CC BY
143
ИММУНООНКОЛОГИЯ
© О. п. КОЛБАЦКАЯ, Н. Н. ТУПИЦЫН, 2012 УДК 616.155.392-036.11-092:612.112.94]-078.33
О. П. Колбацкая, Н. Н. Тупицын
субпопуляции лимфоцитов костного мозга у больных острыми лейкозами в период диагностики заболевания
Лаборатория иммунологии гемопоэза Учреждения РАМН РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва
На основании проведенного комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) исследования у 124 больных установлено, что острые лейкозы взрослых характеризуются специфическими для каждой нозологической формы изменениями субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга при диагностике заболевания. Выявлены достоверные различия субпопуляционного состава Т-лимфоцитов-эффекторов в пределах как нозологических вариантов острых лейкозов (острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) и острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ)), так и морфоцитохимических вариантов ОМЛ и иммунофенотипических вариантов ОЛЛ, а также в зависимости от коэкспрессии на бластах различных антигенов.
Ключевые слова: острые лейкозы, костный мозг, лимфоциты Kolbatskaya O.P., Tupitsyn N.N.
subpopulations of bone marrow lymphocytes in the patients presenting with acute leukosis in the period of diagnostics of the disease
The present comprehensive study of 124 adult patients suffering from acute leukosis with the use of morphocytotchemical and immunological techniques has shown that this pathology is associated with alterations of the subpopulation composition of bone marrow lymphocyte detectable at the stage of diagnostics of the disease. Specifically, significant differences in the subpopulation composition of lymphocyte effector cells are documented between nosological variants of acute leukoses (acute myeloid leukosis, AM, and acute lymphoblastic leucosis, ALL) as well as between morphocytochemical variants of AML and immunophenotypic variants of ALL. Moreover, it was shown that the subpopulation composition of bone marrow lymphocytes varies depending on co-expression of different antigens on blast cells.
Key words: acute leucosis, bone marrow, lymphocytes
Введение. Костный мозг является гемопоэтическим органом. Вместе с тем в пуле лимфоцитов костного мозга присутствуют зрелые эффекторные клетки иммунной системы, способные осуществлять гуморальный и клеточный иммунный ответ, в терминах онкологии - иммунный надзор за опухолевым процессом. Костномозговые клетки-предшественницы являются мишенью для развития острых лейкозов, поэтому представляет большой интерес изучение иммунной системы костного мозга при диагностике острого лейкоза для оценки возможных иммунодефицитных состояний, в условиях которых пролиферирует лейкозный клон. Пусковым механизмом событий, определяющих развитие лейкемического клона, являются патологические мутации в генах, управляющих программами жизнеобеспечения стволовых гемопоэтических клеток или одной из ранних клеток-предшественниц в костном мозге или тимусе, что приводит к нарушению точного баланса процессов дифференцировки, пролиферации и самообновления и развитию острых лейкозов [1]. Вместе с тем одним из ключевых моментов развития опухолевого процесса является снижение противоопухолевого иммунного надзора [1].
Работы по изучению Т-клеточного и NK-клеточного противолейкемического иммунного ответа ведутся по нескольким направлениям: установление на бластных клетках специфических лейкемических маркеров (лейкозоассоциированных антигенов), распознаваемых Т-клетками, изучение количественного и качествен-
Колбацкая Ольга Павловна - науч. сотр., 8 (495) 324-14-30, e-mail:[email protected]
ного состава резидуальных лимфоцитов-эффекторов костного мозга, выявление причин неэффективности противолейкемического клеточного иммунитета.
В числе лейкозоассоциированных антигенов, распознаваемых Т-лимфоцитами, широко обсуждаются продукт гиперэкспрессии гена WT1 [15], а также химерные белки, образующиеся в результате слияния генов BCR-ABL, PML/RARa-протеин, ETV6-AML1-протеин, DEK-CAN и AML-1MTG8/ETO [3,4].
Злокачественные клетки могут ускользать от иммунного надзора ввиду следующих причин: нераспознавания (игнорирования) присутствия опухоли, нарушения презентации лейкозассоциированных пептидов, экспрессии иммуносупрессивных факторов и молекул, создания толерантности (анергии) цитотоксических лимфоцитов (ЦТЛ) вследствие утраты костимуляторных молекул на опухолевых клетках, резистентности неопластических клеток к апоптозу и развития “опухолевой контратаки” [7]. Многие из этих механизмов отмечены при взаимодействии лей-кемических бластов и лимфоцитов.
