CC BY
95
Медицинская Иммунология 2004, Т. 6, №3-5 © 2004, СПб РО РААКИ
ИММУНОГЕМАТОЛОГИЯ
ИММУНОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ НАЦИОНАЛЬНЫХ РЕГИСТРОВ ДОНОРОВ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК:
СТРАТЕГИЯ ПОИСКА ДОНОРА ДЛЯ НЕРОДСТВЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ
Бубнова Л.Н.. Беркос А.С., Беляева Е.В., Ерохина Л.В., Павлова И.Е.
Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург, Россия
Трансплантация стволовых кроветворных клеток является одним из наиболее эффективных методов лечения многих гематологических и аутоиммунных заболеваний, однако добиться успеха аллогенной пересадки можно лишь при минимальных расхождениях между донором и реципиентом по антигенам гистосовместимости.
Полиморфизм системы НЬА необычайно высок: количество специфичностей этого генетического комплекса превышает 1000, а число различных фенотипов, встретившихся среди 7,5 миллионов типированных доноров Всемирного донорского регистра, составило около 600 тысяч. Но даже эта цифра представляет лишь 1% от теоретически возможных НЬА-А,-В,-ВЯ фенотипов. Различные расы и этнические группы значительно различаются по генетическому разнообразию: так, 59-60% кавказоидов и ориентов имеют часто встречающиеся (более 1:1000) НЬА-гаплотипы, и 8-9% - редкие (встречающиеся реже, чем 1:10000). Наиболее разнообразны в этом отношении афроамериканцы: только 38% принадлежащих к этой популяции имеют частые гаплотипы и 14% являются обладателями редких. Вполне понятно, что наиболее успешным является поиск доноров среди соответствующей этнической группы, что делает исключительно ценными национальные регистры, даже если они не слишком велики.
Регистр потенциальных доноров гемопоэтических стволовых клеток Российского НИИ гематологии и трансфузиологии (РНИИ ГТ) представлен в основном русскими и народами угро-финской группы, проживающими в Северо-Западном регионе, и включает более 4000 человек. Нами была изучена частота встречаемости НЬА-А, В гаплотипических сочетаний среди лиц, входящих в этот регистр. Самыми распространенными гаплотипами явились НЬА-А2-В7(0,043); А2-В35(0,034); А3-В7(0,033); А2-В44(0,031); А3-В35(0,028); А2-В18(0,023); А24-В7(0,019); А2-В62(0,019); А1-В8(0,018), А2-В27(0,018). При сравнении с аналогичными показателями, характеризующими регистр Германии, являющийся самым крупным в Европе, был обнаружен ряд различий. Так, частота гаплотипа А1-В8 в Германии более чем в 4 раза превышает частоту этого же гаплотипа в популяции Санкт-Петербурга (0,083 и 0,018 соответственно), гаплотипа А2-В62
- в два раза (0,042 и 0, 019 соответственно). Вместе с тем частота самого распространенного гаплотипа в Санкт-Петербурге А2-В7 в два раза ниже, чем тот же показатель для самого распространенного в Германии А1-В8: 0,043 и
0,083 соответственно. В то же время целый ряд гаплоти-пов, входящих в первые двадцать по частоте встречаемости в Санкт-Петербурге, не характерны для регистра Германии.
Для оценки эффективности работы с относительно небольшим регистром РНИИ ГТ была проанализирована возможность подбора донора, идентичного по антигенам
1 класса, для 52 больных онкогематологическими заболеваниями - жителей Северо-Запада, находившихся на лечении в гематологической клинике института. Оказалось, что для 48% (25) больных в Регистре имелось от 1 до 14 доноров, при этом наиболее часто идентичные доноры встретились для больных со следующими НЬА-фе-нотипами: А2,3; В35,62 (14 доноров), А1,2;В8,13 (12 доноров), А2,24; В7,27 (9 доноров).
Таким образом, даже при наличии небольшого национального регистра возможно осуществить подбор донора для трансплантации гемопоэтических стволовых клеток пациенту, проживающему в том же регионе. Однако для повышения эффективности подбора расширение национальных регистров является абсолютно необходимым, так же как и международное сотрудничество.
ПРОГНОСТИЧЕСКАЯ ЦЕННОСТЬ ОЦЕНКИ ВОССТАНОВЛЕНИЯ СУБПОПУЛЯЦИОННОГО СОСТАВА ЛИМФОЦИТОВ У ПАЦИЕНТОВ ПОСЛЕ АЛЛОГЕННОЙ ТРАНСПЛАНТАЦИИ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК (АПЛО-ТГСК)
Витришак А.А.*. Комарова Л.С.**, Зуева Е.Е.**, Иванова Н.Е.*, Зубаровская Л.С.*, Молчанова И.В.**, Афанасьев Б.В.*, Тотолян Арег А.**
* Клиника ТКМ СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия;
** Научно-методический центр по молекулярной медицине СПбГМУ им. акад. И.П.Павлова, Санкт-Петербург, Россия
Реакция трансплантат-против-хозяина (РТПХ) остается одним из самых серьезных осложнений алло-ТГСК, ведущим к инвалидизации и высокой смертности. Тяжесть течения острой РТПХ в значительной степени определяется функциональной активностью лимфоцитов донора в организме реципиента после инфузии трансплантата. Оценка субпопуляционного состава лимфоцитов и динамики его изменения в организме пациента после алло-ТГСК может оказаться полезной для прогноза развития и тяжести течения острой РТПХ, а также для выбора оптимальных режимов профилактики острой РТПХ или коррекции проводимой иммуносупрессии.
Цель. Исследование взаимосвязи динамики изменений субпопуляционного состава лимфоцитов, клинического течения острой РТПХ и эффективности терапии у пациентов после алло-ТГСК.
Материалы и методы. В наше исследование были включены 33 пациента после алло-ТГСК с использованием миелоаблативных - 18 (54%) и немиелоаблатив-ных 15 (46%) режимов кондиционирования в возрасте от 2 до 66 лет. Алло-ТГСК проводили по поводу острых лейкозов 23 (70%), хронический миелолейкоз 4 (12%), апластическая анемия 2 (6%), болезнь Ходжкина 2 (6%), другое 2 (6%). Профилактику оРТПХ проводили согласно протоколу с использованием циклоспорина А в различных сочетаниях с метотрексатом, преднизолоном, микофенолатом мофетилом, САМРАТН. Оценку субпо-пуляционного состава лимфоцитов проводили до начала кондиционирования перед проведением ТГСК, а также в дни +30, +50 и +100 с использованием набора Simultest Kit, Becton Dickinson методом проточной цитометрии.
