CC BY
59
безмиелиновыми волокнами. Первые изменения ультраструктуры лучезарного венца наблюдаются уже через 2 недели введения налбуфину экспериментальным животным и нарастают на протяжении следующих сроков эксперимента. Основными проявлениями нейропатии лучезарного венца конечного мозга при условиях 6-недельного введения налбуфину является деструктированость осевых цилиндров нервных волокон, глиальных клеток. В звеньях гемомикроциркуляторного русла лучезарного венца происходят морфологические изменения, характерные для микроангиопатии. Работа является основой для дальнейших исследований, морфологов и невропатологов относительно разработки в перспективе новых методов диагностики и профилактики патологии мозга, предопределенной длительным применением опиоида.
Ключевые слова: лучистый венец, ультраструктура, опиоид, эксперимент.
Стаття надшшла 4.09.2014 р.
formed by nonmyelinated fibers. The first changes in ultrastructure of the radiate crown are observe already after 2 weeks of injection of nalbufin to the experimental animals and keep growing throughout the following periods of the experiment. The main manifestations of neuropathy of the radiate crown of telencephalon after 6 weeks of injection of nalbufin is destructurization of the nerve fiber axons, glia cells. Morphological changes characteristic of microangiopathy take place in the links of hemomicrocirculatory bed of radiate crown. This work is the ground for further research of both, morphologists and neuropathologists in future development of the new methods of diagnosing and prevention of brain pathology associated with a long-term application of opioids.
Key words: radiate crown, ultrastructure, opioid, experiment.
Рецензент Масловський С.Ю.
УДК 616.127:611.127-018.1:612.67
СТРУКТУРНЫЕ ИЗМЕНЕНИЯ МИОКАРДА ПРИ МОДЕЛИРОВАНИИ КАРДИОМИОПАТИИ И ЕЕ КОРРЕКЦИИ С ПОМОЩЬЮ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК У
ЖИВОТНЫХ РАЗНОГО ВОЗРАСТА
Целью работы было изучить возрастные структурные и ультраструктурные изменения (световая и электронная микроскопия, морфометрия) и уровень апоптоза (ТЦЫЕЬ-метод) в миокарде мышей при моделировании кардиомиопатии (введение изопротеренола (ИП) в дозе 100 мг/кг, 5 дней) и ее коррекции с помощью трансплантации стволовых клеток - мононуклеарных клеток костного мозга (МККМ) мышей (5 млн.).
Введение ИП вызвало гипертрофию миокарда - соотношение Масса сердца/Масса тела (МС/МТ) значительно увеличивалось по сравнению с контролем и у молодых (33 %) и у старых (11 %); отмечалось утолщение кардиомиоцитов (КМЦ) и миоцитов стенки артериол. Кроме того, развивались фиброз и очаговые повреждения миокарда с дистрофическими и деструктивными изменениями КМЦ и капилляров, что было в большей мере выражено у старых животных. Трансплантация МККМ животным с ИП-индуцированной кардиомиопатией оказывала нормализующее влияние на структуру КМЦ и капилляров, что в большей степени было выражено у молодых животных. У них отмечалось снижение индекса МС/МТ почти до нормального показателя, меньшая выраженность дистрофических и некротических изменений в КМЦ, а также уменьшение объема очагов повреждения. Кроме того, отмечено снижение уровня апоптоза, преимущественно у молодых животных. Апоптотический индекс снижался у них почти вдвое, а у старых - изменялся незначительно.
Ключевые слова: кардиомиопатия, старение, терапия стволовыми клетками, морфометрия.
Работа является фрагментом НИР «Изучение возрастных структурных особенностей и механизмов клеточной гибели в разных органах при экспериментальной кардиомиопатии и ее коррекции» (№ ГР 0111и001485).
Сердечно-сосудичтые заболевания (ССЗ) являются основной причиной смертности во всём мире. Каждый год они приводят к смерти свыше 4 млн. человек в Европе и 1.9 млн. - в странах Евросоюза [7]. Однако если смертность от ССЗ в большинстве стран Европы в настоящее время несколько снижается, то в Украине этот показатель продолжает расти. Чаще всего ССЗ развиваются у людей старшего возраста. Количество мужчин с ССЗ увеличивается с 8 заболевших в возрасте 50-59 лет (на 1000 человек) до 66 заболевших в возрасте 80-89 лет. Аналогичные значения отмечены и для женщин (8 и 79 на 1000) [8]. Поэтому актуальными являются исследования, посвященные возрастным аспектам морфогенеза и лечения ССЗ, в частности кардиомиопатий (КМП). Под этим термином объединяют заболевания некоронароматоидного происхождения, различные по этиологии и патогенезу, но сходные по клиническому течению и морфологическим проявлениям.