P. Yotnda и соавт. [16] подробно изучили вопрос, почему существование in vivo специфического ЦТЛ-иммунного ответа при остром лимфобластном лейкозе (ОЛЛ) не контролирует развитие лейкоза. Обнаружено, что Т-клеточный иммунный ответ был ингибирован на многих уровнях, что в целом и объясняет его неэффективность. Это состояние возникло вследствие следующих изменений: функциональной анергии CD8+- и CD4+-T-клеток, что связано с отсутствием экспрессии на них активационного маркера CD25- и CD40-лиганда, повышением уровня активационно-индуцированного апоптоза в субпопуляциях CD4+- и CD8+-T-клеток
- 77 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
больных ОЛЛ, отсутствием экспрессии главных ко-стимуляторных молекул В7 на бластах. Это вело к повышенной продукции интерлейкина (IL)-4, анергии и апоптозу CD4-клеток и, следовательно, к снижению эффективности CD4-зависимых CD8-клеток. Кроме того, отмечено отсутствие экспрессии FasL-молекулы на CD4+-T-клетках, необходимой для запуска программы клеточной смерти через CD95.
В одной из недавних работ, посвященной изучению функционального состояния клеток-эффекторов у первичных больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), R. Le Dieu и соавт. при исследовании Т-лимфоцитов периферической крови выявили нарушения в путях передачи сигнала с Т-клеточного рецептора (TCR) CD4+ и CD8+-T-клеток [8].
Многие опухоли человека характеризуются изменением фенотипа молекул МНС I класса, в особенности лейкозные клетки, которые могут иметь сниженную экспрессию молекул МНС I класса, а в некоторых случаях проявляют полную потерю аллеля МНС I класса [14]. Это говорит о том, что лейкемические бласты так же, как и опухолевые клетки другого происхождения, являются мишенью для NK-клеток [14].
Подробный анализ снижения цитолитической функции NK-клеток, полученных от больных ОМЛ при установлении диагноза, был проведен в работе C. Fauriat и соавт. [6]. Анализ in vitro IL-2-стимулированных NK-клеток от 71 пациента с ОМЛ показал у большинства (66,2%) пациентов снижение цитолитической функции из-за дефектной экспрессии основных активационных молекул - рецепторов натуральной цитотоксичности (NCRdull-фенотип), что явилось независимым фактором плохого прогноза. S. Verheyden и соавт. [12] отметили значительно большую частоту (р = 0,007) ингибирующего KIR2DL2-фенотипа у больных оМл (51%) по сравнению с таковой у здоровых лиц (31,!%), к тому же случаи наличия двух ингибирующих KIRs в группе 1 МНС-С-антигенов были намного выше у пациентов с ОМЛ (52%), чем в нормальных контролях (33% у здоровых лиц).
Причинами отсутствия лизиса клеток-мишеней при воздействии ЦТЛ и NK-клеток, помимо нарушения распознавания опухолевых клеток, стали секреция миелобластами иммуносупрессивных факторов в 75% первичных ОМЛ, которые ингибировали пролиферативную и секреторную функции Т-хелперов
[9], а также экспрессия FasL-бластами 54% больных ОМЛ на высоком уровне [5], что позволяло развивать “опухолевую контратаку”.
В нашем исследовании проведена сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга при различных вариантах острых лейкозов в период диагностики заболевания. Использован метод гейтинга по уровням экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45 (трехцветная проточная цитометрия), позволяющий надежно разделить бластные клетки и резидуальные лимфоциты костного мозга.
Материалы и методы. Исследуемую группу составили 124 первичных пациентов, из них 57 с ОМЛ и 67 с ОЛЛ. Диагноз всем больным был установлен на основании морфоцитохимического исследования и иммунофенотипирова-ния в лаборатории иммунологии гемопоэза РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН с 2004 по 2010 г. Средний возраст пациентов с ОМЛ 46,7 года, средний возраст больного ОЛЛ 33,3 года. Диагноз острого лейкоза у всех пациентов устанавливали на
CD 45 CY 5 (5) vs SSC-Height (2)
Выделение региона лимфоцитов для последующего изучения их субпопуляционного состава среди клеток костного мозга на основании экспрессии CD45 (ось абсцисс) и характеристик бокового (SSC, ось ординат) рассеяния света лазерного луча.
R1 - гейт бластных клеток; R2 - гейт лимфоцитов (больной М., 25 лет, ОМЛ М1).
основании классификации ВОЗ (2008), количество бластных клеток во всех случаях превышало 20%. Распределение больных ОМЛ по морфоцитохимическим вариантам было следующим: М0 - 8,8%, М1 - 36,8%, М2 - 12,3%, М3 - 12,3%, М4 - 14%, М4эоз. - 7%, М5а - 3,5%, М6 - 3,5%, М7 - 1,8%; с М5б-вариантом ОМЛ - не было. Распределение пациентов с ОЛЛ по иммуноподвариантам было следующим: про-В - 9%, пре-пре-В - 42%, пре-В - 1,5%, пре-Т - 47,5%.
