Повышение доказательственного значения экспертного вывода с помощью ПЦР и флуоресцентной детекции аллельных вариантов полиморфных локусов Y-хромосомы Текст научной статьи по специальности «Прочие медицинские науки»

ВЫВОДЫ

• При оценке матричной активности ДНК в образцах костного материла в препаратах ДНК, выделенных на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System, концентрация ДНК соответствует требованиям использованной системы не ниже установленного порога чувствительности 0,01 нг/мкл, что свидетельствует о приемлемом уровне матричной активности ДНК исследованных образцов; а в тех же образцах костного материала, препараты ДНК из которых выделены на приборе QIAcube фирмы QIAGEN, концентрация ДНК ниже порога чувствительности используемого метода, что свидетельствует о низком уровне матричной активности ДНК исследованных образцов.

• Методом капиллярного электрофореза с образцами костного материла, препараты ДНК из которого выделены на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System, получен полный амплификаци-онный профиль ДНК; при исследовании соответствующих образцов костного материала, препараты ДНК из которого выделены на приборе QIAcube фирмы QIAGEN, по некоторым локусам получены неустойчивые результаты.

• Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности и целесообразности молекулярно-генетиче-ского исследования костного и гистологического материала в рамках новых высокотехнологичных решений, хотя это и сопряжено с определенными сложностями (предварительные стадии измельчения и депарафини-зации, необходимость дифференциального анализа биологического материала, отбор нескольких препаратов от одного лица, а в случаях с костным материалом и от одного объекта исследования).

■ повышение аоказательственного значения экспертного вывода с помощью пцр и флуоресцентной

детекции аллельных вариантов полиморфныхлокусову-хромосомы,

Т. А. Смагина

• Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)

• Аннотация: Доклад посвящен практическим случаям проведения молекулярно-генетических экспертиз в ГБУЗ МО «Бюро СМЭ», в которых для повышения доказательственного значения экспертного вывода, либо для подтверждения родства, проводился анализ STR-маркеров Y-хромосомы. Полученные данные позволяют говорить о целесообразности определения генотипических признаков (гаплотипов) ДНК Y-хромосомы в исследуемых препаратах ДНК для современных постановок идентификационного молекулярно-генетического анализа.

• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ская экспертиза, аллельный вариант, STR-ло-кус, гаплотип ДНК Y-хромосомы

ВВЕДЕНИЕ

Объективная ценность для следствия и суда данных, получаемых при проведении молекулярно-генетических экспертиз, и возрастающая сложность экспертных задач стимулируют внедрение в экспертную практику новых решений для повышения информативности молекуляр-но-генетического исследования и обеспечения существенного увеличения доказательного значения получаемых ре-

зультатов. В случаях, связанных с гражданско-правовыми отношениями и уголовно-наказуемыми деяниями, возрастает количество молекулярно-генетических экспертиз, в которых эксперт устанавливает не только индивидуальные аллельные варианты (профили ПДАФ) STR-локусов аутосомной ДНК исследуемых объектов, но и индивидуальные аллельные варианты полиморфных локусов Y-хромосомы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованию подвергался биологический материал, поступающий в молекулярно-генетическую лабораторию ГБУЗ МО «Бюро СМЭ» по постановлениям Главного следственного управления Следственного комитета Российской Федерации по Московской области (образцы крови, следы крови, следы спермы, биологические следы на вещественных доказательствах). Выделение ДНК из биологического материала проводили с применением сорбентных технологий на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System (Applied Biosystems, США) с использованием специализированного набора реагентов PrepFiler Express Forensic DNA Extraction Kit® (Applied Biosystems, США). Анализ матричной активности препаратов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием систем количественной энзиматической амплификации ДНК Quantifiler® Human DNA Quantification Kit, Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкцией фирмы-изготовителя. Продуктивность полимеразной цепной реакции регистрировали в режиме реального времени с использованием специализированного ам-плификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System и программного обеспечения SDS software v. 1.0 (Applied Biosystems, США).

Типирование полиморфных STR-локусов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием энзиматической амплификации 16-локусной панели AmpFlSTR® Identifiler® Plus PCR Amplification Kit, 25-ло-кусной системы AmpFlSTR® Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкциями фирмы-изготовителя. Продукты полимеразной цепной реакции фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).

Полученные электрофореграммы анализировали с использованием штатного программного обеспечения GeneMapper ID-X (Applied Biosystems, США) и устанавливали индивидуальные генотипические комбинации аллельных вариантов (профили ПДАФ) типируемых STR-локусов, а также устанавливали индивидуальные аллельные варианты полиморфных локусов Y-хромосомы исследуемых объектов.

