CC BY
61
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
DOI: 10.15690/ONCO.V3I2.1543
О.П. Колбацкая1, Т.В. Горбунова2, В.Г. Поляков2, 3, Н.Н. Тупицын1, А.В. Попа2, И.Н. Серебрякова2, В.В. Тимошенко1, Т.В. Шведова2
1
НИИ клинической онкологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, Москва, Российская Федерация
2
НИИ детской онкологии и гематологии ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России,
Москва, Российская Федерация
3
Российская медицинская академия последипломного образования Минздрава России,
Москва, Российская Федерация
Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга детей, больных острыми лейкозами, рабдомиосаркомой и саркомой Юинга
В отечественной и зарубежной литературе еще недостаточно данных об иммунной системе костного мозга детей в норме и при развитии острых лейкозов и солидных опухолей. Целью работы стало изучение количественных особенностей субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей при развитии острых лейкозов и мелкокруглоклеточных сарком (рабдомиосаркомы и саркомы Юинга). Материалы и методы. В исследование включены 111 детей в возрасте от 9 мес до 17 лет, средний возраст — 7,6±0,4 года. Рабдомиосаркома была диагностирована у 16 детей, саркома Юинга (СЮ) — у 16, острый лимфобластный лейкоз (ОЛЛ) — у 38, острый миелоидный лейкоз (ОМЛ) — у 26. У15 детей в ходе проведенного комплексного обследования наличие злокачественного заболевания было исключено (группа сравнения). Всем пациентам было выполнено морфологическое и иммунологическое исследование костного мозга. Результаты. Характерным изменением субпопуляционного состава костного мозга больных при обоих видах сарком является повышение процента CD3+HLADR+ и CD8+HLADR+ Т клеток и снижение процента Leu8+CD4+ Т клеток по сравнению с данными контрольной группы (p<0,05). Но только у больных СЮ отмечалось абсолютное повышение количества CD8+HLADR+ Т клеток (4,6±1,0 против 1,8±0,4 тыс/ мкл; р=0,030), а также снижение относительного и абсолютного количества Leu8+CD4+ субпопуляции (13,7±2,4 против 33,5±4,7%, р=0,001; 2,2±0,8 против 5,3±1,1 тыс/мкл, р=0,031). Для обоих вариантов ОЛ сходным было повышение процента CD5+ Т клеток и снижение процента CD8+ Т клеток (р<0,05), абсолютные значения не отличались от контрольных (p>0,05). Сравнение субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ выявило достоверные различия только в процентах CD19+ и CD19+CD5+ В клеток, которые были достоверно ниже у больных ОМЛ (13,4±1,8 против 19,5±2,1%; р=0,033 и 2,2±0,5 против 4,7±0,8%, соответственно; р=0,016). При ОЛ в большей степени был снижен процент цитотоксических Тлимфоцитов (ЦТЛ), чем при саркомах, максимальное относительное содержание CD8+ Т клеток было в костном мозге больных рабдомиосаркомой. Содержание Т хелперов во всех четырех группах больных достоверно не различалось между собой в относительных и абсолютных числах (p>0,05). Выводы. На основании проведенного нами комплексного морфологического и иммунологического исследования установлено, что злокачественные заболевания характеризуются специфическими для каждой нозологической формы изменениями субпопуляционного состава Т и В лимфоцитов костного мозга, что позволяет выявить их клиническое и прогностическое значение, лучше понимать механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы и может быть полезным при разработке программ иммунотерапии.
Ключевые слова: субпопуляции лимфоцитов, костный мозг, острые лейкозы, Т лимфоциты, В лимфоциты, NK клетки, саркома Юинга, рабдомиосаркома.
(Для цитирования: Колбацкая О.П., Горбунова Т.В., Поляков В. Г., Тупицын Н.Н., Попа А. В., Серебрякова И.Н., Тимошенко В.В., Шведова Т.В. Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга детей, больных острыми лейкозами, рабдомиосаркомой и саркомой Юинга. Онкопедиатрия. 2016;3(2):91-105. doi: 10.15690/onco.v3i2.1543)
91
ВВЕДЕНИЕ
Костный мозг, с одной стороны, является центральным органом гемопоэза и иммунопоэза, обеспечивает сохранность и целостность орга-
низма, с другой — выполняет функции вторичного лимфоидного органа, в котором находятся основные антителопродуценты (плазматические клетки) и лимфоциты-эффекторы. В исследовани-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ях M. Feuerer и соавт. показано, что костный мозг является ключевым органом в индукции и повышении противоопухолевого иммунного ответа, эффективность которого коррелирует с количеством зрелых Т клеток костного мозга [1]. Но среди литературных источников нет систематизированных данных о показателях иммунной системы костного мозга детей в норме, о количественных
и качественных особенностях иммунной системы костного мозга детей при развитии как лейкозов, так и солидных опухолей, их прогностическом значении и возможности применения иммунотерапии.
Острые лейкозы у детей (ОЛ) — являются частым злокачественным заболеванием у детей. P. Yotnda и соавт. изучили вопрос, почему наличие in vivo специфического иммунного ответа при В-клеточном
92
O.P. Kolbatskaya2, T.V. Gorbunova1, V.G. Polyakov1, N.N. Tupitsyn2, A.V. Popa1,
I.N. Serebryakova1, V.V. Timoshenko2, T.V. Shvedova1
Pediatric Oncology and Hematology Research Institute, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center,
Moscow, Russian Federation
2
Clinical Oncology Research Institute, N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center,
Moscow, Russian Federation
3
Russian Medical Academy of Postgraduate Education, Moscow, Russian Federation
The Comparative Analysis of Bone Marrow Lymphocyte Subsets in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia, Rhabdomyosarcoma,
and Ewing’s Sarcoma
Russian and foreign literature presents insufficient data about the bone marrow immune system of children under normal and pathological conditions (acute leukemia (AL) and solid tumors). The aim of the research was to study the quantitative characteristics of bone marrow lymphocytes subpopulations in children with developing acute leukemia and small round cell sarcomas (rhabdomyosarcoma (RMS) and Ewing's sarcoma family tumors (ESFT). Materials and methods. The study included 111 children aged 9 months to 17 years (mean age - 7.6±0.4 years). Rhabdomyosarcoma was diagnosed in 16 children, Ewing's sarcoma (CIO) — in 16 children, acute lymphoblastic leukemia (ALL) — in 38 children, and acute myeloid leukemia (AML) — in 26 children. Malignancy was excluded basing on complex assessment in 15 cases (experimental group). All patients underwent cytological and immunological examination of bone marrow. Results. Typical change in the bone marrow subpopulations of patients with both types of sarcomas was the increase in the percentage of CD3+HLADR+ and CD8+HLADR+ T-cells and the decrease in the percentage of Leu8+CD4+ T cells versus the control group data (p<0.05). But only in patients with ESFT we detected the absolute increase in the number of CD8+HLADR+ T cells (4.6tys/mm±1.0 against 1.8tys/mm±0.4, p=0.030) and reduction in the relative and absolute number of Leu8+CD4+ subpopulations (13.7%±2.4 against 33.5%±4.7, p=0.001; 2.2tys/mm±0,8 against 5.3tys/mm±1.1, p=0.031). In patients with both types of AL we observed the increase in percentage of CD5+ T cells and decrease in percentage of CD + T cells (p<0.05), the absolute values were similar to control (p>0.05). Comparison of bone marrow lymphocytes subpopulations in ALL and AML patients demonstrated the significant differences only in the percentage of CD19+ and CD19+CD5+ B cells, the value was significantly lower in AML patients (13.4%±1.8% vs 19.5±2.1, p=0.033 and 2.2%±0.5% vs 4.7±0.8, p=0.016, respectively). The percentage of CTLs was proportionately lower under AL than sarcomas, the maximum relative content of CD8 + T cells was revealed in the bone of RMS patients. The T-helper cells content in all four treatment groups did not significantly differ in relative and absolute values (p>0.05). Conclusions. Comprehensive morphological and immunological examination results demonstrated that these cancers are characterized by specific changes in subpopulation content of T and B bone marrow lymphocytes that revealed their clinical and prognostic value, the mechanisms of interaction between the tumor and the immune system, and may be useful in the development of immunotherapy programs.
