CC BY
48
молекулярно-генетического анализа стала полноценной тиражируемой медицинской технологией.
Основой стандартизации методики проведения экспертного исследования является использование апробированных наборов (комплектов) реагентов, включающих в себя все компоненты для проведения каждой стадии анализа. При этом качество каждого набора реагентов обеспечивается фирмой-производителем, а эксперт избавлен от необходимости готовить множество растворов и компонентов, посвящая свое время непосредственно проведению экспертизы. Сотрудниками отдела молеку-лярно-генетических экспертиз (исследований) РЦСМЭ проводится анализ и апробация существующих на сегодняшний день и вновь появляющихся наборов реагентов для идентификации личности (зарубежного и отечественного производства). Реагенты, прошедшие апробацию, используются как в непосредственной экспертной работе сотрудниками РЦСМЭ, так и рекомендуются к использованию в молекулярно-генетических лабораториях региональных бюро СМЭ.
Применение каждого конкретного набора реагентов предполагает использование соответствующего лабораторного оборудования. Стандартизация оборудования и соответствующих расходных материалов (лабораторного пластика) - еще одна важная задача при создании надежно воспроизводимой медицинской технологии. На сегодняшний день для целей судебно-медицинской экспертной практики используется два варианта молеку-лярно-генетической технологии - классический анализ полиморфизма длин амплифицированных фрагментов (ПДАФ) ДНК с помощью гель-электрофореза с последующей прокраской фрагментов ДНК серебром и высокотехнологичный вариант с использованием генетических анализаторов.
Сотрудниками РЦСМЭ постоянно осваиваются современные технологические подходы к молекулярно-генети-ческой идентификации личности, проводится внедрение новейших технологических разработок, специализированного оборудования для автоматического анализа ДНК. Апробированные приборы и методики включаются в высокотехнологичный цикл проведения генетической экспертизы и рекомендуются к дальнейшему использованию в экспертной практике.
Одним из важнейших итогов научно-методической деятельности в направлении стандартизации технологий проведения генетических экспертиз явилось создание на базе РЦСМЭ системы обучения экспертов-генетиков. В 2006 году на базе отдела молекуляр-но-генетических экспертиз (исследований) был создан практикум для обучения технологиям молекулярно-ге-нетической идентификации личности и определению родства. В настоящее время на регулярной основе проводятся очно-заочные циклы тематического усовершенствования для экспертов молекулярно-генетиче-ских лабораторий и судебно-биологических отделений: «Базовые методы идентификации личности и установления родства с помощью анализа полиморфизма аутосомной ДНК для исследования объектов судебно-медицинской экспертизы» и «Новые технологические подходы к фрагментному анализу ДНК в судебно-медицинской экспертизе».
Процесс подготовки экспертов-генетиков неразрывно связан с приведением генетических лабораторий к единому стандарту, что, безусловно, способствует повышению уровня проведения генетических экспертиз по стране в целом. За период с 2006 по 2015 год на базе РЦСМЭ подготовлено более 300 судебно-медицинских экспертов из 56 региональных бюро СМЭ Российской Федерации,
специалистов из Республики Таджикистан, Республики Армении, Кыргызской Республики.
ВЫВОДЫ
Таким образом, практическая реализация единого научно-методического подхода к проведению генетических экспертиз за последние годы способствовала стандартизации этого вида исследований, повышению эффективности работы молекулярно-генетических лабораторий судебно-экспертных учреждений, входящих в государственную систему здравоохранения, и формированию отечественной экспертной школы в сфере судебной генетики.
МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ AMEL-У- И АМЕ^-Х-ОТРИОАТЕЛЬНЫХ МУЖЧИН: ПРИМЕРЫ ИЗ ПРАКТИКИ
И. В. Карасева, О. А. Зайцева, к.б.н. А. Г. Смоляницкий
• Бюро судебно-медицинской экспертизы Ленинградской области (нач. - к.м.н., доц. В. Н. Лебедев)
• Аннотация: Мутации в гене амелогенина (AMEL) препятствуют объективной оценке половой принадлежности биологического материала в судебно-генетических экспертизах. Стандартный метод тестирования диморфизма амелогенина в мужском материале может приводить к ошибкам идентификации пола, если выявляется только одна его составляющая -АМЕЬУ или АМЕЬ-Х. Риск ошибок особенно возрастает в экспертизах по половым преступлениям, направленных против женщин, при исследовании биоматериалов с тела жертвы. Использование комплекса современных тест-систем позволяет избежать неверной интерпретации результатов молекулярно-генетиче-ской экспертизы.