Оценка полученных результатов проводилась с учетом матричной активности ДНК в исследуемых объектах и картины электрофоретического фракционирования. Для расчета вероятности по аутосомной

ДНК использованы значения аллельных частот исследованных локусов, определенные в ФГБУ «РЦСМЭ» Минздрава России для выборки населения Российской Федерации (n = 1000) с применением консервативной поправки, рекомендованной NRC II (США, 1996). Для расчета вероятности по Y-хромосоме использована консервативная оценка частоты гаплотипа Y-хромосо-мы по международной базе данных YHRD (Institute of Legal Medicine and Forensic Sciences, Берлин, Германия). Наши случаи из практики:

• В препаратах ДНК из некоторых биологических следов на вещественных доказательствах была установлена принадлежность конкретному лицу с определенной вероятностью, но были и препараты ДНК, имеющие смешанный характер; учитывая это, а также для повышения доказательственного значения экспертного вывода, была проведена молекулярно-генетическая идентификация с помощью полимеразной цепной реакции и флуоресцентной детекции аллельных вариантов полиморфных локусов Y-хромосомы и установлена вероятность того, что мужской компонент смеси произошел от определенного мужчины.

• По факту пропажи человека было возбуждено уголовное дело, с места происшествия были изъяты вещественные доказательства со следами крови. Для проведения молекулярно-генетической экспертизы был предоставлен образец крови родного брата пропавшего мужчины, и нами была проведена мо-лекулярно-генетическая идентификация с помощью полимеразной цепной реакции и флуоресцентной детекции аллельных вариантов полиморфных локусов Y-хромосомы и установлена вероятность того, что следы крови могли произойти от пропавшего мужчины, образец крови родного брата которого был исследован нами.

ВЫВОДЫ

Полученные результаты позволяют сделать вывод о возможности и целесообразности молекулярно-гене-тического исследования объектов, имеющих смешанный характер, установления родства, а также для повышения доказательственного значения экспертного вывода с помощью полимеразной цепной реакции и флуоресцентной детекции аллельных вариантов полиморфных локусов Y-хромосомы.

■ анализ распределения у-str

гаплотипов в выборке из 150 человек с учетом этнической принадлежности для мужского населения московской области с использованием всемирной справочной_базы_данныху1№р Т. А. Смагина, В. В. Рындин

• Бюро судебно-медицинской экспертизы Московской области (нач. - д.м.н., проф. В. А. Клевно)

• Аннотация: Работа посвящена исследованию распределения STR-маркеров Y-хромосомы биологических образцов с целью внесения результатов во всемирную «Справочную базу данных STR-гаплотипов Y-хромосомы» (YHRD: Y-Chromosome STR Haplotype Reference Database).

• Ключевые слова: молекулярно-генетиче-ское исследование, справочная база данных STR-гаплотипов Y-хромосомы, гаплотип ДНК Y-хромосомы

ВВЕДЕНИЕ

В связи с довольно широким внедрением в экспертную практику определения генотипических признаков (гапло-типов) ДНК Y-хромосомы возникает необходимость повышения идентификационной значимости такого вида исследований, то есть повышения значений вероятности генетической идентичности объектов на основе совпадения гаплотипов Y-хромосомы. Расчет этой вероятности основан на значениях базы данных YHRD (Y-Chromosome STR Haplotype Reference Database). Чем более широкой является выборка исследованных гаплотипов в базе, тем более высокое значение вероятности, выраженное в процентах, можно получить при подсчете результата по каждой конкретной экспертизе. Если в базе данных, полученной при применении для исследования набора реактивов AmpFlSTR® Yfiler™ PCR Amplification Kit (Applied Biosystems), имеются данные на 109 137 гаплотипов Y-хро-мосомы, то для нового набора AmpFlSTR® Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystem) база данных включает 8184 гаплотипа.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследованию подвергались заведомо пригодные для исследования образцы биологического материала от известных лиц (кровь, буккальный эпителий) по экспертизам и из архива отдела. Выделение ДНК проводили на роботизированной станции AutoMate Express DNA Extraction System (Applied Biosystems, США) с использованием специализированного набора реагентов PrepFiler Express Forensic DNA Extraction Kit® (Applied Biosystems, США). Анализ матричной активности препаратов ДНК проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием системы количественной энзиматической амплификации ДНК Quantifiler® Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицирован-ных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкцией фирмы-изготовителя.

Продуктивность полимеразной цепной реакции регистрировали в режиме реального времени с использованием специализированного амплификатора ABI PRISM 7500 Sequence Detection System и программного обеспечения SDS software v. 1.0 (Applied Biosystems, США).

Типирование полиморфных STR-локусов проводили с помощью полимеразной цепной реакции с использованием энзиматической амплификации 25-локусной системы AmpFlSTR® Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit (Applied Biosystems, США), руководствуясь Методическими указаниями № 98/253 «Использование индивидуализирующих систем на основе полиморфизма длины амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК в судебно-медицинской экспертизе идентификации личности и установления родства» (утверждены Минздравом РФ 19.01.1999) и инструкциями фирмы-изготовителя. Продукты полимеразной цепной реакции фракционировали электрофоретически с использованием системы капиллярного электрофореза ABI PRISM 3500 (Applied Biosystems, США).

Полученные электрофореграммы анализировали с использованием штатного программного обеспечения GeneMapper ID-X (Applied Biosystems, США) и устанавливали индивидуальные аллельные варианты полиморфных локусов Y-хромосомы исследуемых объектов. Анализ полученных данных про-