Результаты. Острая РТПХ развилась у 13 (72%) пациентов после миелоаблативных и у 10 (66%) после не-миелоаблативных алло-ТГСК. В связи с летальными исходами в период до Д+100 и различными социальными причинами 23 пациента не были обследованы полностью, т.е всего у десяти пациентов была получена полная информация о динамике изменения субпопуляционного состава лимфоцитов при проведении алло-ТГСК. Однако выбранная программа обследования, дни проведения исследований и перечень маркеров, определяемых у пациентов, оказались удобны в применении на практике, так как дни, выбранные для проведения обследования, являются критическими в развитии острой РТПХ и прогнозе ее развития. Используемая программа удобно сочетается с проведением сходных обследований. Окончательные данные, полученные в результате статистического исследования, будут представлены в докладе.
ИММУННЫЙ СТАТУС БОЛЬНЫХ ФОЛЛИКУЛЯРНЫМИ ЛИМФОМАМИ РАЗНЫХ ТИПОВ
Долгополова Е.В.. Никитин В.Ю., Цыган В.Н.
Военно-медицинская академия,
Санкт-Петербург, Россия
Среди злокачественных лимфом, возникших из периферических (зрелых) В-клеток, наиболее часто встречается фолликулярная лимфома (примерно в 40% случаев).
Согласно степени гистопатологической дифферен-цировки опухолевого субстрата фолликулярную лимфо-му (ФЛ) подразделяют на три типа. В клинической практике наиболее часто встречается ФЛ 1 и 2 типов (90%), реже ФЛ 3 типа (10%), причем для ФЛ первых двух типов характерно индолентное течение заболевания, тогда как для ФЛ 3 типа - агрессивное. Наряду с этим существует ряд проблем, связанных с дифференциальной диагностикой между ФЛ 1, 2 типа и 3 типа. Поэтому накопление данных о морфологических, клинических и иммунологических особенностях каждой из групп продолжается.
Результаты оценки иммунного статуса больных злокачественными лимфомами весьма противоречивы. В связи с этим дальнейшее изучение иммунного ответа при ФЛ различных типов поможет выбрать правильные методы коррекции иммунологических нарушений у этой категории лиц, а также повысить эффективность лечения.
Цель исследования. Выявить характерные особенности иммунного статуса больных ФЛ 1-2 и 3 типов. Про-
вести сравнительный анализ иммунологических показателей между этими типами ФЛ.
Материалы и методы. Обследовано 18 человек с ФЛ 3 типа III и IV стадий (первая группа), 11 - с ФЛ 1-2 типа III и IV стадий (вторая группа). Контрольную группу составили 28 практически здоровых людей (КГ).
Субпопуляционный анализ лимфоцитов проводили на проточном цитометре Facscan (Becton Dickinson, США); исследовали функциональную активность Т-лим-фоцитов и нейтрофилов; оценивали содержание иммуноглобулинов основных классов (Ig), циркулирующих иммунных комплексов (ИК), цитокинов (IL-ip, IL-4, IL-6, общего IFN, TNF-a); определяли спонтанную и индуцированную продукцию клетками крови вышеуказанных цитокинов.
Основные результаты. В результате исследований установлено:
1. Для больных ФЛ 1-2 или 3 типа характерно достоверно более низкое относительное содержание Т-лимфо-цитов за счет снижения числа Т-хелперов (р<0,05), по сравнению с КГ, а также неадекватная реакция Т-лимфоцитов на ФГА (усиление миграции лейкоцитов). Пациенты первой группы имели достоверно более низкое количество СОЗ+/С08+-лимфоцитов (р<0,05) по сравнению с больными ФЛ 1-2 типа (индолентное течение заболевания).
2. При ФЛ разных типов были обнаружены: достоверно более высокое относительное и абсолютное число С019+-клеток в крови, а также признаки поликлональной активации В-лимфоцитов (повышенное содержание IgG, IgA в сыворотке крови), высокий уровень высокомолекулярных ИК (р<0,05) по сравнению с данными КГ. Для ФЛ 3 типа характерно достоверно более высокое содержание В-клеток и IgM в отличие от ФЛ 1-2 типа (р<0,05).
3. При ФЛ всех трех типов отмечалась выраженная экспрессия маркеров активации (CD25 и HLA-DR) на поверхности лимфоцитов, по сравнению с КГ (р<0,05). Однако более выраженная экспрессия CD25 наблюдалась при ФЛ 3 типа. Корреляционный анализ выявил прямую сильной силы связь между CD25 и С019+-клетками, и прямую средней силы связь между HLA-DR - В-лимфо-цитами и С016+56+-клетками при ФЛ 3 типа. При ФЛ 1-2 типа - только прямую средней силы связь между CD25 и С019+-лимфоцитами.
4. В группе больных ФЛ 3 типа отмечались достоверно более высокое содержание С016+56+-лимфоцитов по сравнению с КГ и второй группой больных (р<0,05), а также признаки повышения поглотительной способности и бактерицидной активности нейтрофилов, которые отсутствовали при ФЛ 1-2 типа.
5. При ФЛ 3 типа выявлены достоверно более высокие сывороточные концентрации IL-6, IL-ip и общего IFN по сравнению с ФЛ 1-2 типа (р<0,05).
Заключение. При ФЛ III, IV стадий наблюдалась супрессия Т-клеточного звена иммунитета и активация гуморального звена иммунитета. Для ФЛ 3 типа (агрессивное течение заболевания), в отличие от ФЛ 1-2 типа (индолентное течение болезни), характерны более выраженные изменения иммунного статуса, указывающие на неэффективность цитотоксического звена Т-клеточного иммунного ответа, а также на более высокую степень активности иммунопатологического процесса, протекающего в организме больных при данном типе ФЛ.
МАРКЕРЫ АП0ПТ03А В ДИФФЕРЕНЦИРОВКЕ ГЕМОПОЭТИЧЕСКИХ КЛЕТОК ЧЕЛОВЕКА
Заботина Т.Н.
Государственное учреждение Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Москва, Россия
Гемопоэтические клетки развиваются из заложенных в онтогенезе стволовых кроветворных клеток и в процессе созревания проходят длинный путь дифференциров-ки. Процесс этот не хаотичен и в норме созревает ровно столько клеток, сколько их необходимо для поддержания гомеостаза. Программированная клеточная смерть (апоп-тоз) является важным механизмом поддержания корректного числа клеток в многоклеточном организме, удаляя при этом вирус-инфицированные, облученные клетки, а также клетки с генетическими повреждениями и клетки в терминальной стадии дифференцировки. При гемобла-стозах частота отдельных вариантов клеток может быть непропорционально велика в результате дисбаланса между пролиферацией клеток и апоптозом. Клетки системы кроветворения разной дифференцировки различаются по степени чувствительности к химиопрепаратам, и, соответственно, происходящие из них новообразования имеют различную лекарственную устойчивость. До недавнего времени диагностика и прогноз течения заболевания основывались только на выяснении линейной принадлежности лейкозных клеток, т.е. на иммунофенотипировании, однако сегодня этих данных уже недостаточно. Для выявления агрессивности лейкоза и назначения адекватных схем терапии проводится оценка экспрессии и функциональной активности молекулярно-биологических параметров бластных клеток.
Целью данной работы явилось: изучение особенностей экспрессии гликопротеидов, регулирующих апоптоз, Bcl-2, Вах, Р53, Ki-67, рецептора CD95, CD243 на различных этапах дифференцировки гемопоэтических клеток человека в норме и на модели лейкозов.
Материалы и методы. В качестве исследуемого материала использовали мононуклеарную фракцию костного мозга и/или периферической крови до/в процессе терапии больных лимфопролиферативными заболеваниями
- ОЛЛ (п=43), ХЛЛ (п=56) и миелопролиферативными
- ОМЛ (п=24), XMJI (п=78), МДС(п=43). Применяли двух- и трехцветный анализ поверхностных антигенов и внутриклеточных онкобелков на проточном цитофлюо-риметре FACSCalibur (Becton Dickinson, США).
Результаты. Было установлено, что на модели лейкозов в пределах лимфоидной дифференцировки на ранних этапах созревания клеток (ОЛЛ) благоприятное прогностическое значение имеет экспрессия поверхностного рецептора CD95, в то время как на поздних стадиях развития В-клеток (ХЛЛ) этот маркер отсутствует, а на митохондриях наблюдается гиперэкспрессия Вс1-2. Анализ фрагментации ДНК (ex vivo) показал, что в обоих случаях в процессе терапии клетки погибают по механизму апоптоза (TUNEL и PI). Миелоидные клетки при ОМЛ и при ХМЛ в стадии бластного криза имеют более сходный характер экспрессии изучаемых маркеров. При этих нозологических формах основное значение приобретают белки, определяющие лекарственную устойчивость -CD243, MRP, LRP. Уровень экспрессии этих белков, а также функциональная активность CD243, определяемая по интенсивности включения и выброса родамина 123, коррелирует с ответом на проводимое лечение. Анализ
прогностической значимости экспрессии бластными клетками белка Р53, а также антигена ядерной пролиферации Ki-67 оказался статистически недостоверным.
У доноров все В-лимфоциты позитивны по экспрессии CD95 и CD243, но имеют фоновые значения Вс1-2, Вах, Р53 и Ki-67. Все Т-клетки позитивны по антигену CD95 и отрицательны по экспрессии CD243.
36-й ДЕНЬ ПРОГРАММНОЙ ПХТ У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМ ЛИМФОБЛАСТНЫМ ЛЕЙКОЗОМ: ИММУНОФЕНОТИПИРОВАНИЕ И ЦИТОГЕНЕТИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ.
Зотова В.В.. Бортникова О.Г., Плужникова Г.Э., Дитор М.П., Сысоева Е.И., Фисенко Л.Н., Яценко И.В.
Детская областная больница, Ростов-на-Дону
В настоящее время установлено, что не все больные ОЛЛ в равной степени отвечают на проводимую терапию. Сохраняющаяся повышенная экспрессия дифференциро-вочных маркеров на бластных клетках костного мозга на 36 день от начала ПХТ, вероятно, свидетельствует о неполном выходе больного в ремиссию.
Целью исследования явилось изучение иммунофенотипа клеток костного мозга и выявление хромосомных аберраций в динамике лечения больных ОЛЛ.
Было обследовано 70 детей в возрасте от 1 года до 17 лет, больных ОЛЛ. У 30 детей проводилось повторное иммуно-фенотипирование на 36 день. У 18 из них было проведено цитогенетическое исследование клеток костного мозга.
При иммунофенотипировании варианты распределились следующим образом: 1) Common-ALL-65,7%, из них в 54,3% случаев выявлялась коэкспрессия миелоидных маркеров (CD13+ и/или CD33+); 2) другие В-лейкозы - 10%, коэкспрессия миеломаркеров в 42,9%; 3) Т-лейкозы - 15,7%, с мие-лоидными рецепторами - 36,4%; 4) бифенотипический вариант составил 5,7%; и 5) недифференцированный ОЛ - 2,9%.
У группы больных (42,9% от общего числа), взятой для изучения minimal residual disease, фенотип в процентном соотношении несколько изменился, однако приоритеты остались прежними: Common-ALL составил 53,3%; прочие В-лейкозы 13,3%; Т-линейные - 16,7%; бифенотипический ОЛЛ
- 10%; недифференцированный - 6,7%. При проведении цитогенетических исследований у 31% больных Common-ALL выявлены хромосомные аберрации. В двух случаях -t(9;22)(q34;ql 1). У больной с В-ОЛЛ обнаружена t(4;ll)(q21;q23). У одного ребенка выявлен клон клеток с del(6)(ql5). У ребенка с про-В ОЛЛ - гипердиплоидность в 100% клеток (56,XX,+1,+3,+7,+8,+11,+16,+20,+21,+22,+Х). У больного с бифенотипическим вариантом установлена транслокация (9;22)(q34;ql 1). При наличии низкого бластоза (менее 5% бластов), на 36-й день терапии у 76,7% больных отмечалась повышенная экспрессия дифференцировочных антигенов. В 52,2% случаев это были больные с Common-ALL, в 13% - с другими В-лейкозами, 21,7% составили Т-лейкозы, 4,3% - бифенотипические (фенотип pre-T-ALL+AML), на недифференцированный ОЛ пришлось 8,7%.
У 41,6% больных с повышенной экспрессией онкомаркеров и хромосомными аберрациями на 36 день программной ПХТ отмечались рецидивы заболевания.
Таким образом, для прогноза заболевания и выбора тактики лечения необходимо проведение иммунофеноти-пирования и кариотипирования на 36 день программной терапии больных ОЛЛ.
ОПЫТ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ТРИПТАЗЫ ЭОЗИНОФИЛЬНОГО КАТИОННОГО БЕЛКА У ПАЦИЕНТОВ С ЭОЗИНОФИЛИЕЙ РАЗЛИЧНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Комарова Л.С.. Зуева Е.Е, Михайлова Н.Б., Буравцова Н.А., Нестерович И.И.,
Афанасьев Б.В., Тотолян Арег А.
СПбГМУ им. акад. И.П. Павлова,
Санкт-Петербург, Россия
Особый интерес среди гемобластозов представляют миело- и лимфопролиферативные заболевания, ассоциированные с высокой степенью эозинофилии, патогенез которой не ясен. При лимфопролиферативных заболеваниях Т-клеточного происхождения моноклональная популяция активированных опухолевых Т-клегок с аберан-тным фенотипом поверхностных маркеров продуцирует большое количество IL-5, вызывая повышенное содержание эозинофилов. У таких пациентов гиперэозинофилия часто ассоциирована с плохим прогнозом (Schwartz R.S., 2003). Увеличение количества эозинофилов в периферической крови связано с продукцией цитокинов, в особенности с IL-5, IL-3, гранулоцитарно-макрофагальным колониестимулирующим фактором. Однако существует точка зрения, что в случае Т-клеточной лимфомы, гиперэозинофилия не связана с высокими уровнями IL-5 (Gutierrez A., et al., 2003). При миелопролиферативных заболеваниях клетки-предшественники эозинофильного ряда экспрессируют на своей поверхностной мембране высокоаффинные рецепторы для IL-5. В некоторых случаях гиперпродукция IL-5, осуществляемая клетками лейкоза, приводит к выраженной эозинофилии.
Недавно было показано повышенное содержание триптазы п/или эозинофильного катионного белка в сыворотке крови у пациентов с некоторыми миелоидными лейкемиями и гиперэозииофильпым синдромом. Предполагается, что триптаза является одним из ключевых медиаторов при взаимодействии тучных клеток и эозинофилов (Klion A. D., et al., 2003). Функциональная и биологическая значимость экспрессии триптазы при миелон-ролиферативных заболеваниях неизвестна.
Цель настоящей работы состояла в изучении прогностической значимости количественного определения триптазы и эозинофильного катионного белка у пациентов с миелопролиферативными и лимфопролифератив-ными заболеваниями, а также при развитии реакции трансплантат против хозяина (РТПХ) после аллогенной трансплантации гемопоэтических стволовых клеток крови (ТГСК) и сопоставлении этих данных с эозинофили-ей неиролиферативного происхождения. Обследовано 13 пациентов сэозинофилией пролиферативного происхождения (мислопролиферативпые заболевания: гиперэози-нофильный синдром (1), хронический эозинофильный лейкоз (1), хронический миелолейкоз (1); лимфопролиферативные заболевания: фолликулярная лимфома (1), болезнь Ходжкина (3), острый лимфобластный лейкоз (1); пациенты после ТГСК с выраженной РТГ1Х (3)); и 17 пациентов с эозинофилией непролиферативного происхождения (бронхиальная астма). Определение концентрации триптазы, эозинофильного катионного белка и основных классов иммуноглобулинов А, М, G, Е осуществлено методами иммунофлюоресцентного и иммунофер-ментного анализа.
При сравнении групп пациентов с эозинофилией пролиферативного и пепролиферативного происхождения была выявлена повышенная концентрация эозинофиль-
ного катионного белка у пациентов гематологической группы в отличие от пациентов с бронхиальной астмой (р<0,05). Достоверного увеличения концентрации триптазы у пациентов обеих групп не выявлено. Прогностическая роль изменения концентрации эозинофильного катионного белка и триптазы при эозинофилии пролиферативного и непролиферативного происхождения связана с различием взаимодействия тучных клеток и эозинофилов в патогенезе пролиферативных и аллергических заболеваний.
КОМПЛЕКСНЫЙ ПОДХОД В ДИАГНОСТИКЕ ЛЕЙКОЗОВ
Марченко Л.А.. Ракитина Е.Л., Титаренко А.И., Ребус Е.А.
Ставропольская государственная медицинская академия, краевой диагностический центр, Ставрополь, Россия
В современных условиях диагностика онкогематоло-гических заболеваний включает морфологические, цитохимические исследования, использование цитогенетического и молекулярного анализа, а также иммунологического фенотипирования.
Морфологические и цитохимические методы по-пре-жнему в большинстве случаев являются фундаментальными в диагностике лейкозов и позволяют охарактеризовать линейную направленность и в большинстве случаев определить степень дифференцировки лейкозных клеток. В настоящее время предложена достаточно широкая панель цитохимических маркеров. Обязательные цитохимические реакции включают выявление миелопе-роксидазы и липидов, исследование активности неспецифических эстераз: а-пафтилацетатэстеразы, а-нафтилбу-тиратэстеразы с оценкой чувствительности реакции к ингибиции фторидом натрия, постановкой РАБ-реакции.
Применение цитогенетических методов важно как при лечении лейкозов, так и для прогноза заболевания.
Однако морфологические и цитохимические исследования, как и любые другие методы, имеют свои ограничения и при некоторых вариантах лейкозов, например, при Мо и М7 по ФАБ-классификации, они неинформативны, поэтому дополнительно требуется использование более точного метода - иммунологического фепотипирова-ния.
Высокая чувствительность метода проточной цитометрии делает возможным его применение в оценке остаточного опухолевого клона в период ремиссии болезни с целыо выявления минимальной резидуальной болезни, а также для прогноза течения опухолевых заболеваний системы крови.
Применение моноклональных антител (МАТ) к антигенам кластеров различной дифференцировки (СБ) гемопоэтических клеток позволяет определить уровень дифференцировки клеточных элементов.
Целыо настоящей работы явилось наряду с морфологическими и цитохимическими методами диагностики проведение анализа экспрессии стандартной панели диф-ференцировочных антигенов на клетках мононуклеарно-го кластера при лейкозах.
Обследовано 96 первичных больных в возрасте от 2 до 80 лет с подозрением на лейкоз, находящихся на обследовании в гематологических отделениях краевого онкологического центра, детской краевой больнице и республиканской больнице КЧР.
У всех больных проведено комплексное морфологическое, цитохимическое исследования, а также иммунологическое фенотипирование.
Цитохимические методы включали определение активности миелопероксидазы, содержание гликогена, липидов, активности лизосомальных ферментов в бластных клетках периферической крови и костного мозга до начала лечения.
На основании морфологических и цитохимических исследований были получены следующие данные: с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) наблюдалось 23 больных, с острым миелобластным лейкозом (ОМЛ) - 14, с острым миеломонобластным лейкозом (ОММнЛ) - И, с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ) - 35, с миелодисп-ластическим синдромом (МДС) -12 и у 1 больного интерпретация результатов исследования с помощью морфологических и цитохимических методов вызвала затруднения.
Дальнейшие исследования проводились с использованием метода иммунологического фенотипирова-ния.
Материалом для иммунологического фенотипирова-ния служила гепаринизированная кровь и костный мозг. Исследования выполняли методом проточной цитометрии с использованием моноклональных антител (МАТ) к дифференцировочным антигенам лейкоцитов человека: CD2, CD3, CD4, CD5, CD7, CD8, CD10, CD19, CD21, CD22, CD13, CD14, CD33, CD34, CD45, HLA-DR, американской фирмы «Caltec». Пробы анализировали на проточном цитометре BRYTE-HS (Bio-Rad) с использованием программы Win Bryte.
На основании анализа антигенной структуры лейкоз-ных клеток больных ОЛЛ были выявлены 2 варианта: ОЛЛ, В-линия и ОЛЛ, Т-линия. У 20 больных определялся ОЛЛ В-линия и у 3 больных ОЛЛ Т-линия. Среди больных с В-линией ОЛЛ определялось наличие следующих антигенов: CD 19+, CD 34+, HLA-DR+, CD10+, каппа и лямбда цепи Ig+. У больных с ОЛЛ Т- линии наблюдалась экспрессия антигенов CD2+, CD3+,CD4+, CD5+, CD7+, HLA-DR+.
Для больных с ОМЛ определялось сочетание следующих антигенов: CD 13+, CD33+, HLA-DR+.
Фенотип бластных клеток больных ОММнЛ характеризовался экспрессией антигенов CD13+, CD14+, HLA-DR+. Отличительным признаком ОММнЛ является экспрессия антигена CD 14+, отсутствующего на лейкозных клетках больных ОМЛ.
У больных ХЛЛ выявлена В-клеточная линия CD 19+.
Фенотип бластных клеток у пациентов с диагнозом МДС характеризовался CD10+, CD20+, CD19+, HLA-DR+(6 человек), и CD5\ CD7+, CD2+(5 человек) и у одного больного была выявлена экспрессия антигенов CD34+,CD19\ HLA-DR+, что прогнозирует возможную трансформацию в острый лейкоз.
У пациента с лейкозными клетками, вызвавшими затруднение в постановке диагноза с помощью морфологических и цитохимических методик, иммунофенотипирование выявило наличие антигенов CD33+, что свидетельствует о миелоидной природе бластных клеток с минимальной диф-ференцировкой (по ФАБ-классификации вариант МО).
Таким образом, использование комплексного подхода в диагностике лейкозов позволяет установить на ранней стадии заболевания линейное происхождение бластных клеток, определить степень их дифференцировки, назначить соответствующую схему лечения и определить прогноз заболевания.
СООТНОШЕНИЕ И СИНТЕЗ НЕКОТОРЫХ ЦИТОКИНОВ - РЕГУЛЯТОРОВ ГЕМОПОЭЗА У БОЛЬНЫХ АПЛАСТИЧЕСКОЙ АНЕМИЕЙ
Розанова О.Е.
Российский НИИ гематологии и трансфузиологии, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Множество цитокинов, продуцируемых клетками иммунной системы, относятся к гемопоэтическим ростовым факторам, являются неотъемлемой частью кроветворения и оказывают влияние на все его этапы. Апласти-ческая анемия (АА) - это тяжелое заболевание системы крови, характеризующееся выраженным нарушением гемо-поэза. В связи с этим исследование синтеза и соотношения цитокинов, продуцируемых мононуклеарпыми клетками периферической крови и костного мозга, у больных АА является актуальным и позволит проанализировать «вклад» иммунной системы в развитие данного заболевания.
С целью выяснения иммуноопосредованных аспектов патогенеза АА задачей настоящей работы явилось исследование синтеза и соотношения гемопоэтических факторов, влияющих в первую очередь на эритро-, тромбо- и гра-нулопоэз: позитивных - эритропоэтин (ЕПО), 1Ь-1(3 и 1Ь-
6, - и негативных - 1ЕЫ-у, ТЫЕ-а. Помимо этого, была изучена продукция антагонистов негативных регуляторов ге-мопоэза и факторов роста Т-лимфоцитов (1Х-4 и 1Ь-2).
Методы исследования. Содержание ЕПО в сыворотке крови и синтез цитокинов исследовали с помощью стандартного метода ИФА у 47 больных тяжелой АА. В работе использовали диагностикумы фирм «Я&О» (США) и «Протеиновый контур» (СПб, Россия). Продукцию цитокинов исследовали в супернатантах мононукле-арных клеток периферической крови и костного мозга (2x10 кл/мл) после их 24-часового культивирования при 37°С без добавления стимуляторов (спонтанная) и в присутствии соответствующих индукторов синтеза цитокинов (индуцированная).
Результаты. Уровень ЕПО был исследован у 37 больных АА и колебался в очень широких пределах: так, у 13 больных он составлял от 5 до 175 млЕ/мл, а у 24 - от 200 до 700 млЕ/мл (при норме 3,3-16,6 млЕ/мл). Таким образом, 35% больных характеризовались нормальным и повышенным, и 65% - высоким содержанием ЕПО. Спонтанная продукция 1Ь-1 у больных АА была повышена в костном мозге в среднем в 1,7 раза и в периферической крови в 6,5 раз. Уровень спонтанной продукции 1Ь-6 у больных АА был также повышен в среднем в 2,8 и в 3,8 раз в периферической крови и костном мозге соответственно. Таким образом, уровень и продукция положительных гемопоэтических факторов у больных АА в целом превышали показатели нормы. Спонтанная продукция 1Ш-у в периферической крови больных хоть и превышала показатели нормы (42 пг/мл) в 1,4 раза, но эти изменения не были достоверными. Что касается другого негативного гемопоэтического фактора - ТКР-а, то установлено резкое повышение спонтанной продукции данного цитокина как в костном мозге (в 5 раз), так и в периферической крови (более, чем в 10 раз). Уровень спонтанной продукции 1Ь4 (антагониста негативных регуляторов гемопоэза и фактора роста В-клеток) в костном мозге не отличался от показателей нормы (10 пг/мл), а в периферической крови был даже несколько сниженным (в 1,4 раза). При этом спонтанная продукция 1Ь-2 (фактора роста Т-лим-фоцитов) у больных АА достоверно превышала показатели нормы в костном мозге в 2,3 раза, а в периферической крови
- в 8 раз. Обращает на себя внимание нарушение соотношения спонтанной и стимулированной продукции практически всех изучены ых цитокинов. выявленное у больных АА.
Заключение. Таким образом, анализ синтеза и соотношения ЕПО, спонтанной продукции ILl-(3, IL-6, IFN-y и TNF-cc у больных АА показывает, что «вклад» иммунной системы в развитие данного заболевания может быть обусловлен не столько недостатком синтеза положительных гемопоэтических факторов, сколько сверхпродукцией негативных регуляторов гемопоэза, а именно - TNF-a. Дисбаланс соотношения цитокинов при АА усугубляется недостаточным уровнем антагонистов негативных факторов (IL-4) и повышенной продукцией цитокина, поддерживающего пролиферацию Т-клсток (IL-2).
ИММУНОФЕНОТИПИЧЕСКИЕ МАРКЕРЫ В ДИАГНОСТИКЕ И ОЦЕНКЕ ПРОГНОЗА В-ХЛЛ И НЕХОДЖКИНСКИХ ЛИМФОМ В ФАЗЕ ЛЕЙКЕМИЗАЦИИ
Сергееев B.C.. Никитин В.Ю.,Шинкарева О.Г.
Военнно -медицинская академия,
Санкт-Петербург, Россия
Введение: иммуиофенотипирование методом проточной цитометрии является одним из самых важных и перспективных методов в диагностике хронического В-клеточного лимфолейкоза и неходжскинских лимфом в стадии лейкемизации. Несмотря на большой интерес исследователей и клиницистов к данной проблеме, не получено достаточного количества материала для принятия единых иммуиофснотипичсских критериев в диагностике и оценке прогноза внутри данной группы заболеваний. В связи с этим результаты каждого исследования в данной области представляют собой значительный интерес.
Цель и задачи: методом проточной цитометрии установить иммунофенотинический диагноз и провести дифференциальную диагностику внутри данной группы заболеваний, оценить прогностическую значимость CD36, CD38, CD95 для течения В-ХЛЛ.
Материалы и методы: было обследовано 11 больных, проходивших обследование и лечение в клинике гематологии и клинической иммунологии военно-медицинской академии, имеющих предварительный диагноз В-ХЛЛ (нсходжскинская лимфома). Иммунофенотипирование лимфоидных элементов периферической крови и костного мозга проводили на проточном цитометре FACSscan (программа CellQuest) фирмы Becton Diskinson. При иммунофенотипироваиии для диагностики заболевания использовали следующие комбинации моноклональных антител: CD3/CD19/CD45, SmIgK/SmIgVCD19, CD5/ CD23/CD19, CD103/CDllc/CD19, FMC7/CD79a, CD24, CD22, CD25/HLA-DR/CD19, CD10/CD20/CD19, CD4/ CD8/CD3. Для оценки прогноза заболевания использовались моноклональные антитела CD95/CD38/CD19, CD36/CD19.
Основные результаты: при иммунофенотиническом исследовании лимфоцитов лизированной крови/костного мозга во всех случаях обнаружена высокая экспрессия CD19. В 6 случаях обнаружена выраженная экспрессия CD5, CD23, CD24 и CD20 при отсутствии экспрессии CD103, FMC7 и slgM, что позволило поставить иммуио-фенотипический диагноз В-ХЛЛ. 2 случая из данной группы характеризовались высокой экспрессией CD38 (свыше 20% клеток); все случаи В-ХЛЛ были отрицатель-
ны по CD36 и CD95. Обнаружена высокая прогностическая значимость CD38: позитивная по CD38 категория больных характеризовалась неблагоприятным течением заболевания с более продвинутой стадией (III-IV по Rai), плохой чувствительностью к проводимой химиотерапии, коротким временем наступления рецидива после первого лечения и короткой выживаемостью, тогда как группа больных, негативных по CD38, характеризовалась менее продвинутой стадией заболевания и требовала лишь наблюдения или минимального лечения. Не была обнаружена прогностическая значимость CD95 и CD36.
В 3 случаях был поставлен иммунофенотипический диагноз В-клеточной неходжкинской лимфомы - лимфома селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами. Они характеризовались выраженной экспрессией CD22, FMC7, при отсутствии CD23. В 2 случаях были выявлены моноклональные легкие цепи каппа иммуноглобулинов, в одном - выраженная экспрессия CD5, что не характерно для данного вида лимфом, но может выявляться в 25% случаев.
2 случая из 11 характеризовались выраженной экспрессией (на клетках в гейте, расположенном в зоне несколько выше зоны нормальных лимфоцитов) CD 11с, CD25, CD20, CD22 и CD103, при отсутствии экспрессии CD5 и CD23, что позволило поставить иммунофенотипический диагноз - волосато-клеточный лейкоз.
Иммунофенотииические диагнозы всех 11 случаев были подтверждены данными морфологических методов исследования.
Заключение: иммунофенотип лимфоидных элементов крови и костного мозга во всех случаях соответствовал «классическому» иммунофенотипу, встречающемуся в данной группе заболеваний, за исключением одного случая лимфомы селезенки с ворсинчатыми лимфоцитами, характеризовавшейся высокой степенью экспрессии CD5. Выявлена высокая прогностическая значимость CD38 для предсказания характера течения В-ХЛЛ.
СВЯЗЬ ИММУНОЛОГИЧЕСКИХ И ГЕНЕТИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ С ОТВЕТОМ НА ТЕРАПИЮ БОЛЬНЫХ В-КЛЕТОЧНЫМ ХРОНИЧЕСКИМ ЛИМФ0ЛЕЙК030М
Стадник Е.А.. Зуева Е.Е., Салогуб Г.Н., Степанова Н.В., Комарова JI.C., Алексеева Ю.А.*, Вобищук Р.И.*, Медведева Н.В.*, Афанасьев Б.В., Зарицкий А.Ю.
Санкт-Петербургский государственный медицинский университет им. акад. И.П.Павлова,
* Городская больница №31,
Санкт-Петербург, Россия
В настоящее время очевидна гетерогенность популяции больных хроническим лимфолейкозом как по наличию соматических мутаций генов тяжелых цепей иммуноглобулинов, так и но поверхностным антигенным структурам. В связи с этим изменились подходы к срокам и режимам назначения современной химиотерапии, целью которой является достижение полной клинико-ге-матологической и иммунологической ремиссии. В качестве прогностического маркера широко обсуждается роль CD38. Интерес к данному маркеру объясняется тем, что трансформированные С05-позитивные В-лимфоциты, экспрессирующие CD38, имеют большее сродство со стро-мой костного мозга, чем другие клетки, а это может приводить к антиапоптотическому эффекту (Dialo S. Е.а., 2000), который опосредуется транскрипционным факто-
ром АКТ (2иЫаиг М. Е.а., 2001). Выявлена корреляция экспрессии СБ38 с продукцией эндотелиального ростового фактора (Мс.СаЬе е.а., 2004). В связи с этим целью настоящего исследования была оценка экспрессии С038, СБЮ и мутационного статуса в лейкемических лимфоцитах больных В-ХЛЛ. В исследование включено 60 больных с иммунологически верифицированным В-ХЛЛ (СВ5+СБ19+С023+), 30 из них получали терапию по схеме флюдарабин + циклофосфан (ФЦ), троим больным выполнена аутологичная трансплантация гемопоэтичес-ких стволовых клеток. Иммунофенотипирование было проведено методом многопараметрической проточной цитометрии, мутационный статус был исследован методом РТ-РС11 с последующим сиквенсом (выполнено Никитиным Е.А., ВГНЦ г. Москва).
Низкое количество СБ38+ лейкемических лимфоцитов (менее 20%), определяемых в дебюте заболевания, коррелировало с достижением клинико-гематологичес-кой и иммунологической ремиссии (р<0,05).
Клинико-гематологическая ремиссия была достигнута только у 2 из 10 больных с высоким содержанием СБ38+ клеток, и ни у одного из них не было иммунологической ремиссии. Двум больным данной группы была проведена аутотрансплантация гемопоэтических стволовых клеток, приведшая к стойкой клинико-гематологи-ческой ремиссии (время наблюдения 6 мес).
Все больные, в клетках которых определялась соматическая мутация тяжелых цепей, также достигли клиникогематологическую и иммунологической ремиссии. Все больные без соматической мутации ремиссии не достигли.
У 4 из 60 больных выявлена экспрессия СБЮ на лейкемических клетках с типичным для В-ХЛЛ иммунофенотипом, у всех этих больных отсутствовали соматические мутации тяжелых цепей, но биологический смысл этого явления не ясен.
Таким образом, выявлена гетерогенность больных ХЛЛ по ответу на терапию ФЦ, которая четко коррелировала с экспрессией СБ38 и отсутствием соматических мутаций (неблагоприятные признаки). По-видимому, больные с экспрессией СБ38 и отсутствием соматических мутаций требуют более интенсивной химиотерапии, включая трансплантацию гемопоэтических стволовых клеток. Требует дальнейшего изучения прогностическая значимость СБ10.
ОСОБЕННОСТИ ИММУНОФЕНОТИПА ВЛАСТНЫХ КЛЕТОК ПРИ ОСТРЫХ ЛИМФОБЛАСТНЫХ ЛЕЙКОЗАХ С ТРАНСЛОКАЦИЕЙ I (12;21)
Улейская Г.И.. Балдуева И.А., Белогурова М.Б., Бойченко Э.Г., Лыщёв А.А., Капустин С.И., Огородникова Ю.С., Щёкина Л.А.
ГУЗ Городская больница №31, Санкт-Петербург, Россия; ГУЗ Детская городская больница № 1, Санкт-Петербург, Россия
Введение. Современная диагностика острых лейкозов (ОЛ) - многоступенчатый процесс. Она включает в себя целый ряд тестов, позволяющих выявить различные свойства бластных клеток (экспрессию маркеров дифференци-ровки на поверхности и внутри клеток, уровень активности внутриклеточных ферментов, специфические хромосомные и генные нарушения). Определенные трудности в установлении варианта ОЛ возникают при наличии при-
знаков как лимфоидной, так и миелоидной дифференци-ровки бластных клеток. В таком случае важной является комплексная оценка результатов молекулярно-генетического (МГ) исследования и иммунофенотипирования (ИФТ) бластных клеток. Особый интерес в данном отношении представляет группа детских острых лимфобластных лейкозов (ОЛЛ) с наиболее распространенной специфической хромосомной перестройкой - транслокацией t(12;21). Выявляемая в 20-30% случаев при данной транслокации коэкспрессия миелоидных маркеров может служить причиной трудностей при установлении линейной (миелоидной или лимфоидной) природы бластных клеток.
Материалы и методы. Исследуемая группа состояла из 28 детей в возрасте от 1 года до 14 лет с первичным диагнозом ОЛ, поступивших на лечение в детскую городскую больницу №1 и городскую больницу №31 в 2000-2004 гг. Поданным МГ исследования, у всех больных была выявлена ОТ-ПЦР методом транслокация t (12;21). Для определения иммунофенотипа клеток использовались моноклональные антитела фирм «Dako» и «Becton Dickinson», учет результатов проводили на люминесцентном микроскопе ЛЮМАМ РП011.
Результаты. При ИФТ иммунологические варианты распределились следующим образом: Common-ALL - 23/ 28 (82%); Pre-pre-B-ALL-1 /28 (4%); Pre-B-ALL - 3 /28 (10%), бифенотип - 1/28 (4%). У 5/28 (18%) наблюдалась коэкспрессия рецепторов миелоидных маркеров (CD13+ и/или CD33+, CD15+, CD64+, суМРО+), причем наибольшие диагностические сложности при установлении варианта ОЛ наблюдались у двоих детей.
Больной А., 9 лет. Содержание бластов в миелограм-ме данного пациента равнялось 39%. Из цитохимических реакций: PAS - была положительна по лимфоидному типу, РОХ - отрицательна. ИФТ выявило 39% клеток, экспрессирующих маркеры В-клеточной линии (CD10+CD19+) и 31% клеток, экспрессирующих миело-идные маркеры (CD15+CD64+). Иммунологический профиль бластных клеток не был установлен из-за низкого их содержания в костном мозге и присутствия двух популяций клеток. Лишь комплексная оценка результатов МГ исследования и ИФТ позволила сделать вывод о наличии ОЛЛ, t(12;21) с коэкспрессией миелоидных маркеров на бластных клетках.
Другой больной - В., 3 года. По данным миелограммы, костный мозг содержал высокий процент (91%) бластов. Результаты цитохимических реакций (PAS, РОХ, судан) были отрицательными. ИФТ обнаружило популяцию клеток, экспрессирующих как маркеры В-клеточной линии (CD10+CD19+), так и миелоидные маркеры (CD13+CD33+CD15+CD7+cyMPO+) в 85 и в 83% соответственно. Экспрессии маркеров раннего гемопоэза, характерных для острых лимфобластных лейкозов, не было выявлено. Результаты МГ исследования и ИФТ позволили установить диагноз острого бифенотипического лейкоза. Учитывая специфическую природу транслокации t( 12;21), пациенту был назначен курс терапии острого лимфобластного лейкоза. Хороший ответ на преднизолоновую профазу и достижение полной клинико-гематологической ремиссии в установленные протоколом (СО ALL) сроки свидетельствуют о правильном выборе лечебной тактики.
Выводы. Комплексный подход в диагностике ОЛ, включающий оценку фенотипа и генотипа опухолевых клеток, позволяет установить их биологическую природу и назначить адекватную специфическую терапию заболевания.
ОСОБЕННОСТИ ИММУННОГО СТАТУСА У ДЕТЕЙ С ВИРУСНЫМ ГЕПАТИТОМ С НА ФОНЕ ОСТРОГО ЛИМФОБЛАСТНОГО ЛЕЙКОЗА.
Худайкулова Г.К.. Камилов А.И., Туйчиев Л.Н., Аладова Л.Ю.
Первый Ташкентский государственный медицинский Институт, Ташкент, Узбекистан
Вирусный гепатит С (ВГС) занимает особое место среди инфекций, сопутствующих острому лимфобластному лейкозу (ОЛЛ), который в свою очередь является наиболее распространенной онкогематологической патологией детского возраста. С одной стороны, развитие ВГС может приводить к необходимости прерывания лечения ОЛЛ, что способствует повышению частоты его рецидивов. С другой стороны, само течение ВГС представляет угрозу здоровью ребенка и может у выздоровевшего от ОЛЛ пациента привести в последующем к формированию цирроза печени и гепатоцеллюлярной карциномы.
Целью исследования явилось изучение иммунологического реагирования у детей с сочетанным течением вирусного гепатита С и острого лимфобластного лейкоза.
Материалы и методы. Под наблюдением находились 74 больных ребенка с ОЛЛ, инфицированных ВГС. Диагноз ВГС был верифицирован у них на основании обнаружения в сыворотке крови анти-HCV методом ИФА, а также RNA HCV методом ПЦР. Мембранные маркеры субпопуляций лимфоцитов определяли методом непрямого розеткообра-зования с использованием моноклональных антител: CD3
- Т-лимфоциты, CD4 - Т-хелперы, CD8 - Т-супрессоры, CD16 - естественные киллеры, CD20 - В-лимфоциты. Ко-
личественное определение сывороточных иммуноглобулинов проводили методом простой радиальной иммунодиффузии в геле по в. Мапаш (1965) с использованием моно-специфических сывороток против иммуноглобулинов человека и стандартной сыворотки крови человека. Результаты сравнивали с показателями 30 здоровых детей.
Полученные результаты. При изучении клеточного иммунитета у детей с ОЛЛ, инфицированных ВГС, выявлен дефицит всех показателей. Уровень Т-лимфоцитов был снижен в 2,3 раза (р<0,05), Т-хелперов - в 3,5 раза (р<0,05), Т-супрессоров - в 2 раза (р<0,05), ЕК-клеток -в 9 раз (р<0,05) по сравнению с группой здоровых детей, что свидетельствовало, по-видимому, о перераспределении иммунокомпетентных клеток в пораженные ткани, а также о нарушении маркировки Т-клеток, а именно, нарушении их созревания и дифференцировки, на что также указывало и снижение иммунорегуляторного индекса, который составил 1,7±0,1.
Со стороны показателей гуморального иммунитета отмечалось снижение относительного и абсолютного содержания В-лимфоцитов в 2 раза по сравнению с контролем (р<0,05), а также угнетение синтеза всех классов иммуноглобулинов: уровень ^А был снижен в 1,6 раз, уровень был снижен в 2 раза, ^М были ниже в 2,1 раза по сравнению с контролем.
Заключение. Сочетанное течение вирусного гепатита С и острого лимфобластного лейкоза сопровождается глубоким угнетением факторов клеточного и гуморального звеньев иммунитета, что требует включения иммунокорригирующих препаратов в комплекс поддерживающего лечения в ремиссии ОЛЛ.