• Ключевые слова: АМЕЬ^-отрицательный мужчина, АМЕЬ-Х-отрицательныи мужчина, судебно-генетическая экспертиза, половые преступления
ВВЕДЕНИЕ
При исследовании следов биологического происхождения, особенно тампонов и мазков с тела жертвы полового преступления, анализируемые следы нередко представляет собой смесь биологического материала двух и более лиц. В случаях, когда жертвой полового преступления становится женщина, почти всегда экспертиза будет выявлять в смешанных следах материал жертвы. Задача обнаружения в таких следах мужского материала на первом этапе решается с применением монолокусного теста сегмента гена амелогенина. Однако изредка в популяции встречаются мужчины с мутациями в области гена амелогенина (АЫБЬ), которые препятствуют объективной оценке половой характеристики объекта. При проведении судебно-генетической экспертизы необходимо учитывать такую возможность, используя комплекс мо-лекулярно-диагностических методов для определения половой принадлежности и идентификации исследуемых объектов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
На экспертизу по поводу расследования изнасилования и убийства женщины доставлены тампоны и мазки
с тела жертвы. В тампонах и мазках было установлено наличие спермы. По делу проходили четыре подозреваемых, образцы которых предоставлены для исследования.
Анализ по мультилокусным системам выявил совпадение ДНК-профиля одного из подозреваемых с профилем спермы на вещественных доказательствах. Одновременно в генотипе данного подозреваемого было установлено отсутствие Х-специфического фрагмента гена амелогенина, что может указывать на мутацию в этой области. Данный пример экспертизы с AMEL-X-отрицательным мужчиной не привел к ошибкам в интерпретации результатов. Более сложной может оказаться ситуация с AMEL-Y-отрица-тельным мужчиной.
Следующая экспертиза является примером такого случая. Для проведения молекулярно-генетической экспертизы по факту изнасилования в отделение поступили мазки из влагалища потерпевшей женщины и предметы ее одежды, а также биообразцы потерпевшей и подозреваемого N. В мазке с содержимым влагалища потерпевшей, на предметах ее одежды обнаружены сперматозоиды. С целью отделения сперматозоидов от клеток эпителия в пробах проводили процедуру дифференцирующего лизиса, в результате которого были получены «фракции сперматозоидов» (содержащие преимущественно ДНК сперматозоидов). Половую принадлежность следов устанавливали с использованием системы сегмента гена амелогенина человека. Продукты амплификации (106, 112 пар нуклеотидов, п.н.) оценивали с помощью электрофореза в полиакриламидном геле (8 % Т, 1,6 % С), окрашенном азотнокислым серебром. В ходе установления половой принадлежности проб ДНК, полученных из следов спермы, а также из образца подозреваемого N по системе сегмента гена амелогенина человека, установлен однофрагментный профиль (106 п.н.), что формально свидетельствует о принадлежности генетического материала женщине. Анализ матричной активности ДНК исследуемых объектов проводили с помощью полимераз-ной цепной реакции с использованием количественной энзиматической амплификации Quantifiler* Duo DNA Quantification Kit (Applied Biosystems, США). Применение указанного набора позволяет установить концентрацию геномной ДНК в препарате и одновременно концентрацию мужской ДНК. Мишенью на Y-хромосоме служит в данном случае участок гена SRY, который находится на расстоянии 4 Mb от гена амелогенина. Результаты анализа показали, что в препаратах, полученных из следов спермы, содержится аутосомная ДНК человека и ДНК Y-хромосомы в количестве, достаточном для дальнейшего сравнительного анализа по системам генетической идентификации. Типирование полиморфных STR-локу-сов ядерной ДНК из объектов и из образцов для сравнительного исследования проводили с помощью наборов реагентов AmpFlSTR™ Identifiler Plus PCR[1]Amplification Kit производства фирмы Applied Biosystems, США. Разделение и детекцию флюоресцентно меченых амплифи-цированных фрагментов проводили с использованием прибора ABI PRISM* 310 и программного обеспечения производства фирмы Applied Biosystems, США. Длину амплифицированных фрагментов определяли по отношению к внутренним стандартам длины (Size Standard GeneScan 500lIZ), которые входят в состав наборов, с помощью программного обеспечения GeneMapper™ Software Version 3.2.1. В препаратах ДНК, полученных из следов спермы, выявлен комплекс генетических признаков, характерный для генотипа подозреваемого N, при этом в области Y-хромосомы сигнал отсутствовал. Аналогичная картина наблюдалась на электорофореграмме с результатом анализа образца подозреваемого N.