Панель моноклональных антител (МКА), используемая для диагностики лейкоза, включала антитела к общелейкоцитарному антигену CD45, стволовоклеточному антигену СВ34, линейно-нерестриктированным антигенам CD38 и HLA-DR, антигенам миелоидной линии дифференцировки CD13 и CD33, моноцитарной - CD14 и CD64, эритроидной - гликофорину A (GlyA), мегакариоцитарной - CD61, общему антигену ОЛЛ CD10 (CALLA), В-линейным антигенам (CD19, CD20, CD22, CD23), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7, CD4, CD8) и NK-клеточному антигену CD56. Маркер расценивали как положительный при обнаружении его более чем на 20% бластов.
Исследование проводили методом трехцветной проточной цитометрии на приборе Facscan (“BD”, США). Субпопуляции лимфоцитов изучены в гейте клеток с низкими характеристиками SSC и высокой экспрессией антигена CD45 (гейт R1 на рисунке). Как отмечено на рисунке, бластная и лимфоцитарная популяции четко разделяются по CD45/SSC.
Результаты ОМЛ. Содержание миелокариоци-тов у больных ОМЛ (n = 57) в среднем составило 116 ± 17,1 • 109/л с широким диапазоном от 7 до 625 • 109/л. Преобладали случаи с нормоклеточным костным моз-
Таблица 1
Сравнение относительного и абсолютного количества CD4+-T-клеток между гранулоцитарными и моноцитоидными ОМЛ
Субпопуляция Вариант ОМЛ p
гранулоцитарный моноцитоидный
M ± m (n = 40) M ± m (n = 14)
CD4+
отн. (%) 25,8 ± 1,4 30,4 ± 2,2 0,005
абс. (-109 кл/л) 1,0 ± 0,2 1,2 ± 0,3 0,408
CD4/CD8 0,6 ± 0,04 0,9 ± 0,1 0,017
- 78 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
Таблица 2
Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных ОМЛ (М0-M5а-варианты) в зависимости от экспрессии на бластных клетках антигена CD7
Субпопуляция лимфоцитов Иммунофенотип ОМЛ
CD7+-ОМЛ (п = 10) CDy'-ОМЛ (п = 44) р
CD38, отн. (%) 31,2 ± 6,6 17,8 ± 2,0 0,010
CD38, абс. (• 109 кл/л) 1,3 ± 0,5 0,7 ± 0,2 0,110
CD8, отн. (%) 49,4 ± 4,6 41,1 ± 1,5 0,032
CD8, абс. (• 109 кл/л) 2,0 ± 0,5 1,4 ± 0,2 0,228
CD5, отн. (%) 81,0 ± 4,3 70,1 ± 2,2 0,038
CD5 абс., (• 109 кл/л) 3,2 ± 0,8 2,6 ± 0,4 0,469
Таблица 3
сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных ОМЛ (варианты М0-М5а) в зависимости от экспрессии на бластных клетках антигена HLA-DR
Субпопуляция Иммунофенотип ОМЛ
лимфоцитов HLA-DR+-ОМЛ HLA-DR'-ОМЛ р
HLA-DR, отн. (%) 25,6 ± 2,5 (п = 38) 16,0 ± 2,8 (п = 16) 0,028
HLA-DR, абс. (• 109 кл/л) 0,9 ± 0,2 (п = 37) 0,6 ± 0,2 (п = 17) 0,348
CD23, отн. (%) 6,6 ± 1,7 (п = 33) 21,5 ± 6,3 (п = 14) 0,004
CD23, абс. (• 109 кл/л) 0,3 ± 0,1 (п = 33) 1,0 ± 0,5 (п = 14) 0,026
гом (в диапазоне 44,5-196 тыс/мкл) - 49,2%, у трети пациентов костный мозг был гипоклеточным - 19 (33,3%) и лишь у 10 (17,5%) - гиперклеточным. Бластные клетки в костномозговых пунктатах больных ОМЛ составляли в среднем 72, 9 ± 2,7% всех миелокариоцитов (диапазон 20-97,4%). Пунктаты с нормальным процентом лимфоцитов составили большинство - 47,4%, со сниженным - 38,6%, с повышенным - всего 14%.
Общее количество Т-лимфоцитов, которое оценивали по экспрессии CD7-маркера, в костном мозге больных оМл составило 68,5 ± 2,1%, CD3+-T-клеток - 75,3 ± 2,0%, CD5+-T-клеток - 72,8 ± 2,0%. Уровень Т-хелперов (CD4+-клеток) был в среднем 27 ± 1,2%, ЦТЛ (CD8+-клеток) - 43,2 ± 1,5%, соотношение CD4/CD8-0,7 ± 0,04. Относительное содержание CD56+CD3"-NK-клеток определено в среднем 13,4 ± 1,3%, В-лимфоцитов - 11,6 ± 1,1%.
