусам для мужских генотипов (дополнение за счет 24 локусов Y-хромосомы). Для 11 образцов было выявлено наличие внутриаллельных полиморфизмов (SNP), что является дополнительной дискриминирующей информацией.
Отдельно отмечаем, что для каждого из 10 взятых в исследование индивидуальных образцов буккального эпителия наряду с высокоинформативным мультилокусным профилем полиморфизма ДНК удалось установить фено-типические признаки донора: цвет волос и цвет глаз.
ВЫВОДЫ
В настоящей работе на примере аналитической платформы MiSeqFGx (Illumina, США) представлен первый в нашей стране опыт использования NGS-анализатора для целей судебно-экспертной практики. Первые оценки позволяют говорить о высокой эффективности анализа, а также о высоком качестве и надежности получаемых экспертных результатов. Высокоэффективный набор реагентов ForenSeq DNA Signature Prep Kit (Illumina, США) позволяет анализировать одновременно более 200 генетических маркеров, включая аутосомные STR-локусы, STR-локусы X- и Y-хромосомы и идентификационные SNP и при этом получать информацию не только ПДАФ-типа, но и ППАФ - то есть о полиморфизме нуклеотидной последовательности ДНК. Отдельно стоит отметить возможность получения фенотипических и этногеографических данных, что в перспективе позволит расширить возможности ДНК-идентификации.
■ судебно-экспертное применение генетического анализатора полного цикла rapidhit 200
к.м.н. Е.Ю. Земскова1, С.В. Исупов2, Т.В. Тимошенко1, д.б.н., проф. П.Л. Иванов1 • 1 ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства
здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н., проф. А. В. Ковалев), г. Москва
• 2 ООО «Альгимед», г. Москва
• Аннотация: Работа посвящена новому направлению в судебно-экспертном анализе ДНК, а именно технологии «быстрой ДНК», осуществляемой с применением автоматизированных рабочих станций «полного цикла», которые обеспечивают выполнение всех необходимых аналитических процедур с минимальным участием эксперта. Целью исследования явилось изучение возможностей технологии «быстрой ДНК» в судебно-экспертной практике на примере использования автоматизированной станции полного цикла RapidHIT 200 (IntegenX, США). Полученные результаты показали, что система «быстрой ДНК» RapidHIT 200 способна обеспечить получение качественных STR-профилей хромосомной ДНК.
• Ключевые слова: технология «быстрой ДНК», генетический анализатор RapidHIT 200, молекулярно-генетическая экспертиза
ВВЕДЕНИЕ
На современном этапе для выполнения судебной молекулярно-генетической экспертизы необходимы специально оборудованные лабораторные помещения, высококвалифицированные специалисты и целый парк специализированной аппаратуры. Весь процесс может занимать до нескольких дней. Чтобы преодолеть эти трудности, последние несколько лет идет разработка и валидация технологии так называемой «быстрой ДНК» (англ. Rapid DNA) - судебно-экспертного анализа ДНК, осуществляемого с применением высокоавтоматизированных рабочих станций «полного цикла», которые обеспечивают выполнение всех необходимых аналитических процедур с минимальным участием эксперта.
Лидерами в данной области стали американские компании IntegenX и General Electric (NetBio), которые создали аналитические платформы RapidHIT 200 и DNAscan. Отличительной чертой этих инструментов является полная автоматизация процесса от образца до получения результатов: это интегрированные платформы, которые обеспечивают в автоматическом режиме процесс выделения ДНК, амплификацию STR-локусов, капиллярный электрофорез и первичный анализ генетического профиля.
Целью данного исследования явилось изучение возможностей технологии «быстрой ДНК» в судебно-экспертной практике на примере использования одной из таких автоматизированных станций полного цикла RapidHIT 200 (IntegenX, США).
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В качестве объектов исследования использовали 16 образцов буккального эпителия и 29 образцов крови. Вся серия экспериментов проводилась на базе отдела моле-кулярно-генетических экспертиз ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России с использованием автоматизированной станции RapidHIT 200 (IntegenX, США), предоставленной на апробацию компанией ООО «Альгимед», которая является официальным представителем IntegenX на территории Российской Федерации.
RapidHIT 200 позволяет анализировать до 7 образцов одновременно в течение менее 2 часов. Используемые наборы реагентов представляют собой одноразовые картри-
джи, содержащие все необходимые для выделения ДНК, амплификации и капиллярного электрофореза.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ
Эксперименты выполнялись с использованием, в качестве основного и предпочтительного варианта, мультиплексной панели RapidHIT GlobalFiler Express Kit: эта панель относится к последнему поколению аналитических STR-панелей и позволяет проводить генотипирование сразу 24 полиморфных локусов хромосомной ДНК.