Из литературных данных известно, что определенный процент мужчин в популяции может нести мутацию, затрагивающую область гена амелогенина на коротком плече Y-хромосомы. Таковыми, как правило, являются микроделеции, не затрагивающие существенных генетических детерминант таких мужчин.
Для уточнения положения обнаруженной делеции проводили анализ STR-маркеров Y-хромосомы (набор реагентов Yfiler™ Plus PCR Amplification Kit, Applied Biosystems, США). Гаплотип Y-хромосомы, выявленный в препаратах ДНК из следов спермы, полностью совпал с гаплотипом Y-хромосомы подозреваемого. Причем в локусе DYS458 у подозреваемого и в исследованных пробах отсутствовал аллельный вариант, что позволило уточнить локализацию делеции (маркер DYS458 расположен на коротком плече Y-хромосомы близко к гену амелогенина Yp 11.2).
ВЫВОДЫ
Широко используемый в экспертной практике метод установления половой принадлежности биологических следов человеческого происхождения с использованием амелогенинового теста не всегда может считаться безупречным и имеет ряд ограничений, что подтверждают реальные случаи из практики. Как следствие, половая принадлежность мужского биологического материала может быть ошибочно отнесена к женскому генетическому полу. Такая проблема особенно актуальна для случаев, когда преступник неизвестен или его образец недоступен для сравнительного исследования. Во всех случаях необходимо применять комплексный подход, используя дополнительные системы анализа, локализованные на Y-хромосоме.
СУОЕБНО-ЭКСПЕРТНОЕ ПРИМЕНЕНИЕ СПЕЦИАЛИЗИРОВАННОГО ГЕНЕТИЧЕСКОГО NGS-АНАЛИЗАТОРА MISEQFGX
к.м.н. Е.Ю.Земскова1, С.В. Исупов2,
Т.В. Тимошенко1, д.б.н., проф. П.Л. Иванов1
• 1ФГБУ «Российский центр судебно-медицинской экспертизы» Министерства здравоохранения Российской Федерации (директор - д.м.н., проф. А. В. Ковалев), г. Москва
• 2ООО «Альбиоген», г. Москва
• Аннотация: В работе представлен первый в России опыт использования генетического NGS-анализатора - на примере специализированной аналитической платформы MiSeqFGx (Illumina, США) - для целей судебно-экспертного анализа ДНК.
• Ключевые слова: NGS-технологии, генетический анализатор MiSeqFGx, молекулярно-ге-нетическая экспертиза
ВВЕДЕНИЕ
Недавнее появление технологий массового параллельного секвенирования, относящееся к активно разрабатываемой в последнее время области технологий «секве-нирования следующего поколения», или NGS (англ. Next Generation Sequencing), позволило открыть новые горизонты для криминалистического ДНК-анализа и судебно-экспертной практики. К новым возможностям относится одновременный анализ сразу очень большого числа моле-кулярно-генетических маркеров: STR, митохондриальной ДНК и однонуклеотидных полиморфизмов (SNP), что, в частности, позволяет эффективно работать с деградиро-