Установлены различия в содержании клеток-эффекторов костного мозга у пациентов с ОМЛ в зависимости от морфоцитохимического варианта лейкоза: относительное содержание Т-хелперов и иммунорегуляторный индекс достоверно выше при мо-ноцитоидном варианте ОМЛ по сравнению с таковым при гранулоцитарном (табл. 1).
Новым фактом, установленным в нашей работе, стало повышение количества лимфоцитов, коэкспрес-сировавших линейно не рестриктированные маркеры CD38+-HLA-DR+), у больных острыми моноцитоид-ными лейкозами по сравнению с пациентами с гра-нулоцитарным ОМЛ 8,4 ± 1,8% (п = 34) против 4,7 ± 0,8% (п = 13; p = 0,035).
При изучении субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных ОМЛ в зависимости от иммунофенотипических особенностей бластных клеток выявили ряд особенностей. Так, при коэкспрессии на миело-бластах Т-лимфоцитарного антигена CD7 был достоверно выше процент CD5+- и CD8+-T-клеток, а также активированных CD38+-лимфоцитов по сравнению с CD7-негативными ОМЛ (табл. 2).
При экспрессии HLA-DR-антигена на бластах имеется статистически достоверное повышение относительного количества лимфоцитов, экспрессирующих активационный маркер HLA-DR (p = 0,028). Но абсолютное количество HLA-DR-позитивных лимфоцитов при сравнении достоверно не различается (р = 0,348). При повышенной экспрессии HLA-DR-маркера отмечали достоверное повышение как относительного количества лимфоцитов с активационным маркером CD23 (р = 0,004), так и их абсолютного количества (р = 0,026) (табл. 3).
ОЛЛ. Содержание миелокариоцитов у больных ОЛЛ (п = 67) в среднем составило 176,6 ± 22,5 тыс/мкл с широким диапазоном от 5 до 720 тыс/мкл. Преобладали случаи с нормоклеточным костным мозгом (в диапазоне 44,5-196 тыс/мкл) - 47,6%, почти в трети случаев ОЛЛ клеточность была повышена (27,2%), в 20,4% отмечено снижение абсолютного количества миелокариоцитов. Бластные клетки в костномозговых пунктатах у пациентов с ОЛЛ в среднем составили 86,5 ± 1,8% всех мие-локариоцитов (диапазон 28,2-99,2%). В большинстве (61%) пунктатов отмечали снижение процента лимфоцитов, нормальное относительное количество лимфоцитов выявили у 36,4%, повышенное - всего у 2,6%.
Среди субпопуляций лимфоцитов костного мозга у больных ОЛЛ мы определили 71,1 ± 2,5% CD7-позитивных Т-лимфоцитов, CD3+-T-клеток - 71,5 ± 2,3%, CD5+-T-клеток - 74,1 ± 2,1%. Уровень Т-хелперов (CD4+-клеток) составил 33 - 1,9%, цТл (CD8+-клеток) -36,3 ± 2,3%, иммунорегуляторный индекс - 1,3 ± 0,2. Относительное содержание CD56+CD3"-NK-клеток было в среднем 15,2 ± 1,9%, В-лимфоцитов - 10,2 ± 1,2%.
При изучении субпопуляций лимфоцитов костного мозга у пациентов с В-линейными ОЛЛ выявили различия в количестве Т-лимфоцитов в зависимости от степени дифференцировки лейкоза. Так, процент CD3+-T-клеток выше у больных пре-пре-В-иммуноподвариантом по сравнению с таковым у пациентов с пре-В-подвариантом (75,2 ± 2,5% (п = 24) против 62,1 ± 5,4% (п = 13; р = 0,016).
Субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга у больных ОЛЛ взаимосвязан с линейной коммитированностью бластных клеток: относительное содержание зрелых CD3+-T-клеток существенно выше при лейкозах из В-линейных предшественников по сравнению с пре-Т-клеточными лейкозами (75,6 ± 2,1% (п = 27) против 62,1 ± 5,4% (п = 12; р = 0,006).
Установили взаимосвязь лимфоцитарных популяций и особенностей иммунофенотипа бластов при ОЛЛ. При стволовоклеточных CD34+-ОЛЛ достоверно выше процент CD3+-T-клеток в случае В-линейных по сравнению с Т-линейными лейкозами (76,4 ± 2,2% (п = 22) против 59,3 ± 11,4% (п = 6; р = 0,022). Но при сравнении абсолютного количества CD3+-T-клеток между этими группами достоверных различий не выявили. При CD38-позитивных ОЛЛ количество CD3+-
- 79 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
Таблица 4
Сравнение относительного и абсолютного количества CD4+-T-клеток и CD8+-T-клеток у больных ОМЛ и ОЛЛ
Субпопуляция ОМЛ (n = 57) ОЛЛ (n = 34) p
CD4+
отн. (%) 27, 0 ± 1,2 33,0 ± 1,9 0,006
абс. (• 109 кл/л) 1,0 ± 0,1 1,3 ± 0,2 0,160
CD8+
отн. (%) 43,2 ± 1,5 36,3 ± 2,3 0,011
абс. (• 109 кл/л) 1,5 ± 0,2 1,3 ± 0,2 0,371
CD4/CD8 0,7 ± 0,04 1,3 ± 0,2 0,003
Т-клеток достоверно выше в случае В-линейных ОЛЛ по сравнению с пре-Т-ОЛЛ (73,3 ± 2,5% (n = 21) против 62,1 ± 5,4% (n = 13; p = 0,042), абсолютные количества не различались (p = 0,710).
Сравнительная характеристика субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга у больных ОМЛ и ОЛЛ. Общее количество Т-клеток, которое оценивали по экспрессии CD3-, CD5- и CD7-антигенов, у пациентов с ОМЛ и ОЛЛ не различалось, как и относительное содержание CD56+CD3"-NK-клеток и В-лимфоцитов (p > 0,05). Следовательно, различия в содержании лимфоцитарных популяций костного мозга при развитии острого лейкоза в основном затрагивают клетки-эффекторы - Т-хелперы (CD4+) и ЦТЛ (CD8+).
При сравнении относительного содержания субпопуляций Т-лимфоцитов костного мозга у больных ОМЛ и ОЛЛ отметили, что процент ЦТЛ достоверно выше у пациентов с ОМЛ (p = 0,011), а процент Т-хелперов достоверно выше у больных ОЛЛ (p = 0,006). Достоверные различия иммунорегуляторных индексов CD4/CD8 у этих двух групп пациентов (p = 0,003) подтверждают сделанное нами наблюдение (табл. 4). Высокий иммунорегуляторный индекс, полученный нами при оценке Т-клеточных субпопуляций костного мозга у больных ОЛЛ (1,3 ± 0,2), свидетельствует о преобладании Т-хелперов над ЦТЛ.
В результате количества лимфоцитов костного мозга у пациентов с ОМЛ и ОЛЛ, коэкспрессирующих маркеры CD38+ и HLA-DR+, установили, что у больных ОЛЛ достоверно выше как относительное количество данной субпопуляции (11,8 ± 2,7% (n = 10) против 5,6 ± 0,8% (n = 48); p = 0,004), так и абсолютное содержание этих клеток (0,6 ± 0,2 тыс/мкл против 0,2 ± 0,04 тыс/мкл; p = 0,013).
Состав лимфоцитарных популяций различается при экспрессии линейно не рестриктированных антигенов на бластах независимо от варианта острого лейкоза: при HLA-DR-негативных ОМЛ отметили более высокое содержание Т-лимфоцитов (CD45+CD3+-клеток) по сравнению с HLA-DR-негативными ОЛЛ (75,6 ± 3,9% (n = 17) против 55,2 ± 7,7% (n = 07); p = 0,016).
Обсуждение. В период диагностики острых лейкозов отмечаются существенные изменения содержания лимфоцитов и их субпопуляций в костном мозге у больных, что можно расценить как одну из причин развития острого лейкоза или как следствие подавления нормального гемопоэза лейкемическими клетками. Количественные изменения касаются как
общего содержания лимфоцитов, так и отдельных звеньев клеточного иммунитета.
Проведение количественной оценки лимфоцитарных популяций костного мозга у пациентов с острым лейкозом в сравнении с нормой в настоящее время было затруднено из-за отсутствия референсных значений нормального содержания (относительного и абсолютного) Т-, В- и NK-клеток в костном мозге. В литературных источниках приводятся либо устаревшие данные, либо полученные без CD45-гейтинга зрелых лимфоцитов. Наиболее приемлемыми можно считать данные E. Rego и соавт. [11], так как авторы изучали лимфоциты, выделенные из трепанобиоптатов, и примесь периферической крови в данном случае исключена. Но важно отметить отсутствие в данной работе гейтинга лимфоцитарной популяции по экспрессии общелейкоцитарного антигена CD45, поэтому среди проанализированных клеток могла быть значительная примесь клеток-предшественников и моноцитов, что привело к завышению результатов.
Вместе с тем субпопуляционный состав лимфоцитов при острых лейкозах изучен достаточно подробно с использованием CD45-гейтинга R. Ratei и соавт.
[10]. Авторы оценили эффективность гейтинга лимфоцитарной и бластной популяций костного мозга у больных острым лейкозом в дебюте заболевания. Относительное содержание лимфоцитов исследователи анализировали в гейте SSQow/CD45++-лимфоцитов. Процент CD7+-Т-клеток был в пределах 57-74%, процент CD3+ Т-клеток - 68-72%, процент В-лимфоцитов (CD19+-популяция) - 14-20% по результатам разных лабораторий. Мы можем отметить, что полученные R. Ratei и соавт. данные практически точно совпадают с нашими результатами.
В костном мозге у проанализированных нами пациентов с ОМЛ все Т-лимфоциты являлись зрелыми; их относительное количество, оцениваемое по общим Т-клеточным маркерам (CD3, CD5, CD7), значительно повышено в сравнении с нормой по данным E. Rego и соавт. [11], что позволяет поддерживать абсолютное содержание Т-клеток на нормальном уровне на фоне снижения общего количества лимфоцитов костного мозга.
В работе установлены различия в субпопуляционном составе лимфоцитов костного мозга у больных ОМЛ в зависимости от нозологического варианта острого лейкоза: процент Т-хелперов достоверно выше при моноци-тоидном варианте ОМЛ, чем при гранулоцитарном (p = 0,005), что нашло также отражение в достоверном различии иммунорегуляторных индексов у данных групп пациентов (p = 0,017). В случае моноцитоидных ОМЛ соотношение CD4/CD8- составило 0,9 ± 0,1, что означает практически равное количество ЦТЛ и Т-хелперов. Но при гранулоцитарном ОМЛ процент ЦТЛ почти вдвое превышал процент Т-хелперов, CD4/CD8 - 0,6 ± 0,04. Это наблюдение можно объяснить или большей выраженностью компенсаторного повышения процента Т-хелперов в случае моноцитоидных ОМЛ, или более высокими цитотоксическими свойствами миелобластов в случае гранулоцитарных ОМЛ, к которым Т-хелперы оказались более чувствительны [5, 9].
Существуют единичные публикации о том, что у первичных больных ОМЛ повышено содержание NK-клеток костного мозга по сравнению с таковым у здоровых лиц [13], которое при снижении NK-активности
- 80 -
ИММУНООНКОЛОГИЯ
создает впечатление о существовании дефектной NK-клеточной функции. Это подтверждено результатами последующих работ, в которых выявлены у большинства первичных пациентов с ОМЛ (66,2%) снижение цитолитической функции вследствие дефектной экспрессии рецепторов натуральной цитотоксичности [6], а также ингибиторный фенотип основных рецепторов (KIRs и CD94/NKG2) у 100% NK-клеток больных ОМЛ [12]. В нашей работе отмечено относительное повышение NK-клеток костного мозга у пациентов с ОМЛ при сравнении с нормой по E. Rego и соавт. [11] и M. Vidriales и соавт. [13]. Основываясь на результатах процитированных статей, посвященных противолей-кемическому NK-клеточному иммунитету, мы можем предполагать, что NK-клетки у обследованных нами больных ОМЛ имели, возможно, дефектную литическую активность в отношении бластов.
По сравнению с нормой (по E. Rego и соавт. [11]) относительное содержание CD4+-Т-клеток костного мозга у пациентов с ОЛЛ также было повышено. Этот результат может свидетельствовать о выраженной Т-хелперной защитной реакции костного мозга в ответ на пролиферацию лейкозного клона. Поэтому мы можем предполагать, что у больных ОЛЛ нет количественного дефицита Т-хелперов.
Повышение относительного содержания Т-цито-токсических клеток (CD8+) в костном мозге у пациентов с ОЛЛ не столь выражено, как уровень Т-хелперов. За счет этого абсолютное количество ЦТЛ, по нашим данным, не достигает нормальных значений при общем снижении количества лимфоцитарной популяции. Иммунорегуляторный индекс лимфоцитов костного мозга у больных ОЛЛ (1,3 ± 0,2) показывает значительное преобладание Т-хелперов над ЦТЛ. P. Yotnda и соавт. [16] отмечали, что CD4+- и CD8+-субпопуляции Т-клеток были в равной степени чувствительны к активационно-индуцированному апоптозу.
Обнаруженные различия дают основание полагать, что при отдельных иммуноподвариантах В-ОЛЛ имеются свои особые нарушения Т-клеточного и NK-клеточного иммунитета, что может быть обусловлено воздействием на лимфоциты бластных клеток различной степени дифференцировки и иммуногенности, с различной степенью экспрессии костимуляторных молекул, участвующих в распознавании лейкемиче-ских антигенов. Все эти факторы могут приводить к различной активации Т- и NK-клеток, следствием чего являются различные количественные характеристики субпопуляций лимфоцитов костного мозга у данных групп пациентов.
В нашей работе проводили подсчет CD56+CD3-NK-клеток костного мозга у взрослых больных ОЛЛ. По итогам анализа мы отметили повышенное относительное содержание этой субпопуляции (по сравнению с данными E. Rego и соавт.), что может быть компенсаторным, направленным на нормализацию абсолютного количества этих клеток. Вместе с тем, как выявлено в исследовании S. Verheyden и соавт. [12], 100% NK-клеток костного мозга у пациентов с ОЛЛ имели ингибиторный фенотип основных рецепторов (KIRs и CD94/NKG2), что послужило причиной NK-клеточного иммунодефицита.
При сравнении процентного содержания Т-клеток, NK-клеток и В-лимфоцитов у больных ОМЛ и ОЛЛ раз-
личий не выявили. Однако относительное количество CD8+-Т-клеток у пациентов с ОМЛ достоверно выше, чем у больных ОЛЛ (р = 0,011). Это может свидетельствовать о большей степени компенсаторного повышения количества клеток-эффекторов у пациентов с ОМЛ.
Полученные результаты хорошо согласуются с данными литературы. Известно, что при ОМЛ выражено цитотоксическое воздействие миелоидных бла-стов на Т-лимфоциты [5, 9], в частности, Т-хелперы у больных ОМЛ более чувствительны к такому воздействию миелобластов. В литературных источниках мы не встретили данных о подобной выраженной цитотоксичности лимфобластов.
Мы проанализировали количество Т-лимфоцитов в зависимости от фенотипических особенностей бластов и коэкспрессии на них различных маркеров. Как известно, лейкозы с различным фенотипом отличаются рядом морфологических, цитохимических и иммунофенотипических особенностей [2]. В нашей работе выявлена взаимосвязь субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга у больных острым лейкозом с иммунофенотипическими особенностями бластных клеток, что наблюдалось при сравнении субпопуляций пациентов с ОМЛ и ОЛЛ в зависимости от экспрессии линейно не рестриктированных антигенов на бластах, а также в пределах морфоцитохимических вариантов ОМЛ и иммуноподвариантов ОЛЛ. При CD38-mзитивных ОЛЛ количество CD3+-Т-клеток достоверно выше в случае В-линейных ОЛЛ по сравнению с таковым при пре-Т-ОЛЛ (p = 0,042). Этот факт чрезвычайно важен и нуждается в дальнейшем изучении. Дело в том, что в целом по группе экспрессия CD38 не ассоциировалась с большей выраженностью уровня Т-клеток. Однако в группе CD38-mзитивных ОЛЛ процент CD3+-клеток в костном мозге у больных В-линейными ОЛЛ был достоверно выше, чем при Т-линейных ОЛЛ, что отражает общую закономерность преобладания CD3+-клеток в костном мозге у пациентов с В-линейными ОЛЛ в сравнении с Т-линейными ОЛЛ при диагностике. Прямой ассоциации экспрессии CD38 с В-линейностью не отмечено. Напротив, частота экспрессии CD38-антигена при лейкозах из В-линейных предшественников составила 69,3%, а при Т-линейных - 100%. При экспрессии CD7-антигена на миелобластах выше процент CD5+-T-клеток, ЦТЛ и CD38+-лимфоцитов, чем при отсутствии CD7-маркера. Мы можем предположить, что экспрессия на бластах линейно не рестриктированных маркеров, а также маркеров, характерных для другого варианта острого лейкоза, вносит свой вклад в биологические особенности лейкемических клеток, в частности, влияет на их способность оказывать цитотоксическое воздействие на Т-лимфоциты, индукцию анергии либо апоптоза или, напротив, повышает иммуногенные свойства бластных клеток. Можно предположить также наличие пока не выявленных механизмов взаимодействия лимфоцитарной и бластной популяций, зависящих от особенностей фенотипа бластов и экспрессии на них линейно не ре-стриктированных молекул и антигенов, характерных для другого варианта острого лейкоза. Наши данные указывают на то, что изучения лимфоцитарной популяции костного мозга у больных острым лейкозом без учета особенностей бластной популяции недостаточно.
Таким образом, по результатам нашего исследования было определено, что существуют достоверные
- 81 -
ИММУНОЛОГИЯ № 2, 2012
различия количественного состава лимфоцитарных популяций в зависимости от нозологического варианта острого лейкоза. Эта закономерность характерна как для двух основных вариантов (ОМЛ и ОЛЛ), так и для морфоцитохимических вариантов ОМЛ и иммунофенотипических вариантов ОЛЛ. Кроме того, выявлены достоверные различия содержания лимфоцитарных популяций в зависимости от особенностей иммунофенотипа бластных клеток.
ЛИТЕРАТУРА
1. Владимирская Е. Б. Биологические основы лейкемогенеза // Механизмы кроветворения и лейкемогенеза. - М., 2007. - С. 67-85.
2. Купрышина Н. А. Иммунофенотипическая и морфоцитохимическая характеристика острых миелоидных лейкозов с экспрессией антигена стволовых клеток CD34 // Иммунол. гемопоэза. - 2006. - Т. 3, № 1. - С. 70-89.
3. Савченко В. Г., Паровичникова Е. Н. Острые лейкозы // Клиническая онкогематология. - М., 2007. - С. 409-501.
4. Brown V I., Seif A. E., Reid G. S. D. et al. Novel molecular and cellular therapeutic targets in acute lymphoblastic leukemia and lymphoproliferative disease // Immunol. Res. - 2008. - Vol. 42, N 1-3. - P. 84-105.
5. Buzyn A., PetitF., Ostankovitch M. et al. Membrane-bound Fas (APO-1/CD95) ligand on leukemic cells: a mechanism of tumor immune escape in leukemia patients // Blood. - 1999. - Vol. 94, N 9. - P. 3135-3140.
6. Fauriat C., Just-Landi S., Mallet F. et al. Deficient expression of NCR in NK cells from acute myeloid leukemia: evolution during leukemia treatment and impact of leukemia cells in NCR dull phenotype induction // Blood. - 2007. - Vol. 109, N 1. - P. 323-330.
7. Igney F. H., Krammer P. H. Immune escape of tumors: apoptosis resistance and tumor counterattack // J. Leukocyte Biol. - 2002. - Vol. 71. - P. 907-920.
8. Le Dieu R., Taussig D. C., Ramsay A. G. et al. Peripheral blood T cells in acute myeloid leukemia (AML) patients at diagnosis have abnormal phenotype and form defective immune synapses with AML blasts // Blood. - 2009. - Vol. 114, N 18. - P. 3909-3916.
9. Orleans-Lindsay J. K., Barber L. D., Prentice H. G., LowdellM. W. Acute leukemia secrete a soluble factor that inhibits T and NK cell proliferation but not cytolytic function - implications for the adaptive immunotherapy of leukaemia // Clin. Exp. Immunol. -2001. - Vol. 126. - P. 403-411.
10. RateiR., KarawajewL., Lacombe F. et al. Normal lymphocytes from leukemic samples as an internal quality control for fluorescence intensity in immunophenotyping of acute leukemias // Cytometry. Pt B (Clin. Cytometry). 2005. - Vol. 70B. - P. 1-9.
11. Rego E. D., Garcia A. B., Viana S. R., Falcao R. P. Age-related changes of lymphocyte subsets in normal bone marrow biopsies // Cytometry. - 1998. - Vol. 34. - P. 22-29.
12. Verheyden S., Bernier M., Demanet C. Identification of natural killer cell receptor phenotypes associated with leukemia // Leukemia. - 2004. - Vol. 18. - P. 2002-2007.
13. Vidriales M. B., Orfao A., Lopez-Berges M. C. et al. Lymphoid subsets in acute myeloid leukemias increased number of cells with NK phenotype and normal T cell distribution // Ann. Hematol. -1993. - Vol. 67. - P. 217-222.
14. VollmerM., LiL., Schmitt A. et al. Expression of human leukocyte antigens and co-stimulatory molecules on blasts of patients with acute myeloid leukaemia // Br. J. Haematol. - 2003. - Vol. 120. -P. 1000-1008.
15. YangL., Han Y., SaurezSaizF., MindenM. D. A tumor suppressor and oncogene: the WT1 story // Leukemia. - 2007. - Vol. 21. - P. 868-876.
16. YotudaP., MintzP., Grigoriadou K. et al. Analysis ofT-cell defects in the specific immune response against acute lymphoblastic leukemia cells // Exp. Hematol. - 1999. - Vol. 27. - P. 1375-1383.
Поступила 30.09.11
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 612.118.24.084
В. А. Романов1, И. П. Зайцева2, А. Ю. Кулибин2
НОРМАЛЬНЫЕ И АНАМНЕСТИЧЕСКИЕ АНТИТЕЛА В КРОВИ ЗДОРОВЫХ ЛЮДЕЙ
при различных физиологических состояниях
1ГОУ ВПО Ярославская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ (150000, г. Ярославль, ул. Революционная, д. 5); 2ГОУ ВПО Ярославский государственный университет им. П. Г. Демидова
Исследован уровень нормальных и анамнестических антител к некоторым патогенным энтеробактериям, столбнячному и дифтерийному токсинам в сыворотках крови 140 здоровых нетренированных студентов, 107 студентов-спортсменов мужского пола, 86 молодых здоровых неучащихся нетренированных лиц, а также 155 здоровых людей 16 - 66 лет в зависимости от психофизических нагрузок, пола, уровня физической тренированности, возраста и времени года. Антитела к сальмонеллам определяли с помощью реакции агглютинации к шигеллам, дифтерийному и столбнячному токсинам - РНГА. Установлено, что умеренные занятия физической культурой позитивно отражаются на содержании нормальных и анамнестических антител. У студентов-спортсменов с высокой физической нагрузкой содержание ряда антибактериальных антител снижено. Наиболее высокие титры выявлены летом, наиболее низкие - зимой и весной. Не выявлено разницы в концентрации нормальных и анамнестических антител в зависимости от пола и возраста в диапазоне 16 - 66 лет.
Ключевые слова: патогенные энтеробактерии, антитела, занятия физической культурой
- 82 -