Key words: subpopulation of lymphocytes, bone marrow, acute leukemia, T-lymphocytes, B-lymphocytes, NK-cells, Ewing’s sarcoma, rhabdomyosarcoma.
(For citation: Kolbatskaya O.P., Gorbunova T.V., Polyakov V.G., Tupitsyn N.N., Popa A.V., Serebryakova I.N., Timoshenko V.V., Shvedova T.V. The Comparative Analysis of Bone Marrow Lymphocyte Subsets in Children with Acute Lymphoblastic Leukemia, Rhabdomyosarcoma, and Ewing's Sarcoma. Onkopediatria. 2016;3(2):91-105. doi: 10.15690/onco.v3i2.1543)
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
лимфобластном лейкозе (В-ОЛЛ) у детей не подавляет лейкемический клон [2]. По результатам работы было выявлено, что Т-клеточный иммунный ответ с участием Т хелперов и цитотоксических Т лимфоцитов (ЦТЛ) был ингибирован на многих уровнях, что в целом могло объяснить его неэффективность.
Саркомы мягких тканей и костей составляют 12% всех злокачественных опухолей детского возраста. Несмотря на то, что в последние годы доказана важная роль костного мозга в канцерогенезе и метастазировании, до сих пор остаются неизученными иммунологические факторы прогноза при солидных опухолях у детей. Отечественные авторы ранее показали, что клетки естественной резистентности костного мозга приводят к редукции имеющихся метастазов сарком и предотвращают появление новых [3, 4]. Дефекты иммунной системы костного мозга могут иметь значение уже на этапе возникновения сарком и в качестве источника происхождения опухоли многие авторы указывают мультипотентную мезенхимальную стволовую клетку, находящуюся в костном мозге [5]. В исследованиях D. Cho и соавт. [6], Z. Fan и соавт. [7] показана тесная связь лимфоцитов костного мозга и клеток костных и мягкотканных сарком. В последние годы открыта важная роль ySTCR лимфоцитов, натуральных киллеров и CD3+CD57+ Т лимфоцитов в противоопухолевом иммунитете [6, 8, 9].
Детальная характеристика лимфоцитарных субпопуляций костного мозга при злокачественных заболеваниях у детей (острых лейкозах и саркомах) является в настоящее время актуальной задачей, решение которой может улучшить результаты лечения больных, в частности при использовании методов иммунотерапии. Сравнение количественных характеристик субпопуляций лимфоцитов костного мозга детей, больных острыми лейкозами и саркомами, позволит выявить степень угнетения/ активации клеточного звена иммунитета.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
В наше исследование были включены 26 пациентов с острым миелоидным лейкозом (ОМЛ), 38 — с острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ), 32 — с солидными опухолями (рабдомиосаркома и саркома Юинга); 15 детей, у которых были исключены злокачественные неоплазии, составили контрольную группу.
Всем пациентам злокачественное заболевание было диагностировано de novo по результатам комплексного клинического обследования, включающего современные методы диагностики онкологических заболеваний. Диагноз во всех случаях был верифицирован на основании результатов морфологического, цитохимического (лаборатория детской гемоцитологии; руководитель — докт. мед. наук И.И. Матвеева) и иммунофенотипического исследования костного мозга (лаборатория
иммунологии гемопоэза; руководитель — докт. мед. наук, проф. Н.Н. Тупицын), а также иммуногистохимического исследования биоптата саркомы в отделе патологической анатомии опухолей человека (руководитель — докт. мед. наук, проф. А.И. Карселадзе). Всем больным проведено морфологическое (подсчет миелограммы) и иммунологическое (количественный анализ лимфоцитарных субпопуляций) исследование костного мозга.
У всех включенных в нашу работу пациентов взятие пунктата костного мозга в количестве 0,5 мл осуществлялось в пробирки с сухим ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) с последующим приготовлением морфологических препаратов и их окраской по Паппенгейму. Диагноз ОЛ у всех больных был установлен согласно критериям классификации ВОЗ (2008), число бластов во всех случаях превышало 20%. При цитохимическом исследовании определяли активность в бластных клетках миелопероксидазы, липидов в реакции с суданом черным В, а-нафтил-ацетат-эстеразы самостоятельно и в реакции с ингибированием фторидом натрия (NaF), PAS-положительное вещество в диффузной/диффузно-гранулярной форме. Количество позитивных клеток выражалось в процентном значении.
Иммунофенотипирование у всех больных проводилось методом прямой иммунофлюоресценции с использованием тройной флюоресцентной метки. Панель моноклональных антител (МКА) включала антитела к общелейкоцитарному антигену CD45, стволовоклеточному антигену CD34, линей-но-нерестриктированным антигенам CD38 и HLA-DR, антигенам миелоидной (CD13 и CD33), моноци-тарной (CD14 и CD64), эритроидной (гликофорин А) и мегакариоцитарной (CD61) линии дифференци-ровки, общему антигену острого лимфобластного лейкоза CD10 (CALLA), В-линейным антигенам (CD19, CD20, CD22, CD23), Т-линейным антигенам (CD3, CD5, CD7, CD4, CD8) и NK-клеточному антигену CD56. Маркер расценивался как положительный при обнаружении его более чем на 10% бластов для CD34 и более чем на 20% бластов для остальных антигенов. Для установления варианта острого лейкоза (ОМЛ и ОЛЛ) использовалась одна и та же панель МКА, за исключением того, что для диагностики пре-Т-варианта ОЛЛ использовался кортикальный тимоцитарный маркер CD1a. В панели антител, использованных при диагностике ОМЛ и ОЛЛ, отсутствовали антитела к антигенам CD28, CD57, CD25, Leu8, ар- и уб-цепям TCR, так как данные маркеры не имеют диагностической ценности при изучении бластной популяции, но представляют большой интерес при оценке иммунологического статуса костного мозга детей, больных рабдомиосаркомой и СЮ.
Статистические расчеты проведены с помощью программы SPSS 17 и включали корреляционный анализ (коэффициент Пирсона), сравнение средних (критерий Стьюдента) и точный крите-
93
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
94
рий Фишера с доверительным интервалом 95%. Различия считались статистически значимыми при р<0,05 (95% точности).
Характеристика группы детей,
больных ОМЛ
В данной группе 26 человек в возрасте от 1 года до 15 лет, медиана возраста составляет 8,2±0,7 года, из них мальчиков 14 (53,8%), девочек — 12 (46,2%). Большинство детей исследуемой группы имели острый миелобластный лейкоз с созреванием (М2) — 38,5% случаев и острый миеломонобластный лейкоз (М4) — 23,1%. Реже встречались острый миелобластный лейкоз без созревания (М1) — 15,4% случаев и острый моно-бластный лейкоз без созревания (М5а) — 11,5% (у 3 пациентов). Острый миелобластный лейкоз с минимальными признаками дифференцировки (М0) диагностирован в 7,7% случаев, а острый про-миелоцитарный лейкоз (М3) — в 3,8% (у 1).
Характеристика группы детей,
больных ОЛЛ
В данной группе всего 38 детей в возрасте от 0,9 до 15 лет, средний возраст — 6,0±0,6 года: мальчиков — 23 (60,5%), девочек — 15 (39,5%).
В группе детей преобладал пре-пре-В-иммуно-подвариант (у 33; 87,0%); пре-Т-иммуноподвариант был диагностирован в 4 (10,4%), про-В-иммунопод-вариант — всего в 1 (2,6%) случае. При анализе лимфоцитарной субпопуляции больных ОЛЛ нами было отмечено, что в части случаев бластная субпопуляция характеризовалась яркой экспрессией общелейкоцитарного CD45-антигена. Поэтому было невозможно отделить бластную субпопуляцию от лимфоцитарной по характеристикам светорассеяния.
Среди больных ОЛЛ яркая экспрессия CD45-антигена отмечена в основном в случае пре-пре-В-иммуноподварианта (у 6; 54,5%), реже CD45+++ экспрессия на бластных клетках встречалась при пре-Т-иммуноподварианте (у 4; 36,4%). Про-В-ОЛЛ был диагностирован у 1 (9,1%) больного, поэтому делать вывод о закономерности степени экспрессии CD45-антигена при данной нозологии будет неправомерно. Слабая экспрессия CD45-антигена была отмечена у больных пре-пре-В-ОЛЛ (у 27; 100%), поэтому только в данной нозологической группе было проанализировано количество субпопуляций лимфоцитов костного мозга.
Характеристика группы детей, больных
рабдомиосаркомой и СЮ
Рабдомиосаркома диагностирована у 16 детей в возрасте от 1 года до 15 лет, средний возраст — 6,8±1,0 года, у которых при морфологическом исследовании костного мозга было исключено метастатическое поражение. Мальчиков и девочек было по 8 человек (по 50%, соответственно).
Группа больных СЮ включает 16 человек: 11 (68,8%) мальчиков и 5 (31,2%) девочек в возрасте от 2 до 16 лет, средний возраст — 10,6±1,0 года. Классическая саркома Юинга была диагностирована у 12 (75%) больных, примитивная нейроэктодермальная опухоль (ПНЭО) — у 3 (18,8%), опухоль Аскина — у 1 (6,2%).
Ядросодержащие клетки пунктата костного мозга выделяли путем стандартного лизиса эритроцитов с помощью раствора FACS Lysing solution (Becton Dickinson, США). Окраска лимфоцитарных популяций проводилась с использованием широкой панели моноклональных антител (МКА) (трехцветная флюоресценция) (Becton Dickinson, США).
Характеристика группы сравнения
В данную группу включены 15 детей в возрасте от 1 года до 17 лет, медиана возраста — 8,4±1,5 года, из них 11 (73,3%) мальчиков и 4 (26,7%) девочки. В поликлинике НИИ ДОиГ в связи с наличием доброкачественных опухолей, пороков развития органов и тканей, воспалительных процессов пациенты прошли полное общеклиническое обследование, в том числе при помощи визуализирующих и лабораторных методов. Наличие злокачественной опухоли было исключено по данным гистологического исследования. При изучении субпопуляций лимфоцитов детей контрольной группы использована та же панель антител, что и при исследовании лимфоцитов костного мозга детей, имеющих солидные опухоли. Мы использовали результаты исследования субпопуляций лимфоцитов костного мозга этих детей для сопоставления с результатами, полученными при изучении лимфоцитарных субпопуляций у больных ОЛ, рабдомиосаркомой и СЮ.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Показатели гемопоэза и субпопуляции лимфоцитов костного мозга у детей контрольной группы
Пунктаты костного мозга детей, не имеющих злокачественных опухолей, были нормоклеточными (53,3%) и среднеклеточными (46,7%), показатели миелограмм в основном не отличались от общепринятых норм по А.И. Воробьёву
Мы проанализировали лимфоцитарные субпопуляции костного мозга детей контрольной группы с целью изучения иммунного статуса нормального костного мозга в детском возрасте и последующего сравнения с количеством лимфоцитарных субпопуляций костного мозга у детей, больных острым лейкозом и саркомами: данные представлены в табл. 1:
Показатели гемопоэза и субпопуляции лимфоцитов костного мозга у детей, больных рабдомиосаркомой и СЮ
Мы проанализировали состояние гемопоэза у детей, больных рабдомиосаркомой и СЮ, в сравнении с данными контрольной группы. При сравне-
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
Таблица 1. Лимфоцитарные субпопуляции костного мозга детей контрольной группы
Субпопуляция n Min, % Max, % M±m, %
CD3 15 26,6 90,0 60,8±5,0
CD7 3 34,8 78,1 57,1±12,5
CD5 13 23,8 93,3 59,2±5,4
CD56 12 1,1 22,8 9,4±1,7
CD19 15 1,9 60,2 26,7±4,3
CD20 4 15,0 33,3 25,3±3,8
CD19CD5 13 1,9 54,0 15,1±4,1
CD4 14 25,7 66,0 39,3±2,8
CD8 14 41,2 67,6 50,5±2,4
CD4/CD8 14 0,5 1,6 0,8±0,1
CD3CD38 11 15,5 89,3 66,0±7,3
CD3CD56 13 0,9 69,1 12,6±5,5
CD3HLADR 13 1,8 27,8 12,2±1,9
CD3CD57 11 2,2 55,0 16,9±5,6
CD3CD28 11 0,6 94,8 60,5±9,8
CD8CD38 10 9,4 47,1 34,6±3,7
CD8HLADR 11 0,5 14,7 8,9±1,4
CD8CD57 10 0 44,0 11,6±5,0
CD8CD28 11 0,2 41,1 24,6±4,5
HLADR 3 17,2 52,4 37,8±10,6
нии клеточности костного мозга можно отметить, что у детей контрольной группы пунктаты были нормоклеточными (у 8; 53,1%) и среднеклеточными (у 7; 46,9%), снижения и повышения клеточности не отмечено. Более чем у половины больных рабдомиосаркомой пунктаты были нормоклеточными (у 10; 62,2%), среднеклеточными и со сниженной клеточностью — у равного числа больных (по 3; по 18,9%); повышения клеточности не отмечено. У больных СЮ в основном были нормоклеточные (у 9; 55,9%) и среднеклеточные (у 3; 18,9%) пунктаты; снижение клеточности отмечено у 3 (18,9%), а повышение — у 1 (6,3%) больного.
При сравнении миелограмм больных рабдомиосаркомой и СЮ с нормой по А.И. Воробьёву выявлено, что средние значения процентного содержания гранулоцитарного и эритроидного ростков, индекса созревания нейтрофилов, лимфоцитов по данным двух методов подсчета (морфологического и цитометрического) находятся в пределах принятых в настоящее время норм. Однако можно отметить низкое минимальное количество эритроидного ростка (2,4%), сниженное минимальное количество гранулоцитарного ростка (35,2%), повышенный процент лимфоцитов при морфологическом подсчете (18,4%), а также высокое максимальное значение лейкоцитарно-эритроидного соотношения, то есть показателей, которые выходят за границы принятых норм и свидетельствуют о разбавлении нескольких пунктатов периферической кровью.
Важно отметить, что относительные и абсолютные количества лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и больных СЮ, подсчитанные морфологически и цитометрически, не отличались от показателей контрольной группы (p>0,05).
Мы проанализировали относительное содержание субпопуляции лимфоцитов (Т клеток, В лимфоцитов, NK клеток) костного мозга больных рабдомиосаркомой и СЮ. При сравнении количества Т-клеточных субпопуляций больных рабдомиосаркомой с данными контрольной группы выявлено достоверное повышение CD3+ Т лимфоцитов с признаками активации (CD3HLADR+), р=0,001, в частности активированных ЦТЛ (CD8HLADR+), р=0,004, а также TCRy6+ клеток (р=0,007). Но абсолютные количества данных субпопуляций костного мозга больных саркомой не отличались от показателей контрольной группы (p>0,05). Среди субпопуляций костного мозга больных саркомой было достоверно снижен процент Т хелперов с молекулой адгезии CD62L (Leu8), (р=0,015), но абсолютное количество данной субпопуляции не отличалось от контрольного значения (р=0,383) (табл. 2).
При сравнении процентного количества лимфоцитов костного мозга больных СЮ с данными контрольной группы также были обнаружены достоверные различия в содержании Т-клеточных субпопуляций. Существенно снижено процентное содержание Т хелперов (р=0,011), а содержание ЦТЛ, напротив, повышено (р=0,000). Это отразилось в снижении иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 (p=0,002), что свидетельствует о двукратном преобладании субпопуляции ЦТЛ над Т хелпе-рами в костном мозге больных СЮ. Абсолютные количества данных субпопуляций достоверно не отличаются от показателей контрольной группы (p>0,05). У больных СЮ достоверно снижены относительные и абсолютные количества лимфоцитов, имеющих молекулу адгезии Leu8, в частности Т хелперы (p<0,05) (табл. 3).
При сравнении CD3-позитивных субпопуляций Т лимфоцитов больных СЮ и контрольной группы выявлено достоверное повышение активированных Т лимфоцитов (CD3+HLADR+) и CD3+CD57+ клеток (p<0,05); сравнение абсолютного количества с контрольными достоверных отличий не выявило (p>0,05). Относительное и абсолютное содержание CD3+ Т лимфоцитов с костимуляторной молекулой CD28+ у данной группы больных было достоверно ниже, чем в контрольной (p<0,05).
Сравнение процентного и абсолютного содержания субпопуляций цитотоксических Т лимфоцитов костного мозга больных СЮ выявило достоверное повышение активированных Т киллеров CD8+HLADR+ (p<0,05). Повышение CD57-позитивных клеток (р=0,028) и CD38-позитивных ЦТЛ (р=0,004) было только в относительных значениях, абсолютные количества не отличались от контрольных (p>0,05).
95
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
96
Таблица 2. Сравнение относительного и абсолютного количества субпопуляций костного мозга больных рабдомиосаркомой и контрольной группы
Субпопуляция Количество Контрольная группа Больные рабдомиосаркомой Р
CD3HLADR+ Отн. 12,2±1,9 (n=13) 37,1±6,3 (n=14) 0,001
Абс. 2,7±0,7 (n=11) 3,6±0,7 (n=10) 0,386
CD8HLADR Отн. 8,9±1,4 (n=11) 28,7±6,1 (n=10) 0,004
Абс. 1,8±0,4 (n=10) 2,3±0,5 (n=9) 0,456
Leu8CD4 Отн. 33,5±4,7 (n=10) 17,6±3,6 (n=10) 0,015
Абс. 5,3±1,1 (n=10) 3,6±1,6 (n=9) 0,383
TCR76+ Отн. 9,2±1,4 (n=11) 15,8±1,6 (n=11) 0,007
Абс. 1,7±0,5 (n=10) 2,2±0,5 (n=10) 0,634
При сравнении субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и СЮ выявлены достоверные различия. Относительное и абсолютное количество субпопуляции Т хелпе-ров у больных данных групп практически не различалось (р<0,05). Процент ЦТЛ (CD8+ Т клеток) у больных рабдомиосаркомой достоверно выше, чем у больных СЮ (р=0,001), абсолютные количества ЦТЛ костного мозга у данных групп больных не различались (р=0,644). За счет повышения процентного содержания субпопуляции ЦТЛ иммунорегуляторный индекс костного мозга больных
СЮ (0,4±0,1) достоверно снижен по сравнению с иммунорегуляторным индексом костного мозга больных рабдомиосаркомой (р=0,036) и свидетельствует о двукратном преобладании процента CD8+ Т клеток над CD4+ Т клетками. Среди костномозговых субпопуляций лимфоцитов больных сравниваемых групп процент СD3+ Т клеток с молекулой CD57+, в частности ЦТЛ, не отличался (p>0,05). Абсолютные количества CD3+CD57+ и CD8+CD57+ Т лимфоцитов были достоверно выше у больных СЮ, (p<0,05). Процент убТ клеток у больных рабдомиосаркомой был достоверно выше, чем
Таблица 3. Сравнение относительного и абсолютного количества субпопуляций эффекторных Т клеток костного мозга больных саркомой Юинга с данными контрольной группы
Субпопуляция Количество Контрольная группа Больные саркомой Юинга Р
CD4 Отн. 39,3±2,8 (n=14) 26,9±3,5 (n=16) 0,011
Абс. 6,7±1,2 (n=11) 4,1±1,5 (n=14) 0,224
CD8 Отн. 50,5±2,4 (n=14) 68,5±3,1 (n=16) 0,000
Абс. 9,9±2,4 (n=11) 9,3±2,0 (n=14) 0,864
CD4/CD8 0,8±0,1 (n=14) 0,4±0,1 (n=16) 0,002
Leu8 Отн. 66,3±6,5 (n=10) 36,0±7,4 (n=14) 0,008
Абс. 10,9±2,3 (n=10) 4,8±1,2 (n=13) 0,022
Leu8CD4 Отн. 33,5±4,7 (n=10) 13,7±2,4 (n=14) 0,001
Абс. 5,3±1,1 (n=10) 2,2±0,8 (n=13) 0,031
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
Таблица 4. Сравнение субпопуляций лимфоцитов-эффекторов костного мозга детей, больных рабдомиосаркомой и саркомой Юинга
Субпопуляция Количество Больные рабдомиосаркомой Больные саркомой Юинга р
CD8+ Отн. 50,5±4,0 (n=16) 68,5±3,1 (n=16) 0,001
Абс. 8,0±2,0 (n=11) 9,3±2,0 (n=14) 0,644
CD4+/CD8+ 0,7±0,1 (n=14) 0,4±0,1 (n=16) 0,036
CD8+CD57+ Отн. 12,2±6,2 (n=7) 25,8±3,7 (n=14) 0,060
Абс. 0,8±0,3 (n=6) 3,4±0,6 (n=13) 0,014
CD3+CD57+ Отн. 19,6±8,4 (n=8) 38,4±6,4 (n=13) 0,091
Абс. 1,2±0,3 (n=7) 4,5±0,8 (n=13) 0,009
TCR76 Отн. 15,8±1,6 (n=11) 10,0±1,2 (n=11) 0,010
Абс. 2,2±0,5 (n=10) 1,4±0,2 (n=11) 0,170
у больных СЮ (р=0,010), но сравнение абсолютных количеств данной субпопуляции различий не выявило (р=0,170) (табл. 4).
Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных острыми лейкозами
По данным морфологического подсчета, процент лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ был достоверно ниже контрольного значения (р=0,000), но абсолютное количество лимфоцитов не было снижено (р=0,067). По результатам цитометрического подсчета процент лимфоцитарных популяций костного мозга больных ОМЛ и контрольной группы не различался (р=0,454), но абсолютное количество лимфоцитов больных ОМЛ было снижено (р=0,010). По сравнению с контрольной группой у больных ОМЛ достоверно снижен процент CD3+HLADR+ Т клеток, Т хелперов и ЦТЛ (p<0,05) без изменения иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 (р>0,05), что свидетельствует о равном угнетении двух основных эффекторных субпопуляций. Но только субпопуляция Т хелперов костного мозга больных ОМЛ была снижена также и в абсолютном значении (р=0,032). У больных ОМЛ значительно снижено относительное содержание всей В-лимфоцитарной субпопуляции и CD19+CD5+ клеток (р<0,05), абсолютные количества данных субпопуляций не отличались от контрольных (p>0,05) (табл. 5).
Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ
Относительное количество лимфоцитарной популяции костного мозга больных ОЛЛ, подсчитанное морфологически, было достоверно ниже по сравнению с контрольной группой (р=0,000). Но по
результатам цитометрического подсчета процент лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ не отличался от процента лимфоцитов детей контрольной группы (р=0,658). Сравнение абсолютных количеств лимфоцитарных популяций больных ОЛЛ и контрольной группы, подсчитанных по морфологическим и цитометрическим данным, достоверных различий не выявило (р>0,05).
При сравнении относительного количества лимфоцитарных субпопуляций костного мозга больных ОЛЛ с данными контрольной группы нами были выявлено снижение числа Т клеток-эффекторов (Т хелперов и ЦТЛ; р<0,05) без изменения иммунорегуляторного индекса (р=0,371), что свидетельствует об угнетении субпопуляций в равной степени. Абсолютные количества Т хелперов и ЦТЛ костного мозга больных ОЛЛ не отличались от контрольных значений (p>0,05). Относительное содержание CD5-позитивных Т лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ, напротив, было повышено (p=0,023), а абсолютное количество данной субпопуляции не отличалось от контрольного значения (р=0,669). Процент CD19+ В лимфоцитов костного мозга больных ОЛЛ не отличался от контрольного значения (р=0,098), но абсолютное содержание В клеток было достоверно ниже (р=0,037). CD19+CD5+ субпопуляция В лимфоцитов в костном мозге больных ОЛЛ была достоверно снижена в относительном (р=0,002) и абсолютном (р=0,002) значении (табл. 6).
Сравнение относительного содержания
лимфоцитарных субпопуляций костного
мозга больных ОМЛ и ОЛЛ
Сравнение относительного и абсолютного содержания лимфоцитарной популяции костного мозга
97
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
98
Таблица 5. Сравнение относительного и абсолютного количества лимфоцитарных субпопуляций костного мозга больных острым миелоидным лейкозом (ОМЛ) и контрольной группы
Субпопуляция Количество Контрольная группа Больные ОМЛ Р
CD3+HLADR+ Отн. 12,2±1,9 (n=13) 6,5±1,6 (n=13) 0,034
Абс. 2,7±0,7 (n=11) 0,9±0,5 (n=7) 0,066
CD5+ Отн. 55,0±6,5 (n=14) 70,2±4,0 (n=25) 0,005
Абс. 10,0±1,8 (n=10) 10,9±1,6 (n=5) 0,717
CD4 Отн. 39,3±2,8 (n=14) 30,8±3,4 (n=17) 0,028
Абс. 6,7±1,2 (n=11) 1,7±0,5 (n=4) 0,032
CD8 Отн. 50,5±2,4 (n=14) 32,4±3,4 (n=17) 0,001
Абс. 9,9±2,4 (n=11) 4,6±1,3 (n=2) 0,101
CD4/CD8 0,8±0,1 (n=14) 1,0±0,2 (n=17) 0,307
CD19 Отн. 26,7±4,3 (n=15) 12,8±1,9 (n=26) 0,002
Абс. 5,6±2,1 (n=11) 1,6±0,4 (n=5) 0,098
CD19+CD5+ Отн. 15,1±4,1 (n=13) 2,2±0,6 (n=25) 0,000
Абс. 3,2±1,2 (n=10) 0,3±0,1 (n=5) 0,066
больных ОМЛ и ОЛЛ выявило, что процент лимфоцитов, подсчитанный морфологически, был достоверно выше у больных ОМЛ (р=0,001). Абсолютные количества лимфоцитов больных ОМЛ и ОЛЛ по данным морфологического подсчета достоверно не различались (р=0,540). По результатам цитометри-
ческого подсчета лимфоцитарных популяций двух групп больных ОЛ не обнаружено достоверных различий при сравнении относительного и абсолютного содержания лимфоцитов (р>0,05).
Сравнение относительного и абсолютного количества лимфоцитарных субпопуляций костного
Таблица 6. Сравнение относительного и абсолютного содержания лимфоцитарных субпопуляций костного мозга больных острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ) с данными контрольной группы
Субпопуляция Количество Контрольная группа Больные ОЛЛ Р
CD4 Отн. 39,3±2,8 (n=14) 29,9±1,7 (n=15) 0,008
Абс. 6,7±1,2 (n=11) 4,7±1,1 (n=15) 0,228
CD8 Отн. 50,5±2,4 (n=14) 34,2±2,1 (n=15) 0,000
Абс. 9,9±2,4 (n=11) 5,5±1,3 (n=15) 0,104
CD4/CD8 0,8±0,1 (n=14) 1,0±0,1 (n=15) 0,371
CD5+ Отн. 55,0±6,5 (n=14) 70,2±2,0 (n=27) 0,023
Абс. 10,0±1,8 (n=10) 8,6±1,9 (n=26) 0,669
CD19+ Отн. 26,7±4,3 (n=15) 19,5±2,1 (n=27) 0,098
Абс. 5,6±2,1 (n=11) 2,1±0,6 (n=26) 0,037
CD19+CD5+ Отн. 15,1±4,1 (n=13) 4,7±0,8 (n=27) 0,002
Абс. 3,2±1,2 (n=10) 0,5±0,1 (n=26) 0,002
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
Таблица 7. Сравнение относительного и абсолютного количества лимфоцитарных субпопуляций костного мозга больных острым миелоидным (ОМЛ) и острым лимфобластным (ОЛЛ) лейкозом
Субпопуляция Количество Больные ОМЛ Больные ОЛЛ р
CD19+ Отн. 13,4±1,8 (n=26) 19,5±2,1 (n=27) 0,033
Абс. 1,2±0,3 (n=8) 2,1±0,6 (n=26) 0,396
CD19+CD5+ Отн. 2,2±0,5 (n=25) 4,7±0,8 (n=27) 0,016
Абс. 0,2±0,l (n=7) 0,5±0,1 (n=26) 0,282
мозга пациентов данных нозологических групп выявило различие только в относительных количествах В клеток. У больных ОЛЛ достоверно выше процентное содержание CD19+ В клеток (р=0,033) и CD19+CD5+ В клеток (р=0,016) по сравнению с больными ОМЛ. Абсолютные количества В-клеточных субпопуляций костного мозга больных ОМЛ и ОЛЛ не различались (р>0,05) (табл. 7).
Сравнительная характеристика субпопуляций лимфоцитов костного мозга детей, больных острыми лейкозами, рабдомиосаркомой и СЮ
С целью оценки сходства/различий количественного изменения иммунного статуса костного мозга детей, больных острыми лейкозами, рабдомиосаркомой и саркомой Юинга, мы сравнили процентное содержание лимфоцитарных субпопуляций с данными контрольной группы.
Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и больных ОМЛ
Сравнение процентного содержания лимфоцитарных субпопуляций больных данных нозологических групп выявило достоверные различия. CD3+
Т клетки с маркером активации HLADR были достоверно выше у больных рабдомиосаркомой как в относительном (р=0,000), так и в абсолютном значении (р=0,013). Относительные и абсолютные количества Т хелперов у больных рабдомиосаркомой и ОМЛ не различались (р>0,05). У больных ОМЛ по сравнению с больными рабдомиосаркомой достоверно ниже процент ЦТЛ (р=0,005), но сравнение абсолютных значений CD8+ Т клеток у больных данных групп различий не выявило (р=0,139). Снижение процента CD8+ Т клеток у больных ОМЛ привело к достоверному повышению иммунорегуляторного индекса CD4/ CD8 (р=0,002), что свидетельствует о равном содержании Т хелперов и ЦТЛ в костном мозге больных ОМЛ. Процентное содержание CD19+ и CD19+CD5+ В лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ было достоверно меньше по сравнению с больными рабдомиосаркомой (p<0,05), но абсолютные значения данных субпопуляций в сравниваемых группах больных не различались (р>0,05) (табл. 8).
Сравнение субпопуляций лимфоцитов
костного мозга больных
рабдомиосаркомой и ОЛЛ
При сравнении относительного и абсолютного содержания субпопуляций лимфоцитов костно-
Таблица 8. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ)
Субпопуляция Количество Больные рабдомиосаркомой Больные ОМЛ р
CD3+HLADR Отн. 37,1±6,3 (n=14) 6,0±1,6 (n=14) 0,000
Абс. 3,6±0,7 (n=10) 0,9±0,5 (n=7) 0,013
CD8+ Отн. 50,6±4,3 (n=15) 32,4±3,4 (n=17) 0,005
Абс. 7,8±2,0 (n=11) 2,5±1,3 (n=4) 0,139
CD4/CD8 0,4±0,1 (n=16) 1,0±0,2 (n=17) 0,002
CD19+ Отн. 23,3±4,7 (n=16) 12,8±1,9 (n=26) 0,029
Абс. 4,4±1,2 (n=12) 1,2±0,3 (n=8) 0,049
CD19+CD5+ Отн. 9,5±2,7 (n=12) 2,2±0,6 (n=41) 0,001
Абс. 5,0±3,5 (n=11) 0,2±0,1 (n=7) 0,307
99
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
100
го мозга больных данных групп мы обнаружили достоверные различия. Процент CD3+ Т клеток был выше у больных ОЛЛ (р=0,024), а процент CD3+ Т клеток с маркером HLADR, напротив, был выше у больных рабдомиосаркомой (р=0,000); сравнение абсолютных количеств данных субпопуляций различий не выявило (р>0,05). Процент CDS-позитивных Т лимфоцитов был достоверно выше у больных ОЛЛ (р=0,000), абсолютные количества клеток данной субпопуляции у больных ОЛЛ и рабдомиосаркомой не различались (р=0,670). Относительное содержание ЦТЛ в костном мозге больных ОЛЛ достоверно ниже, чем у больных рабдомиосаркомой (р=0,002), различия в абсолютных количествах не выявлены (р=0,295), иммунорегуляторный индекс не различался (р=0,092). В костном мозге больных ОЛЛ достоверно ниже процентное содержание CD19+CD5+ В лимфоцитов по сравнению с больными рабдомиосаркомой (р=0,034), абсолютные количества данной субпопуляции не различаются (р=0,058) (табл. 9).
Сравнительная характеристика
субпопуляций лимфоцитов костного мозга
больных СЮ и больных ОМЛ
При сравнении лимфоцитарных субпопуляций костного мозга больных данных групп мы выявили ряд достоверных различий. Относительное и абсолютное количество CD3+ Т клеток с маркером HLADR было достоверно выше у больных СЮ (р=0,000 и р=0,020, соответственно), чем у больных ОМЛ. Процент CD5+ Т клеток достоверно выше в костном мозге больных ОМЛ (р=0,000), но абсо-
лютные количества не различались (р=0,539). Относительное количество ЦТЛ (CD8+ Т клеток) достоверно выше в костном мозге больных СЮ (р=0,000), но абсолютные количества достоверно не различались (р=0,098). Относительное и абсолютное содержание Т хелперов (CD4+ Т клеток) в костном мозге больных ОМЛ и СЮ достоверно не различалось (р>0,05). Иммунорегуляторный индекс CD4/CD8 достоверно выше в костном мозге больных ОМЛ (р=0,002), что свидетельствует о равном содержании Т хелперов и ЦТЛ у данной группы пациентов. Процент CD19-позитивных В лимфоцитов был достоверно ниже у больных ОМЛ (р=0,022), чем у больных СЮ, но сравнение абсолютных количеств не выявило достоверных различий (р=0,158). Содержание CD19+CD5+ В клеток было достоверно меньше у больных ОМЛ как в относительном (р=0,000), так и в абсолютном значении (р=0,044) (табл. 10).
Сравнительная характеристика
субпопуляций лимфоцитов костного мозга
больных СЮ и ОЛЛ
При сравнении процентного содержания Т клеток, В лимфоцитов костного мозга больных данных групп выявлены достоверные различия. Количество CD3+ и CD5+ Т клеток было выше у больных ОЛЛ (р<0,05), сравнение абсолютных количеств данных субпопуляций в группах больных достоверных различий не выявило (р>0,05). Содержание CD3+ Т клеток с маркером HLADR у больных ОЛЛ, напротив, было ниже и в относительном, и в абсолютном значении (р<0,050). Среди клеток-эффекторов относительное и абсолютное
Таблица 9. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных рабдомиосаркомой и острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ)
Субпопуляция Количество Больные рабдомиосаркомой Больные ОЛЛ р
CD3+ Отн. 59,2±4,8 (n=16) 65,9±2,7 (n=26) 0,024
Абс. 9,1±2,4 (n=12) 8,4±2,0 (n=25) 0,921
CD3+HLADR Отн. 37,1±6,3 (n=14) 10,7±3,1 (n=21) 0,000
Абс. 3,6±0,7 (n=10) 1,5±0,8 (n=20) 0,102
CD5+ Отн. 62,1±5,9 (n=13) 70,2±2,0 (n=27) 0,000
Абс. 9,1±2,3 (n=12) 8,6±1,9 (n=26) 0,670
CD8 Отн. 50,6±4,3 (n=15) 34,2±2,1 (n=15) 0,002
Абс. 8,0±2,0 (n=15) 5,5±1,3 (n=15) 0,295
CD4/CD8 0,7±0,1 (n=14) 1,0±0,1 (n=15) 0,092
CD19+CD5+ Отн. 9,5±2,7 (n=12) 4,7±0,8 (n=27) 0,034
Абс. 5,0±3,5 (n=10) 1,5±0,8 (n=20) 0,058
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
Таблица 10. Сравнение субпопуляций лимфоцитов костного мозга больных саркомой Юинга и острым миелоидным лейкозом (ОМЛ)
Субпопуляция Количество Больные саркомой Юинга Больные ОМЛ Р
CD3+HLADR Отн. 37,5±6,3 (n=15) 6,5±1,6 (n=13) 0,000
Абс. 4,9±1,1 (n=14) 0,9±0,5 (n=7) 0,020
CD5+ Отн. 48,7±4,7 (n=14) 73,2±2,7 (n=25) 0,000
Абс. 7,3±1,8 (n=13) 9,0±1,8 (n=7) 0,539
CD8 Отн. 68,5±3,1 (n=16) 35,5±2,9 (n=17) 0,000
Абс. 9,3±2,0 (n=14) 2,5±1,3 (n=4) 0,098
CD4/CD8 0,4±0,1 (n=16) 1,0±0,1 (n=16) 0,002
CD19+ Отн. 21,8±3,5 (n=16) 13,4±1,8 (n=26) 0,022
Абс. 3,3±1,0 (n=14) 1,2±0,3 (n=8) 0,158
CD19+CD5+ Отн. 13,2±2,4 (n=14) 2,2±0,5 (n=25) 0,000
Абс. 1,9±0,6 (n=13) 0,2±0,1 (n=7) 0,044
содержание Т хелперов достоверно не различалось (р>0,050). Процентное содержание ЦТЛ достоверно выше у больных СЮ (р=0,000), что отразилось в повышении иммунорегуляторного индекса CD4/CD8 у больных ОЛЛ до 1,0±0,1 (р=0,000), свидетельствующем о равном содержании Т хелперов и ЦТЛ. Абсолютные количества ЦТЛ костного мозга у данных групп больных не различались (р=0,119). Относительное и абсолютное количество CD19+ В лимфоцитов костного мозга больных данных нозологических групп достоверно не различалось (р>0,05), за исключением CD19+CD5+ субпопуляции, относительное и абсолютное количество которой у больных ОЛЛ было достоверно ниже (р=0,000 и р=0,003, соответственно) (табл. 11).
ОБСУЖДЕНИЕ
Приведенные иммунологические исследования выявили ряд характерных особенностей, отличающих субпопуляционный состав лимфоцитов костного мозга детей, больных острыми лейкозами и мелкокруглоклеточными саркомами, от субпопуляционного состава лимфоцитов костного мозга детей, не имеющих онкологической патологии. Из числа клеток костного мозга как кандидаты на роль эффекторов противоопухолевого иммунитета рассматриваются в первую очередь NK клетки, моноциты/макрофаги и Т-цитотоксические лимфоциты. Противоопухолевый иммунитет связан
с формированием клона антигенспецифических Т-эффекторов — ЦТЛ, способных распознавать и осуществлять реакции киллинга против опухолевых клеток, несущих на своей поверхности определенный пептид туморассоциированных антигенов в главном комплексе гистосовместимости I (Major Histocompatibility Complex, МНС). ЦТЛ развивают киллинг только в случае достаточно высокой экспрессии молекул МНС на поверхности клетки. NK клетки, напротив, высокоэффективны в отношении молекул, лишенных МНС I, так как имеют кил-лерингибирующие рецепторы KIR, активирующие цитотоксические реакции в случае снижения или отсутствия экспрессии МНС. Важная роль в противоопухолевом иммунитете отводится у$Т лимфоцитам, которые распознают не процессированные пептидные антигены в отличие от арТ клеток, а различные МНС-подобные стрессиндуцированные аутоантигены, экспрессируемые злокачественными клетками, то есть при помощи менее специфических механизмов, не требующих первичной презентации антигена или прайминга [ 8].
В нашей работе выявлено достоверное снижение процента лимфоцитов костного мозга больных ОМЛ (при морфологическом подсчете) в сравнении с данными контрольной группы, что может свидетельствовать об угнетении лимфоцитарной популяции пролиферирующим лейкемическим клоном, развитии опухолевыми клетками «контратаки»
101
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
102
Таблица 11. Сравнение процентного содержания субпопуляций костного мозга больных саркомой Юинга и острым лимфобластным лейкозом (ОЛЛ)
Субпопуляция Количество Больные саркомой Юинга Больные ОЛЛ Р
CD3+ Отн. 54,3±4,6 (n=16) 65,9±2,7 (n=26) 0,024
Абс. 8,1±2,2 (n=14) 8,4±2,0 (n=25) 0,921
CD3+HLADR Отн. 37,5±6,3 (n=15) 10,7±3,1 (n=21) 0,000
Абс. 4,9±1,1 (n=14) 1,5±0,8 (n=20) 0,014
CD5+ Отн. 48,7±4,7 (n=14) 70,2±2,0 (n=27) 0,000
Абс. 7,3±1,8 (n=13) 8,6±1,9 (n=26) 0,670
CD8 Отн. 68,5±3,1 (n=16) 34,2±2,1 (n=15) 0,000
Абс. 9,3±2,0 (n=14) 5,5±1,3 (n=15) 0,119
CD4/CD8 0,4±0,1 (n=16) 1,0±0,1 (n=15) 0,001
CD19+CD5+ Отн. 13,2±2,4 (n=14) 4,7±0,8 (n=27) 0,000
Абс. 1,9±0,6 (n=13) 0,5±0,1 (n=26) 0,003
против лимфоцитов [10]. Абсолютное количество лимфоцитов костного мозга детей данной нозологической группы, полученное при морфологическом подсчете, не отличалось от показателя контрольной группы, а полученное по данным цитометрического подсчета было достоверно выше. Эти результаты можно объяснить клоновой пролиферацией лимфоцитов-эффекторов после распознавания антигенов и активации. У больных ОЛЛ процентное содержание лимфоцитов костного мозга (морфологический подсчет) было достоверно снижено, что также свидетельствует об угнетении лимфоцитарного ростка лейкемическим клоном, а абсолютное количество, подсчитанное двумя методами, не отличалось от контрольного значения, что также объясняется кло-новой пролиферацией лимфоцитов-эффекторов. Сравнение процента лимфоцитов костного мозга двух групп больных ОЛ выявило, что лимфоцитарный росток в большей степени был угнетен в случае ОЛЛ (по данным морфологического подсчета). По цитометрическим данным различий в относительном и абсолютном содержании лимфоцитов костного мозга у больных ОЛ нет.
При сравнении уровня клеток-эффекторов костного мозга больных ОЛ с контрольной группой выявлены сходные изменения субпопуляционного состава, характерные для обоих вариантов ОЛ, что может свидетельствовать о наличии общих механизмов угнетения лимфоцитов-эффекторов бласт-
ной популяцией при детских лейкозах, о равной степени активационно-индуцированного апоптоза [10]. Выявлены также отличия, уникальные для каждого варианта ОЛ, которые могут быть следствием различий в биологических свойствах бласт-ных клеток.
В группе детей, больных ОМЛ, достоверно снижены относительные количества Т хелперов и ЦТЛ по сравнению с данными контрольной группы, но при сравнении абсолютных значений CD4+ и CD8+ субпопуляций лимфоцитов с контрольной группой была достоверно снижена только субпопуляция Т хелперов, что может свидетельствовать о более выраженном цитотоксическом воздействии мие-лобластов на CD4+ Т клетки и подавлении ими клоновой пролиферации [11].
У детей, больных ОЛЛ, также было достоверно снижено относительное содержание клеток-эффекторов (Т хелперов и ЦТЛ), но абсолютные количества не отличались от контрольных значений. Как при ОМЛ, так и при ОЛЛ не отмечено снижения относительного и абсолютного количества CD3+ Т клеток по сравнению с контролем, но только при ОМЛ был достоверно ниже процент HLADR-позитивных CD3+ Т клеток. Это наблюдение может свидетельствовать о большей цитотоксичности миелобластов в отношении Т клеток (в частности, Т хелперов) костного мозга, что подтверждается литературными данными [11].
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
При обоих вариантах ОЛ у детей отмечено достоверное повышение процента CD5+ Т лимфоцитов, что может говорить об аналогичных механизмах антигенной стимуляции и пролиферации Т лимфоцитов в ответ на развитие лейкозного клона. Но абсолютные количества CD5+ Т клеток больных ОЛ не отличались от контрольных значений, что может свидетельствовать об активационно-индуцированном апоптозе этой части Т-клеточной субпопуляции. У больных ОМЛ и ОЛЛ иммунорегуляторный индекс CD4/CD8 не отличался от контрольного значения, что свидетельствует об угнетении субпопуляций Т хелперов и ЦТЛ в равной степени. Также при обоих вариантах ОЛ был достоверно снижен, по сравнению с контрольной группой, процент CD19+ и CD19+CD5+ В лимфоцитов, но только у больных ОЛЛ содержание данных субпопуляций было снижено в абсолютном значении. Данный результат может свидетельствовать о существенном цитотоксическом воздействии бластной популяции на В лимфоциты и их апоптозе, более выраженном при ОЛЛ.
Интересно отметить, что в отличие от ОМЛ и ОЛЛ у взрослых, между которыми были выявлены достоверные различия в процентах Т хелперов и ЦТЛ [14], ОМЛ и ОЛЛ в детской популяции не различаются по относительному и абсолютному содержанию клеток-эффекторов, а только лишь по относительному содержанию CD19+ и CD19+CD5+ В лимфоцитов, которые были достоверно ниже в случае ОМЛ. Абсолютные количества В-клеточных субпопуляций костного мозга детей, больных ОМЛ и ОЛЛ, не различались. Полученные нами результаты можно объяснить биологической особенностью ОЛ у детей по сравнению с ОЛ у взрослых, аналогичными механизмами цитотоксического воздействия миелобла-стов и лимфобластов при детских лейкозах на Т лимфоциты костного мозга, развитием опухолевой контратаки и Fas-индуцированного апоптоза, которые могут быть в большей степени выражены при ОМЛ у детей [12], что подтверждается худшим прогнозом данного варианта лейкоза по сравнению с ОЛЛ.
Сравнение субпопуляционного состава костного мозга детей, больных саркомами, с данными контрольной группы выявило достоверные различия, как уникальные для каждого вида сарком, так и характерные для обоих видов. Так, в группе больных рабдомиосаркомой достоверно выше процент убТ лимфоцитов. Этот результат может свидетельствовать о большей иммуногенности клеток рабдомиосаркомы в отношении убТ клеток, активирующихся неклассическим путем без первичной презентации антигена при распознавании молекул, родственных антигенам I класса HLA (MICA и MICB), а также UL-16-связывающих белков 1-3 (ULBP1-3). Абсолютное содержание убТ клеток не отличалось от контрольного значения. Очевидно, что одновременно с процессами
распознавания антигена и активации убТ клеток происходит процесс активационно-индуцированного апоптоза и подавление их клоновой пролиферации.
По сравнению с данными контрольной группы субпопуляционный состав костного мозга больных СЮ характеризуется повышением процента CD3+HLADR+ Т клеток, процента CD8+ ЦТЛ как с молекулами активации HLADR+ и CD38+, так и без них, и особых субпопуляций CD3+CD57+ и CD8+CD57+. CD57 маркер Т лимфоцитов связан с их функциональным старением, и нарастание данной субпопуляции при ряде опухолей ассоциируется с плохим прогнозом. Важно отметить, что у больных СЮ снижено относительное содержание Т хелперов, вследствие чего снижен иммунорегуляторный индекс CD4/CD8, свидетельствующий о дисбалансе в соотношении клеток-эффекторов. Абсолютное количество CD4+ Т клеток не отличалось от контрольного, что можно объяснить компенсаторной пролиферацией пула Т хелперов.
Может иметь существенное клиническое и прогностическое значение при СЮ снижение пула CD3+CD28+ Т клеток в относительных и абсолютных значениях. Молекула CD28 является функционально важной, и, как известно, полная активация Т лимфоцита достигается при получении костимуляторного сигнала при взаимодействии CD28 c B7 лигандом. Снижение экспрессии CD28 молекулы на Т лимфоцитах может свидетельствовать об их активационно-индуцированной анергии и нарушении ^-опосредованных реакций клеточного иммунитета у больных СЮ.
Для рабдомиосаркомы и СЮ сходными изменениями в субпопуляционном составе костного мозга было повышение процента HLADR+ Т клеток, в частности ЦТЛ, но только в случае СЮ было отмечено также и абсолютное повышение ЦТЛ, что может отражать более выраженный пролиферативный ответ при распознавании антигенов опухолевых клеток и/или менее выраженный активационно-индуцированный апоптоз при данном заболевании.
Наряду с этим для субпопуляционного состава костного мозга больных рабдомиосаркомой и СЮ характерно снижение в равной степени процента Т хелперов с молекулой адгезии Leu8, достоверного различия между их количествами нет (p>0,05). Но только у больных СЮ было отмечено абсолютное снижение Leu8CD4+ Т клеток, а также относительное и абсолютное снижение всех Leu8+ Т клеток, следствием чего может быть снижение поступления Т хелперов в патологический очаг при данном заболевании и нарушение функций Т-клеточного звена противоопухолевого иммунитета в целом.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
По результатам проведенной работы выявлены различия в содержании клеток-эффекторов кост-
103
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
104
ного мозга, характерные для острых лейкозов и мелкокруглоклеточных сарком. При ОЛ в большей степени был снижен процент ЦТЛ, чем при саркомах, максимальное относительное содержание CD8+ Т клеток было в костном мозге больных рабдомиосаркомой. Иммунорегуляторный индекс у больных ОЛ был повышен до 1,0 и свидетельствовал об имеющемся дисбалансе в содержании клеток-эффекторов, что проявилось в равном содержании Т хелперов и ЦТЛ. При саркомах, напротив, отмечалось снижение иммунорегуляторного индекса до 0,4, что означает двукратное преобладание CD8+ Т клеток над CD4+ Т клетками. Сравнение абсолютных величин субпопуляции ЦТЛ всех нозологических групп различий не выявило, что может свидетельствовать о большем пролиферативном ответе данной субпопуляции при ОЛ, чем при саркомах. Содержание Т хелпе-ров во всех четырех группах больных достоверно не различалось между собой в относительных и абсолютных числах. Это может означать, что субпопуляция CD4+ Т клеток была угнетена опухолевым воздействием примерно в равной степени, поскольку была снижена по сравнению с контролем. Наряду с этим возможен умеренный пролиферативный ответ Т хелперов при распознавании опухолевых антигенов, выраженный в равной степени у всех больных.
При анализе субпопуляционного состава костномозговых лимфоцитов больных мелкокруглоклеточными саркомами не отмечено угнетения В-клеточных субпопуляций в отличие от боль-
ных ОЛ, у которых было достоверно снижено процентное и абсолютное содержание CD19+ и CD19CD5+ клеток, более всего — при ОМЛ. Мы можем предполагать, что клетки мелкокруглоклеточных сарком не оказывают цитотоксического воздействия на В лимфоциты в отличие от бластных клеток. Также мы считаем, что в целом у больных ОЛ наблюдается угнетение клеточного иммунитета в большей степени, чем у больных мелкокруглоклеточными саркомами.
На основании проведенного нами комплексного морфоцитохимического и иммунологического (трехцветная проточная цитометрия) исследования у детей, больных ОЛ, рабдомиосаркомой и СЮ, установлено, что данные злокачественные заболевания характеризуются специфическими для каждой нозологической формы изменениями субпопуляционного состава Т и В лимфоцитов костного мозга при диагностике, что позволяет выявлять их клиническое и прогностическое значение, лучше понимать механизмы взаимодействия опухоли и иммунной системы и может быть полезным при разработке программ иммунотерапии.
ИСТОЧНИК ФИНАНСИРОВАНИЯ
Не указан.
КОНФЛИКТ ИНТЕРЕСОВ
Авторы данной статьи подтвердили отсутствие конфликта интересов, о котором необходимо сообщить.
ЛИТЕРАТУРА
1. Feuerer M, Beckhove P Garbi N, Mahnke Y Limmer A, Hommel M, Hammerling GJ, Kyewski B, Hamann A, Umansky V, Schirrmacher V. Bone marrow as a priming site for T-cell responses to blood-borne antigen. Nat Med. 2003Sep;9(9):1151-7.
2. Yotnda P Mintz P Grigoriadou K, Lemonnier F, Vilmer E, Langlade-Demoyen P Analysis of T-cell defects in the specific immune response against acute lymphoblastic leukemia cells. Exp Hematol. 1999;27:1375-1383.
3. Дейчман Г.И., Кашкина Л.М., Ключарева Т.Е., Матвеева В.А. и др. Влияние клеток костного мозга, селезенки и перитонеального экссудата на метастазирование опухолевых клеток в легкие сибирских хомячков. Бюл. эксперим. биологии и медицины. 1982;XCIV(10):102-105.
4. Трапезников Н.Н, Тупицын Н.Н., Барышников А.Ю. и др. Иммунопатогенетические аспекты саркомы Юинга. Вестн. онкологического научного центра им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва). 1998;1:41-49.
5. Madhumathi D, Premalata C, Devi V, et al. / Bone marrow involvement at presentation in pediatric non-
haematological small round cell tumours. Indian J Pathol Microbiol. 2007;50(4):886-889.
6. Cho D, Shook D, Shimasaki N, et al. Cytotoxicity of activated natural killer cells against pediatric solid tumours. Clin Cancer Res. 2010;16:3901-3909.
7. Fan Z, Yu P Wang Y, et al. NK-cell activation by LIGT triggers tumor-specific CD8+ T-cell immunity to reject established tumours. Blood. 2006;107(4):1342-1351.
8. Caccamo N, Dieli F, Meraviglia S, et al. Ty6 cell modulation in anticancer treatment. Cur Cancer Drug Targets. 2010;10:27-36.
9. Serrano D, Monteiro J, Allen S, et al. Clonal expansion within the CD4+CD57+ and CD8+CD57+ T cell subsets in chronic lymphocyte leukemia. J Immunol. 1997;158(3):1482-1489.
10. Buzyn A, Petit F, Ostankovitch M, Figueiredo S, Varet B, Guillet J-G, Ameisen J-C, Estaquier J. Menbrane-bound Fas (APO-1/CD95) ligand on leukemic cells: a mechanism of tumor immune escape in leukemia patients. Blood. 1999;94(9):3135-3140.
ОНКОПЕДИАТРИЯ / 2016 / том 3 / № 2
11. Buggins AGS, Arno MJ, Milojkovic D, et al. Characterization of an AML-derived immunomodulatory factor(s) that inhibit T cell activation and the signal transduction pathways involved. Blood. 2000;96:501a.
12. Колбацкая О.П., Тупицын Н.Н. Субпопуляции лимфоцитов костного мозга больных острыми лейкозами в период диагностики заболевания. Иммунология. 2012;33(2):77-82.
КОНТАКТНАЯ ИНФОРМАЦИЯ
Колбацкая Ольга Павловна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: helgaopk69@yandex.ru
Горбунова Татьяна Викторовна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник отделения опухолей головы и шеи НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: wasicsol@mail.ru
Поляков Владимир Георгиевич, доктор медицинских наук, профессор, академик РАН, заместитель директора, заведующий отделением опухолей головы и шеи НИИ ДОГ ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России, заведующий кафедрой детской онкологии ГБОУ ДПО РМАПО Минздрава России, главный внештатный детский специалист онколог Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: vgp-04@mail.ru
Тупицын Николай Николаевич, доктор медицинских наук, профессор, руководитель лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24, e-mail: nntca@yahoo.com
Серебрякова Ирина Николаевна, доктор медицинских наук, ведущий научный сотрудник лаборатории центрального клинико-лабораторного отдела НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России
Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24
Тимошенко Валентина Владимировна, кандидат медицинских наук, научный сотрудник лаборатории иммунологии гемопоэза НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24
Шведова Тамара Викторовна, биолог, группа гемоцитологии клинико-диагностической лаборатории центрального клинико-лабораторного отдела НИИ КО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» Минздрава России Адрес: 115478, Москва, Каширское ш., д. 24
105