В ходе данной работы были получены генетические профили для всех взятых на исследование 45 образцов, из них 16 образцов буккального эпителия и 29 образцов крови. Для каждого типа образцов были подобраны оптимальное количество для внесения в картридж и протокол для работы.
Показано, что система позволяет успешно работать с образцами буккального эпителия. Лучшие результаты были достигнуты при использовании протокола Buccal Swab, позволившего получить более сбалансированный профиль и оптимальный уровень сигнала. Примечательно, что оставшийся в картридже образец букального эпителия можно использовать для повторного анализа: уровень полезного сигнала уменьшается не более чем в два раза.
Оптимальным протоколом для работы с образцами крови является Run Other Samples: данный протокол позволяет получить полный профиль при работе с вырезкой размером 3x3 мм и даже с минивырезкой диаметром 1,2 мм.
■ валидация некоторых методик экстрагирования днк из костных останков
Т. В. Тимошенко, к.м.н. Е. Ю. Земскова, к.м.н. М. М. Бордюков, д.б.н., проф. П. Л. Иванов • ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (дир. - д.м.н., проф. А. В. Ковалев)
• Аннотация: Проведен сравнительный анализ протоколов для экстрагирования ДНК из костных фрагментов (модифицированный метод с использованием стандартных реагентов и протокол с полной деминерализацией) с использованием роботизированных станций AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) и QIAcube (QIAGEN, Германия). Полученные результаты показали высокую производительность и пропускную способность методов автоматизированного экстрагирования ДНК для обеих указанных роботизированных станций с предварительной деминерализацией исследуемых костных фрагментов.
• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ская экспертиза, идентификационная экспертиза, типирование хромосомной ДНК, экстрагирование ДНК из костных останков, метод полной деминерализации
ВВЕДЕНИЕ
Целью работы явилось сравнительное исследование автоматизированных методов выделения суммарной ДНК из костной ткани с использованием двух роботизированных станций: AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) и QIAcube (QIAGEN, Германия)
с использованием стандартного протокола для выделения (для AutoMate Express™ DNA Extraction System) и предварительного этапа - полной деминерализации с некоторыми модификациями.
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Концентрацию ДНК в полученных препаратах определяли с помощью полимеразной цепной реакции с использованием систем количественной энзиматической амплификации ДНК Quantifiler* TRIO DNA Quantification Kit (ThermoFisher, США).
ПЦР-амплификацию полиморфных локусов проводили с использованием специализированных наборов реагентов Investigator ESSplex SE Plus Kit (QIAGEN, Германия) и AmpFlSTR* MiniFiler™ PCR Amplification Kit (ThermoFisher, США).
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Среди используемых протоколов для выделения ДНК на этапе оценки концентрации получены интересные данные для автоматизированного протокола для AutoMate Express™ DNA Extraction System (ThermoFisher, США) с предварительным этапом полной деминерализации: несмотря на то, что по сравнению с протоколом QIAcube (QIAGEN, Германия) суммарное количество ДНК коротких мишеней было незначительно ниже, количество длинных мишеней превышало на 10-15 % результаты, полученные с использованием других протоколов.
Возможно, полученный эффект является стохастическим, особенно учитывая предельно низкую область определения концентрации ДНК. Тем не менее нами было проведено дальнейшее исследование - амплификация STR-локусов и сравнение полученных результатов с теоретически рассчитанными.
Сравнительный анализ количественных оценок при экстрагировании из длинных трубчатых костей показал преимущества автоматизированных протоколов с предварительным этапом полной деминерализации по сравнению со стандартным протоколом выделения ДНК из костных останков. Вместе с тем отмечаем, что в отдельных случаях, связанных, по-видимому, со специфическими особенностями костных останков, получить результаты с использованием некоторых протоколов не удалось ввиду ингибирования препаратов ДНК, хотя для других протоколов количество суммарной ДНК варьировало в допустимых пределах.
ВЫВОДЫ
В целом полученные результаты показали высокую производительность и пропускную способность методов автоматизированного экстрагирования ДНК из костных фрагментов с предварительной деминерализацией для обеих использованных роботизированных станций. Однако надо понимать, что пока это пилотное исследование, результаты которого позволяют поставить целый ряд задач и дополнительных вопросов. В настоящее время такого рода исследования нами продолжаются.
snp-марке-ры в аспекте
идентификационной судебно-медицинском молекулярно-ге-не-тиче-ской экспертизы и экспертизы биологического родства
Т. В. Тимошенко, к.м.н. Е. Ю. Земскова, д.б.н., проф. П. Л. Иванов
• ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства
