Иммунофенотипическая диагностика острых лейкозов методом проточной цитометрии Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, № 1-2, стр 9-24 © 2004, СПб РО РАЛКИ

Обзоры

ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА ОСТРЫХ ЛЕЙКОЗОВ МЕТОДОМ ПРОТОЧНОЙ ЦИТОМЕГРИИ

Зуева Е.Е., Афанасьев Б.В., Тотолян А.А.

Государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова,

Санкт-Петербург, Россия

Резюме. Проточная цнтомстрия является методом выбора для определения линейной принадлежности и уровня дифференцпровки клеток, так как позволяет получать объективную информацию об иммунологических особенностях лепкозных бластов при диагностике острых лейкозов и лимфом. Спектр антигенов, выявление которых необходимо для определения конкретной нозологической формы гемобластоза, известен. Несоответствие фенотипов опухолевой п нормальной клеток дает возможность выявления лепкозных бластов по аберрантпости экспрессии маркерных молекул, но невозможно рекомендовать единственно правильные сочетания антител. Обзор современных подходов к иммумофеиотипическон диагностике острых лейкозов, критериев оценки данных проточной цитометрии и проблем клинической интерпретации привели к идее использования якорных маркеров при проведении многоцветного окрашивания флюорохром-конъгагнрованпыми антителами. Предложен вариант сочетания моноклональных антител, необходимых для диагностики острого лейкоза, с якорными маркерами при использовании трехцветного окрашивания. При выявлении позитивности бластов по определенному якорному маркеру, его экспрессия позволяет идентифицировать леикозные клетки и оценить уровень экспрессии других маркеров в популяции патологических клеток, вне зависимости от соотношения опухолевых и нормальных клеток в образце. Такой подход выделения лейкозных клеток может быть положен в основу диагностики минимальной остаточной болезни методом проточной цитометрии. Воспроизводимость результатов экспрессии якорных маркеров может быть расценена как критерий контроля качества пробоподготовки и анализа данных проточной цптомет-рии. На основе анализа современного состояния проблемы информативности иммупофсиотипических данных составлен алгоритм последовательного анализа данных для формулировки пммунофенотпнпческого диагноза острого лейкоза.

Ключевые, слова: иммунофенотипироиание, острый лейкоз, проточная цитометрия, якорные маркеры.

Zueva Ye.Ye., Afanasiev В. V., Totolinn A.A.

FLOW CYTOMETRIC IMMUNOPHENOTYPING OF ACUTE LEUKEMIA

Abstract. At present, the flow cytometry represents the method of choice for the lineage assignment and mat-urational analysis of cells, and for receiving objective data concerned immunological properties of leukemic cells. The antigens' list to define hematologic diseases is known. The discordance of phenotypes of normal and blast cells allows detecting leukemic cells by their aberrant phenotype, but is impossible to recommend a single correct antibody’s combination. The review of current methods of phenotyping hematological neoplasias and criteria of flow data interpretation lead us up to the including anchor antibodies in multicolor fluoresent analysis. It is proposed a way to combine monoclonal antibodies for acute leukemia’s diagnostics with anchor antibodies using three-color analysis. The detection of anchor marker’s positive blasts allows to identify leukemic cells and evaluate the level of markers’ positivity in any kind of biologic materials, with any quantity of normal and malignant cells. Such manner of gating leukemic blasts might be used as a basis of determination of aberrant antigen co-expression and flow cytometric residual disease detection. The reproducibility of anchor’s antibodies expression might be used as a basis of quality assurance and support quantitative analysis of antigen densities. The information provided by the Ад~~ес для tie списки • ^ow сУ*-отс1гУ inimunophenotyping is of great clinical

Зуева Екатерина Евгеньевна, км.н., ст.н.с., utility and is useful to founulate the algoiithm of con-

НМЦ no молекулярной медицине М3 РФ СП6ГМУ, secutive flow data analysis for clinical interpretation and

197089, Россия, Санкт-Петербург, ул. Л.Толстого, 6/8. conclusion of hematological malignancy. (Med. Immu-

Тел/факс: +7 (812) 238-71-94. no[ 2004, vol.G, № 1-2, pp 9-24)

E-mail: din2u@1nail.ru

При диагностике онкогематологических заболеваний необходимо выявить популяцию патологических клеток и охарактеризовать ее. Для получения характеристик опухолевых клеток используют методы морфологии, иммуноцитохимии, проточной цитометрии, цитогенетики и молекулярной биологии, включая флюоресцентную гибридизацию in situ (FISH), полимеразную ценную реакцию [7, 48] и другие. Кариотипированне и молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где они проводятся, получение информации отсрочено по времени. С клинической точки зрения, это чаще всего подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его. Существующий разрыв во времени между получением биологического материала и результатами молекулярно-биологических методов, особенно заметный в онкологии II он-когематологии [36], приводит к тому, что для практических целей оказались максимально адаптированы и дают наиболее воспроизводимые результаты иммуноцитохимия (световая и люминесцентная микроскопия) и проточная цитометрия [8, 10]. При этом не только в клинически сложных случаях, но и в повседневной практике микроскопия все чаще уступает место проточной цитометрии, ставшей основным методом нммунофенотипировапия (ИФТ) в диагностике гемобластозов [68]. На наш взгляд, отсутствие алгоритма последовательной оценки маркеров, описывающих основные ростки кроветворения при интерпретации данных анализа биологического материала пациентов онкогема-тологического профиля, может исказить иммуно-фенотипический диагноз, который в значительной мере определяет характер и время начала терапии с использованием новых протоколов и методов лечения, включающих трансплантацию гемопоэти-ческих стволовых клеток.

В основе лабораторной диагностики острых лейкозов (OJI) лежит выявление в периферической крови, костном мозге или спинномозговой жидкости бластных клеток [3]. Подробное морфологическое и цитохимическое [5] описание разных типов бластов обязательно присутствует в каждом руководстве по онкогематологии [6, 4], но фактически требует от патолога значительного опыта, времени и далеко не всегда дает возможность однозначно описать бласты, принадлежащие к разным клеточным линиям и уровням дифферепцировки [26,50, 38]. Морфологические критерии классификации, разработанной в конце 1970-х годов патологами и гематологами Франции, Америки и Великобритании (ФАБ), сохранили свою значимость для оценки бластов миелоидного, но не лимфоидного про-

нсхождения [56, 27]. В настоящее время основой для диагностики заболеваний, связанных с пролиферацией гемопоэтическнх клеток предшественников и клеток крови на разных стадиях дифферен-цировки служит классификация ВОЗ (2000 г.) [27], наряду с которой применяют и ранее разработанные иммуногематологнческие классификации [45,

37, 35]. Так как ранее, в 80-е годы XX пека, острый лейкоз рассматривался как блокирование диффе-ренцировки клетки на определенной стадии развития, то и варианты лейкозов получили свое название соответственно стадиям дифферепцировки, антигены которых выявлялись набластах в первую очередь [39, 51]. В соответствии с этими представлениями при постановке диагноза учитывалась экспрессия каждого маркера отдельно, как самостоятельный признак (табл. 1,2,3,4) [ 17,76]. Такой подход был обусловлен не только теоретическими представлениями о патогенезе острого лейкоза, но и методическими возможностями ИФТ. В настоящее время очевидно, что клональность происхождения не означает неизменности фенотипических характеристик лейкозных бластов в течение болезни, но нозологические формулировки сохранили прежнее звучание. Иммунодиагностика гемобластозов основана на сопоставлении морфофункциональных характеристик лейкозных бластов и нормальных клеток гемопоэза [12, 34, 31 ]. Так как /шя нетрансформированных клеток спектр маркерных молекул хорошо известен, то он используется для определения линейной принадлежности и варианта нарушения дифферепцировки патологических клеток, что необходимо для формулировки имму-нофепотипического диагноза в рамках применяемых классификации. Использование многомерной ПЦ показало, что практически у всех пациентов с острыми лейкозами фенотип патологических клеток является аберрантным, не полностью соответствующим какому-то определенному уровню днф-ференцировки гемопоэтической клетки. Эта аномальная экспрессия отражает генетические изменения, лежащие в основе опухолевого перерождения лейкозной клетки [49]. Выявление трансформированных клеток с разнообразными фенотипическими аберрациями и экспрессией нетипичных для данной линии гемопоэза маркеров позволяет определить случаи с максимальной вероятностью множественных генетических поломок, что может быть подтверждено методами молекулярной диагностики [30,29,32]. Накопление признаков злокачественности, являющееся одним из проявлений опухолевой прогрессии, в некоторых случаях приводит к изменению антигенной экспрессии в течение заболевания в ответ на адекватную химиотерапию [61,42] и требует использования широкой панели марке-

Табл. 1. ФЕНОТИПИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОЗНЫХ БЛАСТОВ ПРИ В-ОЛЛ

Варианты В-ОЛЛ* Положительные маркеры Отрицательные маркеры Маркеры, экспрессия которых нестабильна

В1 РгоВ ранний В ФАБ L1 cyCD79a, CD19, HLA-Dr, TdT CD10, CD22, cylgm, slg

BII Common ранний В ФАБ L1-2 CD10, CD19, HLADR, TdT, cyCD79a cylgm, slg CD20

Bill РгеВ ФАБ L2-1 cyCD79a, CD10, CD19, HLA-Dr, TdT, cylgm slg CD20

BIV В зрелый ФАБ L3 cyCD79a, CD19,HLA-Dr, CD20, cylgm, slg (каппа или ламбда цепи) Tdt, СОЮ

Примечание: * - названия указаны согласно различным, наиболее широко распространенным классификациям. Табл. 2. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА Т-ОЛЛ

Основные ТИПЫ Положительные маркеры Отрицательные маркеры Маркеры, экспрессий которых нестабильна

ранний cyCD3, CD7 sCD3, CD4, CD8

промежуточный cyCD3, CD1a sCD3 CD4, CD8

поздний sCD3, CD4 и/или CD8 CD1a

Табл. 3. ИММУНОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОСТРЫХ МИЕЛ0ЛЕЙК030В В СООТВЕТСТВИИ С ФАБ-КЛАССИФИКАЦИЕЙ

ФАБ-классификация острых миелолейкозов ОМЛ Положительные маркеры Отрицательные маркеры Маркеры, экспрессия которых нестабильна

МО миелобластный с минимальной миелоидной дифференцировкой бластов МПО в цитоплазме, TdT CD14, CD15, CD41, CD61, гликофорин А CD4, CD7, CD13, CD33, CD34, HLADR

М1 миелобластный без созревания МПО, CD33, CD34, HLADR CD11.CD14, CD41 CD11b, CD13, CD15

М2 миелобластный с созреванием CD11, CD13, CD15, CD33, HLADR CD41 CD11 b, CD14, CD34

М3 промиелоцитарный МЗу гипогранулярный вариант CD9, CD13, CD15, CD33 CD34, CD41, HLADR CD2, CD11b, CD14,

М4 миеломонобластный М4эоз миеломонобластный с эозинофилией HLADR, CD11Ь, CD13, CD14, CD15, CD33 CD2 при М4эо CD41 CD34

М5а монобластный без созревания М5в монобластный с созреванием CD11Ь, CD13, CD14, CD15, CD33, HLADR CD41 CD346 CD56

Мб острый эритромиелоэ Гликофорин А CD11.CD13, CD14 CD15, CD33, CD34, HLADR

М7 мегакариобластный CD33, CDD41, CD42, CD61 МПО, CD14, CD15 HLADR, CD13, CD34

И

Табл. 4. БАЛЛЬНАЯ ОЦЕНКА ЭКСПРЕССИИ МАРКЕРОВ ПРИ ПОДОЗРЕНИИ НА БИФЕНОТИПИЧЕСКИЙ ЛЕЙКОЗ

Балл Маркеры В ряла Маркеры T ряда Маркеры миелоряда

CD79a CD3 (cy/mem) МПО (cy/mem)

2 cylgM TCRa/p (лизоцим. лактоферрин)

cyCD22 TCRy/б

CD2 CD13

CD19

С 05 CD33

1 CD10

CDS CDw65

CD20

CD10

CD14

TdT

TdT CD15

0,5 CD7

CD24 CD64

CD1a

CD117

ров не только для первичной диагностики, но и для верификации эффективности химиотерапии. Постоянно увеличивающееся количество определяемых параметров позволяет описывать все более сложные иммунофенотипы нетрансформирован-ных и злокачественных бласгов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку среди нормальных клеток крови и костного мозга [11, 28]. Таким образом, именно абср-рантность антигенной экспрессии позволяет отличить здоровые клетки от патологических при анализе биологического материала пациентов с подозрением на онкогематологическое заболевание. К основным типам аберрантности фенотипа [44] при острых лейкозах относятся

• эктопическая, (например, тимус-ассоциирован-ная при Т-клеточлом остром лимфобластном лейкозе, при которой в костном мозге или периферической крови выявляют бласты с фенотипом тимических лимфоцитов);

• полное отсутствие или низкий уровень экспрессии антигена, характерного для данной стадии диф-ференцировки (рис.1);

• одновременная экспрессия антигенов разных стадий дифференцировки (рис.2 А, Б);

• избыточная экспрессия антигена (например, очень высокий уровень экспрессии СБЮ при В II варианте острого лимфобластного лейкоза);

• выявление маркеров другой линейной принадлежности, т.е. лимфоидных маркеров при миелолей-козах или мнелоидных маркеров при лимфобластных лейкозах (в частности, в 20% случаев ОМЛ на миелобластах выявляется экспрессия СБ7) (рис.2 В).

Аберрантность экспрессии отражает генетические изменения, лежащие в основе трансформации лейкозной клетки, позволяя выявлять опухолевые

клетки даже при относительно небольшом их содержании в образце [72]. Подробный иммунофено-типический профиль лейкозных клеток, полученный при диагностике заболевания, должен быть использован для верификации эффективности химиотерапии и выявления минимальной остаточной болезни. Отличия фенотипического профиля лейкозных клеток могут быть выявлены и оценены только при использовании методов, предполагающих оценку физических характеристик и экспрессии нескольких маркеров одновременно па одной клетке. Многомерный анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца и время анализа, сокращая путь от получения биологического материала до клинически востребованного результата - ответа лаборатории клинике [41].

При подозрении на злокачественное гематологическое заболевание всегда возникает три вопроса: необходимо ли лабораторное исследование; как оно должно быть проведено; какова смысловая нагрузка получаемых данных для конкретного пациента (медицинская интерпретация) [59]. Острый лейкоз - это клональное злокачественное новообразование, в основе которого лежит дефект стволовых клеток различного уровня либо поражение кле-ток-предшсственпикои. Неопластически трансформированные клетки, обладающие способностью к подавлению нормального гемопоэза и инфильтрирующие костный мозг, постепенно вытесняют и угнетают нормальные ростки кроветворения, а затем, в процессе лейкозной трансформации постепенно утрачивают необходимость и стромальной поддержке и заселяют органы, которые принимали участие в гемопоэзе на различных стадиях онтогенеза. Дальнейшая опухолевая прогрессия приводит к тому, что бласты могут поражать практически любой орган. Таким образом, сам патогенез заболева-

ния предполагает исследование костного мозга как основного биологического материала при диагностике ОЛ [68], а первым шагом диагностики является выявление патологических клеток и определение их количества относительно других ядросодержащих клеток [77]. Виды биологического материала, направляемого для выявления лейкоза или лим-фомы и определения их природы, достаточно раз-

нообразны: это периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, ликвор, плевральная жидкость и т.д. Получение их требует инвазивного вмешательства и небезопасно для пациента, а качество часто страдает из-за сгустков, гемолиза, недостаточного объема и низкой клеточности. Поэтому необходимо использовать наименее травматичные для клетки протоколы пробоподготовки и исклю-

Рис.1. Двумерные гистограммы БЭС/СОЗЗ. Представлены данные костного мозга больных острым миелобластным лейкозом (ОМЛ), вариант М3. А - гипогранулярный вариант М3. Полное замещение костномозгового кроветворения миелобластами. В образце отсутствуют неизмененные лейкоциты. Бласты обладают низким уровнем гранулярности и экспрессируют панмиелоидный маркер СйЗЗ. Б - классический вариант ОМЛ, М3. Бласты обладают некоторым уровнем гранулярности и достаточно высоким уровнем экспрессии СОЗЗ. Графически (овалом) обозначено место неизмененных гранулоцитов с сохранным уровнем экспрессии СОЗЗ.

CD10

VV ,•

CD22

CD3

CD7

Рис.2. Примеры аберрантности иммунофенотипического профиля лейкозных бластов при ОЛ. А - асинхронная экспрессия антигенов, относящихся к разным стадиям дифференцировки. На гистограмме представлен костный мозг больной 14 лет с В-клеточным ОЛЛ (Common вариант). Основная масса бластов одновременно экспрессирует CD 10 и CD22, т.е. определяется одновременная экспрессия ранних и поздних антигенов. Б - фенотипический профиль, практически не встречающийся в норме (клетки с яркой экспрессией CD7 определяются в костном мозге в норме с частотой < 1/104). Представлена периферическая кровь пациентки 38 лет с бластозом периферической крови до 50%. Все опухолевые клетки ярко экспрессируют CD7. Популяция клеток, одновременно экспрессирующих CD3 и CD7, представлена минимально. В - выявление маркеров другой линейной принадлежности, например, лимфоидных маркеров при ОМЛ. Представлена гистограмма костного мозга больного ОМЛ (вариант М2) с яркой экспрессией CD7.

CD13

CD7

ІЗ

чать мертвые клетки в реальном времени анализа каждого образца [53]. Исключение нежизнеспособных клеток из анализа основано на применении суправитальных красителей, из широкого спектра которых для диагностики гемобластозов оптимальными характеристиками обладает 7-актиномицин Б (7ААО) [54, 74].

Клиническая проточная цитометрия предоставляет три типа данных [22]:

• необработанные результаты интенсивности экспрессии маркеров на клетках;

• относительное содержание различных клеточных популяций в образце;

• информация по единичным маркерам, имеющим принципиальное значение для клиники (например, СБ34+ при планировании трансплантации гемопоэ-тических стволовых клеток).

Именно экспертная оценка всей совокупности получаемых данных, необходимая для формулировки диагноза, является причиной вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных [16].

Выявление лейкозных бластов

При работе с биологическим материалом, содержащим бласты, возможно выделение фракции мо-

нонуклеаров методом градиентного центрифугирования, в которой при выраженной клональной пролиферации большинство клеток будут представлять собой субстрат опухолевой трансформации, бласты. Однако за последние 5-7 лет этот метод утратил свои доминирующие позиции в практике ИФТ клеток крови и костного мозга, так как требует значительных временных затрат, травматичен для клеток и нарушает исходное соотношение клеточных популяций. В настоящее время выделение определенной популяции для более прицельного последующего анализа осуществляется в МПЦ с помощью логического ограничения (гейтирования) по физическим характеристикам клеток и/или на основании экспрессии определенного маркера [67]. Поэтому, если еще в начале 90-х годов использование градиента плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению исследования крови или костного мозга без предварительного выделения мононукле-аров, что значительно упрощает и сокращает пробо-подготовку [65].

Выявление лейкозных бластов методом проточной цитометрии основано на сопоставлении их фенотипа с известным фенотипом неопухолевых клеток. Отличия фенотипического профиля лейкозных клеток могут быть выявлены и оценены только при одновременной оценке экспрессии нескольких мар-

Табл. 5. ПОТРЕБНОСТЬ В СПЕЦИФИЧЕСКИХ РЕАГЕНТАХ ДЛЯ ДИАГНОСТИКИ ГЕМОБЛАСТОЗОВ

Заболевание

необходимые

Маркеры

дополнительные

ХЛЗ

В-линия

Т-линия

CD5, CD19, Карра, Lambda, CD3, CD20, CD23, CD10, CD45

CD22, FMC7, CD11c, CD103, CD38, CD25, CD79b

CD4, CD7, CD2, CD56, CD16, TCRalphaAela, TCRgamma/delta

CD30, CD34, TdT, bcl-2, CD1a, CD71 чаще применяются при работе с тканью

ОЛ

В-линия

• Т-линия

Миелоидный ряд

Эритроидный ряд

CD10, CD19, CD13, CD33, CD34, CD7, CD14, CD3, HLADR

CD14, CD16, CD56, W65, TdT, cyCD3

CD20, CD22, CD79a, IgM

CD1a, CD2, CD4.CD5, CD8

CD11b, CD15, CD64, CD117, MPO

CD36, CD71, GPhA

CD41, CD61

» Мегакариоцитарный ряд

керов и физических характеристик клетки. Имму-нофенотипическая характеристика опухолевых клеток во многом определяется тем, какие моноклональные антитела и в каких комбинациях выбраны лабораторией [23]. Спектр антител для полноценного описания опухолевой популяции достаточно широк и включает маркеры для идентификации клеток всех ростков гемопоэза [20] (табл.5). Выбор антител и их сочетаний для двух или трехцветного анализа, предлагаемый различными группами исследователей [50,

52, 55, 60, 63, 64, 73] во многом зависит от конкретных задач и потому является прерогативой лаборатории, проводящей исследование. Различные наборы антител могут давать сходную информацию, но ни один из них не является оптимальным для всех диагностических ситуаций. Некоторые комбинации могут показаться повторяющимися или лишними, однако, надо помнить, что опухолевые клетки часто демонстрируют аберрантную экспрессию антигенов, которая может быть пропущена при использовании неадекватного числа маркеров [15]. Таким образом, необходимо, чтобы лаборатория была хорошо знакома с особенностями использования каждой комбинации антител в отношении нормальных и патологических клеток. Редуцированная, сокращенная панель может ограничивать возможность выявления минимальной остаточной болезни и даже приводить к ошибочной диагностике первичного заболевания [47]. Нормальные клетки, сохраняющиеся в некотором количестве даже при выраженной опухолевой экспансии, могут быть использованы как внутренний стандарт интенсивности антигенной экспрессии большинства мембран ассоциированных маркеров. Именно уровень антигенной экспрессии и физические характеристики определяют местоположение каждой популяции клеток в многомерном пространстве проточной цитометрии. Для формулировки иммунофенотипического диагноза суммарная оценка фенотипа патологической (бластной) популяции при подозрении на острый лейкоз или хроническое лимфопролиферативное заболевание с лейкемини-зацией по данным проточной цитофлюориметрии должна осуществляться последовательно и включать идентификацию лейкозных клеток и определение объема опухолевой популяции; определение линейного происхождения трансформированных клеток и определение уровня дифференцировки и аберрант-ности фенотипа трансформированных клеток. Хотя определение гетерогенности патологической популяции не всегда принципиально для установления диагноза, но значительно облегчает выявление изменений антигеннной экспрессии при прогрессии заболевания. Получение клинически значимой информации по данным ИФТ образов костного мозга и/или периферической крови с предположительным

диагнозом онкогематологического заболевания включает в себя:

- выявление патологической популяции и определение ее объема;

- определение линейной принадлежности основной массы бластов;

- оценку экспрессии ранних маркеров предшественников и выявление аберрантности фенотипа;

- суммарную оценку фенотипа опухолевой популяции для точного определения варианта ОЛЛ или ОнеЛЛ.

С точки зрения организации диагностического процесса очевидно, что при проведении стернальной пункции планируется практически одновременное получение информации о морфологических, цитохимических, иммунофенотипических, цитогенетических, и по возможности, молекулярных характеристиках лейкозных бластов. На практике это означает, что ИФТ проводится и его результаты анализируются, чаще всего в отсутствие другой информации о клеточном составе костного мозга и его морфоцитохимических особенностях. Клиническая же характеристика (возраст пациента и время начала заболевания, размеры периферических, внутригруд-иых и абдоминальных лимфатических узлов, печени, селезенки и т.д.) даже в совокупности с данными анализа крови и/или костного мозга не является до-статочн ым основанием для выбора антител конкретных специфичностей [66]. В связи с этим нами осуществляется ИФТ лейкозных бластов пациентов разных возрастных групп с использованием широкой панели маркеров, в той или иной степени характеризующих практически все ростки кроветворения. На наш взгляд, применение одного набора антител для предварительного определения линейной принадлежности лейкозных клеток и другого набора антител для получения уточняющих данных, т.е. использование двухступенчатого алгоритма при диагностике каждого конкретного случая, неприемлемо в связи с субъективностью подхода к выбору антител второй, прицельной панели [ 1,13]. С практической стороны, получение полной информации об им-ммунофенотипическом профиле клеток опухолевой популяции растягивается по времени. Мы рассматривали данные ИФТ как информацию, корректный анализ которой должен приводить к формулировке диагноза и, по возможности, свидетельствовать о прогнозе заболевания, степени риска неэффективности химиотерапии и служить основанием для назначения соответствующего лечения. Полноценный иммунофенотипический диагноз требует определять не только наличие или отсутствие того или иного антигена, но и одновременную экспрессию значимых в диагностическом плане молекул па поверхностной мембране или внутри клетки, т.е. суммарный имму-

нофенотип патологической популяции. Проточный цитометр предоставляет возможность одновременно оценить экспрессию не менее трех маркеров в сочетании с данными о физических параметрах клетки по показателям прямого и бокового светорассеяния. При анализе лейкозной популяции количество антигенов, которые имеют диагностическое значение, значительно больше. Конечно, можно сопоставить информацию о количестве клеток, экспрессирующих маркер А (условное название) из одной комбинации антител (например, А/В/С), с количеством клеток, экспрессирующих маркер Б из другой комбинации антител (например, В/Е/Р). Если количество этих клеток одинаково и совпадает с относительным количеством бластов в образце, то логично предположить, что все А-позитивные клетки так же положительны и по маркеру Б, т.е. суммарный фенотип клетки, равно как и популяции таких клеток, соответствует А*Б\

Описанный способ оценки получаемой информации применяется при проведении ИФТ опухолевых клеток методами световой и люминесцентной иммуноцитохимии и иммуногистохимии, позволяющими оценивать экспрессию каждого антигена в отдельности, а для получения суммарного иммунофепотипа патологической популяции анализируется достаточно большое количество препаратов. Такой подход к интерпретации данных может быть оправдан при высоком уровне бластоза в исследуемом образце и высокой плотности маркерных молекул на поверхностной мембране клетки, но опасен при относительно небольшом содержании бластов, при наличии блас-

тов с гетерогенным уровнем экспрессии маркеров разной линейной принадлежности, при наличии нескольких опухолевых популяций. Значительное количество специфических антител и их комбинаций, используемых для диагностики острых лейкозов методом проточной цитометрии, может приводить к увеличению количества таких спекулятивных выводов.

Для того, чтобы сделать выводы о суммарном фенотипе опухолевой клетки основанными более на фактах, чем на экстраполяции данных, мы пошли по пути использования нескольких маркеров как якорных. Для этого в разные комбинации антител был включен один и тот же маркер определенной специфичности. Например, предполагая выявление маркера А принципиальным для описания какой-то клеточной линии, мы включали его в сочетания антител, выявляющих клетки этой же клеточной линии (для уточнения уровня дифференцировки) или других клеточных линий (для уточнения направления дифференцировки). Количественное совпадение позитивных по маркеру А клеток в различных комбинациях антител, служило тем якорем, который позволял объективно определить суммарный фенотип популяции (популяций) лейкозных клеток, включая варианты аберрантности фенотипа и частичную ко-экспрессию в случае гетерогенности популяции.

В качестве якорных использованы антитела:

- к панлейкоцитарному маркеру СБ45 и

- к линейно-специфичным маркерам, в частности:

- СО 19 для характеристики В-клеточного направления дифференцировки;

- СБЗ (или СЭ7) для характеристики

Табл.6. ОСНОВНЫЕ СОЧЕТАНИЯ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ ОЛ

Канал регистрации сигнала

FL1 FL2 FL3

CD61 GPhA CD45

CD14 (19) CD34 CD45

CD10 CD19 CD13

CD7 CD5 CD3

CD7 CD13 CD19

Спектр специфических CD4 CD8 CD3

моноклональных антител CD15 CD33 CD20

CD15 CD34 HLADR

CD15 CD117 CD14

CD65 CD2 HLADR

CD22 CD10 CD20

CD2 CD56 CD45

Каппа-цепь Лямбда-цепь CD19

TdT CD10 CD19

TdT CD34 cyCD3

Т-клеточного направления дифференцировки;

- CD 13 (или CD33) для характеристики миелоидного ряда.

Выбор именно этих молекул в качестве якорных основан на рекомендациях EGIL (European Group for the Immunological Characterization ofLeukemias) по диагностике ОЛ и на характеристике того биологического материала, который обоснованно считается наиболее информативным при диагностике ОЛ. Таким биологическим материалом является костный мозг, одна из нормальных физиологических функций которого состоит в созревании и диф-ференцировке В-клеток до уровня иаивных лимфоцитов. Соответственно, и якорной молекулой для описания этого клеточного ряда является CD19. С другой стороны, созревание и дифференцировка Т-лимфоцитов происходят вне костного мозга, и поэтому в нем не должны выявляться Т-клетки ранних уровней дифференцировки. Определяемые в нормальном костном мозге Т-лимфоциты являются зрелыми, обладающими известными фенотипическими характеристиками. Поэтому для подтверждения Т-клеточной природы заболевания по возможности было использовано не одно, а два относящихся к разным уровням дифференцировки маркера. На основании изложенной информации и опыта работы можно сформулировать требования к панели специфических антител для проведения

полноценного ИФТ придиагостикеонкогематоло-гической патологии:

1. Панель должна выявлять нормальные и злокачественные клетки. Нормальные клетки могут использоваться в качестве внутреннего референсного стандарта, так как экспрессия ожидаемых антигенов на опухолевых клетках может быть аберрантной. Другими словами, надо помнить о возможности изменения способности рецепторов на поверхностной мембране клеток к соединению с антителами.

2. Необходимо исключать из анализа нежизнеспособные клетки, так как мертвые/нежизнеспособные клетки неспецифически связывают антитела и, следовательно, их наличие может приводить к ошибочной интерпретации результатов.

3. Наиболее интенсивные флюорохромы предназначены для эпитопов с минимальной плотностью. Использование якорных антител, конъюгированных с различными флюорохромами, экспрессия которых учитывается фотоумножителями Fil, F12 или F13, и легло в основу сочетания антител для диагностики онкогематологических заболеваний (табл.6).

Различное отношение к необходимости выявления цитоплазматических маркеров становится достаточно однозначным при обсуждении сложных и сомнительных случаев. Трудно поверить, но всего несколько лет назад [59] в общую диагностическую

Рис. 3. С019 как якорный маркер описания бластов. Костный мозг больной 64 лет направлен на исследование в связи с предположительным клиническим диагнозом панцитопении. На гистограмме А (С019/С010) основная масса бластов позитивна по маркерам СОЮ и С019 (49% от всех проанализированных событий) (коктейль С010/С019/сбіЗ); гистограмма Б (С019/М) демонстрирует, что все С019* клетки одновременно экспрессируютТсК (46,7% от всех проанализированных событий) (коктейль ТсИ/С010/С019). Количественная воспроизводимость информации об уровне экспрессии СйЮ и ТсК на С019* клетках позволяет описать лейкозные бласты как ТсЛ^СйЮ*С019*.

панель не включали цитоплазматические маркеры, что сегодня кажется нонсенсом.

Совершенно очевидно, что применение якорных маркеров приводит к дублированию информации об экспрессии тех или иных молекул, к ее повторению внутри анализа одного биологического материала (рис.З). Количественное совпадение популяций, выявленных на различных гистограммах при использовании информации по якорным маркерам, подтверждает корректность гейтирования патологической популяции и определения суммарного фенотипа отдельных кластеров патологических клеток. Пороговой величиной воспроизводимости результатов одного поданным, полученным в различных сочетаниях антител, принят уровень расхождения не более 5%.

В целом, требования к диагностике остаются прежними: надо не только выявить опухолевую популяцию, но и полноценно описать ее, сопоставляя ее по возможности с неизмененными нормальными клетками, если таковые присутствуют в образце. Предпочтения в выборе антител и формировании диагностических возможностей могут определяться различными факторами, в том числе:

- опытом и профессиональным уровнем сотрудников лаборатории;

- специфическими условиями лаборатории, проводящей исследование;

- видом биологического материала;

- доступностью дополнительной клинической и морфологической информации (ОЛЛ уб ХЛЛ);

- целыо направления материала на исследование:

- диагноз в общем;

- подробное описание фенотипа опухолевых и/или нормальных клеток в образце

для формулирования иммунофенотипического диагноза;

- мониторинг эффективности химиотерапии, или выявление минимальной остаточной болезни.

Положительным контролем ПЦ при работе с ядросодержащими клетками гематогенного происхождения является СБ45, уровень экспрессии которого отличается для разных популяций лейкоцитов [33]. Логическое ограничение популяции клеток на основе экспрессии СБ45 включает инкубацию образца с моноклональными антителами к СБ45, конъюгированными с одним флюорохромом и антителом (-ами) другой специфичности, меченным (-и) другим флюорохромом (-ами) [62]. В первую очередь оценивается гистограмма 58С/СВ45, позволяющая выделить лейкоциты как позитивные события и исключить тромбоциты и дебрис [13]. Затем формируется следующее логическое ограничение, включающее клетки, позитивные по иссле-

дуемому антигену [ 19]. Для получения достоверных результатов необходимо собрать достаточно большое количество С045-позитивных событий (по разным данным, от ЮхЮ3 до 10x10е), что особенно важно при исследовании малоклеточных популяций [14]. В целом, экспрессия С045 является положительным контролем ПЦ при работе с ядросодержащими клетками гематогенного происхождения, а уровень его экспрессии позволяет различать лимфоциты, моноциты и лейкоциты [33]. Характерное для лейкозных бластов снижение уровня экспрессии обсуждаемого маркера по сравнению с нормальными клеточными аналогами позволяет разделить траенформированные и неизмененные клетки. Логическое ограничение (гейтирование) по С045 имеет особое значение в тех случаях, когда выявление кластера патологических клеток не может быть выполнено только по параметрам светорассеяния, т.е. с тех случаях, когда происходит полное или частичное наложение кластеров лимфоцитов и трансформированных клеток. Дальнейшее иммунологическое гейтирование клона патологических клеток по линейно-ассоциированным маркерам (лимфоидной или миелоидной направленности) должно быть предварено использованием логического ограничения по низкогранулярным слабо СБ45-положи-тельным событиям, отчетливо выявляемым в большинстве случаев на гистограмме 53С/С045.

Для объективизации данных интенсивности экспрессии маркера и улучшения межлабораторного взаимопонимания могут быть использованы относительные и абсолютные характеристики плотности экспрессии антигенов [18,14]. К относительным характеристикам относятся средняя интенсивность флюоресценции (СИФ) и отношение СИФ позитивных клеток к СИФ отрицательного контроля, а к абсолютным показателям плотности экспрессии антигена - антителосвязывающая способность клетки, количество молекул эквивалента растворимого флюорохрома, среднее число молекул антигена на клетку [43]. Значение показателей ИФ маркеров дифференцировки в диагностике ОЛ может быть использовано для получения более глубокой информации о биологической сущности бластных клеток, однако для рутинной диагностики гемобла-стозов они приложимы, в основном, для характеристики лейкозов с коэкспрессией маркеров «чужих» линий, поликлональных лейкозных популяций, а также при наличии большой примеси зрелых клеток периферической крови [24]. В связи с тем, что получение относительных показателей по СБ45 не требует дополнительных реагентов, СИФ СБ45 как суррогатный показатель плотности экспрессии маркера позволяет корректно ограничить (выявить) бластную популяцию при наличии в материале как

трансформированных, так и иетрансформирован-ных клеток [25, 2].

Интерпретация данных проточной цитометрии для формулирования иммунофенотипического диагноза

Удивительное разнообразие иммунофенотипического и молекулярного профиля злокачественных гематологических заболеваний [40] привело к появлению самых разных оценок информационной значимости ИФТ лейкозных бластов [71, 70]. Некоторые авторы считают, что иммунофенотипические характеристики не могут быть использованы как предикторы исхода заболевания [21]. Сохраняет свои позиции и точка зрения, согласно которой лейкозы надо делить только на ОМЛ и Т- и В- линейные ОЛЛ без дальнейшей дифференцировки по стадиям [46]. Несмотря на некоторую одиозность этих точек зрения, им практически мало что можно противопоставить [69], так как терапевтические подходы опираются на самые основные иммунофенотипические признаки [71]; эффективность протоколов лечения трудно отделить от других связанных прогностических факторов, крупномасштабные мульти-центрические исследования не учитывают или не оценивают полный объем иммунофенотипической информации [58]. Кроме того, определенная доля вариабельности данных, получаемых в разных центрах, объясняется различным качеством используемых реагентов. Неоднозначность критериев интерпретации данных ИФТ в сочетании с гетерогенностью иммунофенотипического профиля бластных клеток при ОЛ у одного пациента может существенно затруднять итоговую оценку результатов разных исследований (морфология, цитохимия, ИФТ и др.), Это означает, что ИФТ предназначено не только для определения линейной принадлежности бластов (что само по себе ие так просто и требует соблюдения определенных правил), но должны быть приложены дальнейшие усилия к определению прогностического значения опухолевого фенотипа.

В практике онкогематологии ИФТ методом проточной цитометрии показано [75]:

1. При подозрении на онкогематологическое заболевание, в том числе при клинически необъяснимом абсолютном лимфоцитозе до проведения инвазивных вмешательств (биопсия лимфатического узла, стернальная пункция и т.п.).

2. При диагностике и мониторинге острого лейкоза, миелодиспластического синдрома, бластного криза при хроническом миелолейкозе;

3. Для дифференцировки хронических лимфопролиферативных заболеваний с лейкеминизацией.

4. Для количественного определения гемопоэти-ческих стволовых клеток при планировании аутологичной или аллогенной трансплантации гемопоэти-ческих стволовых клеток.

5. Для оценки восстановления иммунного ответа после проведения аутологичной или аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

В клинической практике ИФТ методом проточной цитометрии с использованием всей панели антител, используемых при диагностике гемобластозов, не должно быть использовано как скрининговый тест на наличие лимфопролнферативных заболеваний в отсутствие абсолютного лимфоцитоза, морфологически определяемой патологической лимфоидной популяции или сплепомегалии, а также в хронической фазе хронического миелолейкоза или других хронических миелопролиферативных заболеваний.

Алгоритм аиал иза биологического материала при подозрении на острый лейкоз (онкогематологическое заболевание)

1. Получение биологического материала.

2. Пробоподготовка по протоколу окрашивание-лизис-отмывка.

3. Регистрация результатов всех сочетаний антител методом проточной цитометрии.

4. Анализ результатов:

- выявление клеток со сниженной экспрессией СБ45 и определение их уровня гранулярности по гистограммам РБС/ББС и 53С/СБ45;

- количественная оценка популяции трансформированных клеток и сохранности гранулоцитарного, моноцитарного и лимфоидного ростков;

- определение линейной принадлежности основной массы бластов по линейно-ассоциированным маркерам (СБ19, СБЗ (или СБ7), СБ13 (или СБЗЗ);

- выявление экспрессии маркеров клеток предшественников и их количественная оценка на популяции трансформированных клеток;

- выявление аберрантности нммуиофенотнпа траиформированных клеток и определение ее типа;

- оценка экспрессии дополнительных маркеров внутри бластпой популяции.

5. Формулировка иммунофенотипического диагноза.

Примеры использования алгоритма анализа данных проточной цитометрии.

Пример 1. На ИФТ направлен костный мозг пациента 33 лет, лейкоцитоз периферической крови 228x10и/л, 87% лейкоцитов представлены бластами. По параметрам светорассеяния и экспрессии С45 неизмененные лимфоциты не выявлены, бласты по размерам занимают промежуточное положение между лимфоцитами и моноцитами, обладают низким уровнем экспрессии СЭ45 (СИФ-90,0±19,0). Основная масса бластов позитивна по линейным мар-

керам CD13 и CD33, что по сумме первых двух шагов интерпретации данных ИФТ позволило предположить диагноз OMJI. Для определения степени незрелости клеток была проанализирована экспрессия CD34, Tdt, а также CD117 как маркера клеток предшественников миелоряда. Бласты оказались высокопозитивны по CD34 и CD117 и негативны по Tdt, что позволило исключить такие варианты ОМЛ как МО и все варианты, более дифференцированные, чем М3. Последующий анализ выявил полное отсутствие HLADR на бластных клетках, что при ОМЛ патогномон ично для варианта М3. Таким образом, все опухолевые клетки обладают суммарным фенотипом TdtCD117TD13*CD33*CD34,CD45'l""'I-ILADR-, что соответствует только промиелоцитарному лейкозу (М3 вариант ОМЛ), что в последующем было подтверждено выявлением t(15;17).

Пример 2. На ИФТ направлен костный мозг пациентки 40 лет, заболевшей остро, когда на фоне клиники острого респираторного заболевания развилось тяжелое маточное кровотечение. При обследовании выявлена анемия (гемоглобин 65 г/л), тромбоцито-пения (тромбоциты 12х109/л), бласты в периферической крови (15%), в миелограмме 33%, гепатосп-леномегалия (по данным УЗИ). По параметрам светорассеяния и экспрессии CD45 неизмененные лимфоциты составляют не более 20% клеточного состава костного мозга, зрелые гранулоциты отсутствуют. СИФ экспрессии CD45 на бластах соответствует 100,6± 14,2. По уровню гранулярности кластер бластов соответствует нижней трети оси SSC. При анализе линейно-коммиттированных маркеров клетки позитивны только по CD 13, экспрессия других маркеров миелоряда и других направлений диффе-ренцировки отсутствует, что позволило предположить миелоидное происхождение опухолевых бластов. При определении степени незрелости клеток выя влена более интенсивная экспрессия Tdt по срав-нению с экспрессией CD34, что практически не встречается при более или менее высокой дифферен-цировке бластов и позволяет предположить варианты М0-М2 ОМЛ. Последующий анализ выявил высокую экспрессию HLADR на бластных клетках, однако никакие другие маркеры миелоидного и лимфоидного направлений дифференцировки выявлены не были. Таким образом, суммарный фенотип бластов Tdthi8h+CD13+CD34+CD45tHLADR* свидетельствует о низком уровне дифференцировки клеток и на основании экспрессии только одного маркера миелоидного ряда позволяет идентифицировать случай как МО вариант ОМЛ. При проведении химиотерапии по схеме «7+3» ответа получено не было. Больная скончалась при явлениях острой сердечной недостаточности через 20 дней после установления диагноза.

Развитие клинической проточной цитометрии привело к необходимости объективизации не только фактических данных, но и их интерпретации (flow cytometry immunophenotype interpretation (FIPI)) [57]. Создание алгоритмов автоматизированного принятия решений связано с прогрессом в области реагентов и инструментов проточной цитометрии и эволюцией критериев диагностики лейкоза от чисто морфологических до опирающихся на иммунофе-нотипические и молекулярно-биологические данные. Диагностическая интерпретация данных проточной цитометрии требует интеграции клинических, инструментальных и лабораторных данных для установления диагноза и выбора оптимального набора тестов для дальнейшего наблюдения за пациентом онкогематологического профиля. Иммунологический диагноз может быть сформулирован при наличии клинических и морфологических данных после подробного описания фенотипа выявленной патологической популяции и проведения дифференциального диагноза по данным ПЦ.

Список литературы

1. Азовская Т.Ю., Фечина Л.Г., Сазонов С.В. Частота экспрессии антигенов при острых лимфобластных лейкозах у детей // Вестник Уральской государственной академии.-1997. - №3. - Стр.63-65.

2. Буглова СЕ, Белевцев MB, Потапнев МП. Диагностическое значение показателя средней интенсивности флуоресценции дифференцировочных антигенов при иммунофенотипировании острых лейкозов у детей // Методы проточной цитометрии в медицинских и биологических исследованиях: Сб.науч.тр.под ред. М.П.Потапнева.-Мн.:ГУРНМБ, 2003. - С.24-33.

3. Кисляк Н.С., Ленская Р.В. Клетки крови у детей в норме и патологии. - М.: Медицина, 1978. - 256 с.

4. Клиническая онкогематология. Руководство для врачей / Под ред. Волковой М.А..- М.:Медици-на.- 2001,- 576 с.

5. Лецкий В.Б. Цитохимические исследования лейкоцитов (методическое письмо).- Л,-1970.- 32 с.

6. Луговская С.А., Морозова В.Т., Почтарь М.Е. Лабораторная диагностика лейкозов. Пособие для врачей,- Инф-изд.фирма «Губернская медицина». -1999. - 80 с.

7. Тотолян A.A., Балдуева И.А., Бубнова Л.Н., Закревская A.B., Зуева Е.Е., Калинина Н.М., Лиси-цина З.Н. Стандартизация методов иммунофеноти-пирования клеток крови и костного мозга человека. Медицинская иммунология, 1999, т.1„ № 5, с.21-

43.

8. Тотолян A.A., Балдуева И.А., Бубнова Л.Н., Закревская A.B., Зуева Е.Е., Калинина Н.М., Лиси-цина З.Н. Стандартизация методов иммунофеноти-

пнрования клеток крови и костного мозга человека. Часть III. Иммуноцитохимический метод. Часть IV. Значения нормы. Клиническая лабораторная диагностика, 2002, т.1„ № 1, с.44-50.

9. Фрегатова Л.М., Головачева А. А., Эстрина М.А., Бабенко Е.В., Зуева Е.Е., Афанасьев Б.В. Получение стволовых клеток периферической крови для ауто-и аллогенных трансплантаций гемопоэтических клеток. Терапевтический архив, 2002, №7, с.27-30.

10. Тотолян А. А., Алешина Л. А., МарфичеваН.А., Зуева Е.Е., Лапин С.В. Медицинские стандарты иммунологического обследования больных с аллергическими нарушениями и нарушениями иммунной системы. Медицинская иммунология, 2002, т.4., №

2, с.379-394.

11. Зуева Е.Е. Проточная цитометрия. Анализ изображения. Получение и представление данных. Медлайн.Ру 2004, Т.4 (Ст.131), Стр.465-470.

12. Зуева Е.Е. Иммуиофенотипирование в диагностике острых лейкозов. Медлайн.Ру 2004, Т.4 (Ст. 132), Стр.471-478.

13. Bain B.J., Barnett D„ Linch D„ Matutes E„ Reilly J.T. Revised guideline on immunophenotyping in acute leukemias and chronic lymphoproliferative disorders / /Clin. Lab. Haem. 2002,- Vol.24.-P.l-13.

14. Barnett D„ Storie I., Granger V., Whitby L., Reilly J.T., Brough S., Garner S., Lawry J„ Richards S., Bell A.E., Shenton B.K. Standardization of lymphocyte antibody binding capacity - a multicentre study // Clin. Lab. Haematol.-2000.-Vol.22(2).-P. 89-96.

15. Basso G., Bernasconi P., Chianese R., Crovetti G„ Garbaccio G., Iavarone A., Pautasso М., Santagosti-no A. Monoclonal antibody panels for acute leukemia and myelodysplastic syndrome diagnosis // J.Biol.Regul.Homeost.Agents.-2001.-Vol.l5(2).-P.145-155.

16. Basso G., Buldini B„ de Zen L., Orfao A New methodologic approaches for immunophenotyping acute leukemias//Haemotologica.- 2001.-Vol.86.-P.675-692.

17. Basso G., Rondelli R„ Covezzoli A„ Putti M. The role of immunophenotype in acute lymphoblastic leukemia of infant age. //Leuk Lymphoma.- 1994.-Vol.15,-P.51-60.

18. Borowitz М., Shuster J„ Carroll A. Prognostic significance of fluorescence intensity of surface marker expression in childhood В-precursor acute lymphoblastic leukemia. A Pediatric Oncology Group Study // Blood.- 1997,- Vol.89.-P.3960-3966.

19. Borowitz M.J., Guenther K„ Shults K.E., Stelt-zer G.T. Immunophenotyping of acute leukemia by flow cytometric analysis: use of CD45 and right-angle light scatter to gate on leukemic blasts in three-color analysis//Am. J. Clin. Pathol.-1993.-Vol.l00.-P.534-540.

20. Braylan R.C., Orfao A., Borowitz M.J., Davis B.H. Optimal number of reagents required to evaluate hema-

tolymphoid neoplasias: result of an international consensus meeting //Cytomtery.-2001.-Vol.46(16).-P.23-27.

21. Caligiuri M.A., Stroout M.P., Gilliland G. Molecular biology of acute myeloid leukemia. Semin. Oncol.-1997.-Voi.24.-P.32-44.

22. Cualing H.D. Automated analysis in flow cytometry // Cytometry.-2000.-Vol.42(2).-P.110-113.

23. Dugas M., Schoch C„ Haferlash T., Danhauser-Riedl S., Hiddemann W., Messerer D., Uberla K. A comprehensive leukemia database: integration of cytogenetics, molecular genetics and microarray data with clinical information, cytoinorphology and immu-nophenolyping // Leukemia.-2001.-Vol.15.-P.1805-1810.

24. Ginaldi L„ Matutes E„ Farahat N. Differential expression of CD3 and CD7 in T-cell malignancies: a quantitative study by flow cytometry // Br.J.Hematol.-1996.-Vol.93(4).-P.921-927.

25. Gratama J.W., D’hautcourt J.L., Mandy F., Rothe G., Barnett D„ Janossy G., Papa S., Schmitz G., Lenkei R. Flow cytometric quantification of immunofluorescence intensity: problems and perspectives. European Working Group on Clinical Cell Analysis // Cytome-try.-1998.- Vol.33(2).-P.166-178.

26. Greaves M.F., Chan L.C., Farley A.J.W., Wan

S.M., Molgaart H.V. Lineage promiscuity in hemopoietic differentiation and leukemia // Blood.- 1986,-Vol.67.-P.l-U.

27. Harris N.L., Jaffe E.S., Diebold J„ Flandrin G., Muller-Hermelink H.K., Vardiman J., Lister T.A., Bloomfield C.D. The World Health Organiation Classification of Neoplasms of the Hematopoietic and Lymphoid Tissues: Report of the Clinical Advisory Committee Meeting - Airlie House, Virginia, November, 1997 // Hematology.-2000.-Vol.l.-P.53-66.

28. Hassett J., Parker J. Laboratory practices in reporting flow cytometry phenotyping results for leukemia/lymphoma specimens: results of survey // Cytom-etry.-1995.-Vol.22.-P.264-281.

29. Hrusak O., Porwit-MacDonald A. Antigen expression patterns reflecting genotype of acute leukemias // Leukemia.-2002.-Vol.16.-P. 1233-1258.

30. Hulkkonen J., Vilpo L., hurme M., Vilpo J. Surface antigen expression in chronic lymphocytic leukemia: clustering analysis, interrelationship and effects of chromosomal abnormalities // Leukemia.-2002.-Vol. 16(20).-P. 178-185.

31. Koester S.K., Bolton W.E. Intracellular markers //J Immunol Methods.-2000.-Vol.243.-P.99-106.

32. Kuchinskaya E„ Heyman M., Grander D., Linder-holmM., Soderhall S., Zaritskey A., Nordgren A., Por-wit A., Zueva E., Nordenskjold M., Blennow E. A comparison of gene expression profiles in different age groups reveal similarity between infants and adults with acute lymphoblastic leukemia. Leukemia. In print.

33. Lacombe F., Durrieu F., Briais A., Duraain P., Belloc F., Bascans E. Flow cytometry CD45 gating for Immunophenotyping of acute myeloid leukemia // Leu-kemia.-1997.-Vol.ll.-P.1878-1886.

34. LucioP., Gaipa G., van Lochem E., van Wenng T., Porwit-MacDonald A., Faria T„ Bjorklund E„ Biondi A., van den Beemd M., Baars E„ Vidriales B„ Parrcira

A., van Dongen J., San Miguel J„ Orfao A. BIOMED-1 concerted, action report: flow cytometric immunophenotyping of precursor B-ALL with standardized triple-stainings. BIOMED-1 Concerted Action Investigation of Minimal Residual Disease in Acute Leukemia: International Standardization and Clinical Evaluation // Iew^emi'fl.-2001.-Vol. 15.-P. 1165-1192.

35. Ludwig W.D., Rieder H„ Bartrain C.R., Heinze

B., Schwartz S., Gassmann W., Loffler H„ Hossfeld D„ Heil G., Hand S., Heyll A., Diedrich H„ Fischer K., Weiss A., Votkers B., Aydemir U., Fonatsch C., Cok-buget N„ Thiel E., Hoelzer D. Immunophenotypic and genotypic features, clinical characteristics, and treatment outcome of adult pro-B acute lymphoblastic leukemia: results of the German multicenter trials GM ALL 03/87 and 04/89//Blood.-1998.-Vol.92.-P. 1898-1909.

36. Marin C„ Martinez-Delgado B., Melendez B. Multiplex-polymerase chain reaction assay for detection of prognostically significant translocations in acute lymphoblastic leukemia // Haematologica.-2001.- Vol.86.-P.1254-1260.

37. Matutes E., Morilla R„ Carbonell F„ Swansbury J„ Dyer M„ Catovsky D. Defiition of acute bipheno-typic leukemia // Hematologica.-1997.-Vol.82.-P.64-66.

38. Mhawech P., Buffone G.J., Khan S.P., Gresik M.V. Cytochemical staining and flow cytometry methods applied to the diagnosis of leukemia in the pediatric population: an assessment of relative usefulness // Am. J. Pediatr. Hematol. Oncol. 2001.-Vol.23(2).-P.89-92

39. Naeim F. Selection of monoclonal antibodies in the diagnosis and classification of leukemias. //Disease Markers.-1989.- Vol.7.-P.l-14.

40. Nakase K„ Bradstock K„ Sartor M„ Gottlieb D„ Byth K., Kila K„ Shiku H„ Kamada N. Geographic heterogeneity of cellular characteristics of acute myeloid leukemia: a comparative study of Australian and Japanese adult cases // Leukemia.-2000.- Vol. 14,- P. 163-168.

41. Nicholson J., Kidd P., Mandy F., Livnat D., Kagan J. Three-color supplement to the NIAID DAIDS guideline for flow cytometric immunophenotyping // Cytometry (Comm, in Clinical Cytometry) 1996,-Vol.26.-p.227-230.

42. Oelschlagel U., Nowak R„ Schaub A., Koppel C., Herbst R., Mohr B„ Loffler C„ Range U., Gunter H„ Abmann M., Siegrt E„ Wendt E„ Huhn R., Brautigm E., Ehningr G. Shift of aberrant antigen expression at relapse or at treatment failure in acute leukemia // Cy-

tometry (Comm, in Clinical Cytometry).-2000.-Vol,42.-p.247-253.

43. Porwit-MacDonald A., Janossy C., Ivory K., Swirsky D., Peters R„ Wheatley K„ Walker H„ Turker A., Coldstone A.H., Burnett A. Leukemia-associated changes identified by quantitative flow cytometry. IV. CD 34 overexpression in acute myelogenous leukemia M2 with t(8;21) // Blood.- 1996,- Vol.87.- P.l 162-1169.

44. Porwit-MacDonald A., Bjorklund E„ Lucio P., van Lochem E.C., Mazur I., Parreira A., van den Beemd M.W., van Wering E.R., Baars E., Gaipa G., Biondi A., Ciudad J., van Dongen J.J.M., San Miguel J.F., Orfao A. BIOMED-1 concerted action report: flow cytometric characterization of CD7+ cell subsets in normal bone marrow as a basis for the diagnosis and follow-up of T cell acute lymphoblastic leukemia (T-ALL) // Leuke-otw.-2000.-Vo1.14.-P.81 6-825.

45. Pui C.H. Acute lymphoblastic leukemia in children // Curr. Opin. Oncol.-2000.-Vol.12.-P.3-12.

46. Putti M.C., Rondelli R., Cocito M.G. Expression of myeloid markers lacks prognostic impact in children treated for acute lymphoblastic leukemia: Italian experience in AIEOP-ALL 88-91 studies // Blood.- 1998.-Vol. 92.-P.795-801.

47. Reilly J.T., Barnett D.UKNEQAS for leucocyte immunophenotyping: the first 10 years //J. Clin. Pathol-2001.- Vol.54(7).-P508-511.

48. Richards S.J., Jack A.S. The development of integrated haematopathology laboratories: a new approach to the diagnosis of leukemia and lymphoma // Clinical and Laboratory Haematology.- 2003.- Vol.25 (6).-P.337-345.

49. Rosenwald A., Staudt L.M. Clinical translation of gene-expression profiling in lymphomas and leukemias // Semin. Oncol..- 2002.-Vol.29.-P.258-263.

50. Rothe G, Schmitz G. European Working group on clinical ccll analysis (EWGCCA) Consensus Document on Leukemia Immunophenotyping. Leukemia.-1996.-Vol.l0.-P.877-895.

51. Rowan R.M., Bain B.J., England J.M., Hyde K., Matutes E., Reilly J.T., Stephens A.D., Lewis S.M., Shin-tonN.K., Murphy M.F., WoodJ.K. Immunophenotyping in the diagnosis of acute leukemias //J.Clin. Pathol.-1994,- Vol.47.-P.777-781.

52. Ruiz A.A., Duque R.E., Orfao A. A report on the first Latin American consensus conference for flow cytometric Immunophenotyping of leukemia // Cytome-try.-1998.-Vol.34.-P.39-42.

53. Schmid I„ Ferbas J., Uittenbogaart CH., Giorgi J.V. Flow cytometric analysis of live cell proliferation and phenotype in populations with low viability // Cy-tometry.-1999.-Vol.35(l).-P.64-74.

54. Schmid I., Uittenbogaart C.H., Keld B., Giorgi J.V. A rapid method for measuring apoptosis and dual-color immunofluorescence by single laser flow

cytometry. J. Immunol Methods. 1994.-Vol.170(2).-P.145-57.

55. Schwartz A., Marti G.E., Poon R., Gratama J.W., Fernandez-Repollet E. Standartizing flow cytometry: a classification system of fluorescence standards used for flow cytometry // Cytometry.-1998.-Vol.33.-P.106-114.

56. Segeren C.M., van “t Veer M.B. The FAB classification for acute myeloid leukaemia - is it outdated? // Neth.J. Med.- 1996.- Vol.49(3).-P.126-131.

57. Shipp. M. A. Diffuse large B-cell lymphoma outcome prediction by gene-expression profiling and supervised machine learning// Nature Med. -2002.-Vol.8.-P.68-74.

58. Schrappe M., Reiter A., Ludwig W.D., Harbott I., Zimmermann M., Hiddemann W., Niemeyer C., Henze G., Feldges A., ZintI F., Kornhuber B., Ritter I., Welte K., Gadner H., Riehm H. Improved outcome in childhood acute lymphoblastic leukemia despite reduced use of anthracyclines and cranial radiotherapy: results of trial ALL-BFM 90. German-Austrian-Swiss ALL-BFM Study Croup. //Blood.-2000,- Vol.95.- P.3310-3322.

59. Stelzer G.T., Marti G„ Hurley A., McCoy P.J., Lovett E.J., Schwartz A. U.S.-Canadian Consensus recommendations on the Immunophenotypic analysis of hematologic neoplasia by flow cytometry: standardization and validation of laboratory procedures // Cytometry (Comm, in Clinical Cytometry).-1997.-Vol.30.-P.214-230.

60. Stewart C.C., Behm F.G., Carey J.L., Cornbleet J„ Duque R.E., Hudnall S.D., Hurtubise P.E., Loken M„ Tubbs R.R., Wormsley S. U.S.-Canadian Consensus recommendations on the Immunophenotypic analysis of hematologic neoplasias by flow cytometry: selection of antibody combinations //Cytometry.-1997.-Vol.30,-P.231-235.

61. Stewart C.C., Stewart S.J. Immunological monitoring utilizing novel probes // NY Acad. Sei. 1993,-Vol.677.-P.94-112.

62. Sun T„ Sangaline R., Ryder J., Gibbens K., Rollo

C., Stewart S., Rajagopalan C. Gating strategy for im-munophenotyping of leukemia and lymphoma // Am..J..Clin.Pathol.-1997.- Vol. 108(2).-P. 152-157.

63. Tabemero M.D., Bortoluci A.M., Alaejos I., Lo-pez-Berges M.C., Raillo A., Carcia-Sanz R., Garcia M., Sayagues J.M., Conzalez M., Mateo G., San Miguel F., Orfao A. Adult precursor B-ALL with BCR/ABL gene rearrangements displays a unique immunophenotype based on the pattern of CD10, CD34, CDI3 and CD38 expression // Leukemia.-2001.-Vol.l5.-P.406-414.

64. Tallman M.S., Neuberg D., Bennett J.M., Francois C., Paietta E., Wiernik.P.H., Dewald G., Cassileth P.A., Oken M.M., Rowe J.M. Acute megakaryocytic leukemia: the.Cooperative Oncology Croup experience // Blood.-2000.-Vol.96.-P.2405-2411.

65. Tatsumi N„ Kitahashi S., Kubota H., Tsuda I., Yasui Y„ Tanaka K„ Kondo H.. [Standardization in flow cytometry] //Rinsho Byori..-1993.-vol.41(9).-P.982-989.

66. Taylor C.G., Stasi R„ Bastianelli C„ Venditti A., Del Poeta G., Amadori S., Sargent J. Diagnosis and classification of the acute leukemias: recent advances and controversial issues. Hematopathol. Mol. Hematol.-1996.-Vol.l0(l-2).-P.l-38

67. Terstappen L.W., Konemann S., Safford M., Loken M.R., Zudutter K., Buchner T„ Hiddemann W„ Wormann B. Flow cytometric characterization of acute myeloid leukemia. Part 1, Significance of light scattering properties// Leukemia.-1991.- S: 315-321.

68. Thalhamer-Scherrer R., Mitterbauer G., Simo-nitsch I., Jaeger U„ Lechner K., Schneider B., Fonatsch C„ Schwarzinger L. The immunophenotype of 325 adult acute leukemias: relationship to morphologic and molecular classification and proposal for a minimal screening program highly predictive for lineage discrimination // Am. J. Clin. Pathol.- 2002,-Vol.ll7(3).-P.380-9.

69. Tien H.F., Hsiao C.H., Tang J.L., Tsay W„ Hu

C.H., Kuo Y.Y., Wang C.H, Chen Y.C., Shen M.C., Lin

D.T., Lin K.H.; Lin K.S. Characterization of acute myeloid leukemia with MLL rearrangements - no increase in the incidence of coexpression of lymphoid-associated antigens on leukemic blasts // Leukemia.-2000.-Vol.l4.-P.1025-1030.

70. Tiensiwakul P., LertlumT., Nuchprayoon I., Sek-sarn P. Immunophenotyping of acute lymphoblastic leukemia in pediatric patients by three-color flow cytometric analysis // Asian Pac. J. Allergy Immunol.-1999.-Vol. 17.-P.17-21.

71. Uckun F.M., Sensel M.G., Sun L., Steinherz P.G., Trigg M.E., HeeremaN.A., Sather U.N., Reaman G.H., Gaynon P.S.; Biology and treatment of childhood T-lin-eage acute lymphoblastic leukemia // Blood.-1998.-Vol.91.-P.735-746.

72. Urn L.C., Heng K.K., Vellupillai M„ Tan L.T., Boey B.C., Lau L.C., How G.F. Molecular and phenotypic spectrum of de novo Philadelphia positive acute leukemia //Int. S. Mol. Med.-1999.- Vol.4.-P. 665-667

73. van Wering E.R., van der Linden-Schrever B.E., Szczepanski T. Regenerating normal B-cell precursors during and after treatment of acute lymphoblastic leukaemia: implications for monitoring of minimal residual disease //BrJ Haematol.-2000.-Vol,108.-P.129-141.

74. Waters W.R., Harkins K.R., Wannemuchler M.J. Five-color flow cytometric analysis of swine lymphocytes for detection of proliferation, apoptosis, viability, and phenotype. Cytometry.-2002.-Vol.48(3).-P.146-152.

75. WHO Tumors of Haematopoietic and lymphoid Tissues. Eds. Jaffe E.S., Harris N.L., Stein H., Vardiman J.W.-LARC Press, Lyon.-2001.

76. Zueva Y„ Boichenko E„ Zaritzkey A., Coutchin-skaia E. Biphenotypic leukemia with lymphoid and myeloid lineage: a case report. Clin.Chem.Lab.Med. Vol.40 Special supplement October 2002, p. SI65.

77. Zutter M.M., Hes J.L. Guidelines for the diagnosis of leukemia or lymphoma in children // Am. J. Clin. Pathol.-1998.-Vol.109.-suppl. 1.-P.S9-S22.

поступила в редакцию 05.03.2004 принята к печати 28.03.2004