Для моделирования КМП широко применяется изопротеренол (ИП) - агонист бета-адренорецепторов, вызывающий повреждение миокарда, связанное с фиброзом и гипертрофией кардиомиоцитов (КМЦ) [4, 6, 9]. Степень повреждения может быть увеличена путём повторных инъекций ИП [5]. Неотъемлемым звеном морфогенетических исследований миокарда при моделировании КМП является изучение клеточной гибели, в частности апоптоза как звена патогенеза ряда ССЗ [2]. Особое значение приобретает возрастной аспект этих исследований, поскольку при старении существенно меняется степень выраженности и распространенности процессов деструкции и
адаптации, клеточной гибели, а также уровень «неизменности» клеточных и тканевых структур, что отражается на характере течения возрастной патологии и возможных способах ее коррекции [1,2].
Для лечения ССЗ применяется широкий спектр лекарственных препаратов и немедикаментозных методов, в том числе и терапия стволовыми клетками (СК) [3]. Считается, что они способны реагировать на сигналы из пораженных тканей, мигрировать в очаг повреждения и дифференцироваться в специализированные клетки для компенсации нарушенных функций. Интенсивные исследования направлены на возможности клеточной терапии, замедляющей смерть КМЦ и способствующей восстановлению миокарда. Для оценки эффективности такого подхода к лечению кардиологической патологии следует определить не только структурные характеристики всех компонентов миокарда, но и степень угнетения апоптотической гибели клеток.
Целью работы была оценка возрастных структурных и ультраструктурных изменений миокарда, а также уровня апоптоза в нем, у мышей двух возрастных групп (молодые - 5 мес и старые - 25 мес) при моделировании кардиомиопатии (введение изопротеренола) и ее коррекции с помощью стволовых клеток.
Материал и методы исследования. Мышам линии СВА двух возрастных групп (5 и 25 мес) вводили подкожно ИП в дозе 100 мг/кг один раз в сутки на протяжении 5 дней. Через 2 недели после последнего введения ИП внутривенно трансплантировали 5 миллионов мононуклеарных клеток костного мозга (МККМ), полученных от 3-месячных мышей той же линии. Фракцию МККМ, содержащих гематопоэтические стволовые клетки, выделяли путем центрифугирования, отмывали и доводили до необходимой концентрации с помощью среды RPMI-1640 (Sigma, США). Трансплантацию клеток производили в хвостовую вену в объеме 100 мкл. Контрольным животным тех же возрастных групп вводили аналогичным образом среду RPMI-1640 в том же объеме. Исследования миокарда выполнены с применением световой, электронной микроскопии и морфометрии. Подсчитывали площадь соединительной ткани в очагах повреждения, количество малодифференцированных КМЦ, а также площадь эндотелиальных клеток (ЭК) и количество закрытых кровеносных капилляров в миокарде. Во всех экспериментальных группах вычисляли соотношение массы сердца к массе тела (МС/МТ).
Для выявления апоптоза применялся TUNEL - метод с использованием Apop Tag Plus Peroxidase in situ Apoptosis detection kit S 7101 фирмы Chemicon, США). Апоптотический индекс вычислялся по стандартной формуле. Статистический анализ проводился с помощью t-критерия Стьюдента.
Результаты исследования и их обсуждение. Проведенное исследование показало, что при введении ИП (через 4 недели после последней инъекции) происходило существенное увеличение соотношения Масса сердца/Масса тела (МС/МТ). У молодых животных этот показатель увеличивался на 33 % (р < 0,05) по сравнению с контрольными, а у старых - на 11 %. Увеличение массы сердца под влиянием ИП, более выраженное у молодых мышей, по сравнению со старыми, связано с разрастанием соединительной ткани на месте некротизированных КМЦ и гипертрофией оставшихся клеток, что подтверждено нашими гистологическими исследованиями. При моделировании КМП реакция соединительной ткани оказалась более демонстративной у молодых животных, чем у старых (рис. 1). У молодых она проявлялась в виде формирования крупных очагов молодой, грануляционной соединительной ткани, у старых - волокнистой соединительной ткани, преимущественно, развитием фиброза.
Применение ИП вызвало структурные изменения в миокарде, вполне адекватные кардиомиопатии. Оно приводило к развитию гипертрофии КМЦ и их ядер, а также миоцитов стенки артериол, более выраженной у молодых животных. Также происходило формирование очагов повреждения, преимущественно в стенке левого желудочка, что носило более выраженный характер у старых.
При моделировании КМП в очагах повреждения наблюдалось нарушение архитектоники миокарда и развитие деструктивных и дистрофических процессов (контрактура, вакуолизация, отек), вплоть до некробиоза и некроза клеток, с исходом в петрификацию и организацию. У старых животных степень повреждения оказалась большей, значительно чаще формировались очаги деструкции и кальцификации. На ультраструктурном уровне повреждающее действие ИП проявлялось дистрофическими и деструктивными нарушениями КМЦ - внутриклеточным отеком, контрактурными повреждениями миофибрилл, накоплением липофусцина в цитоплазме. У старых животных эти процессы были выражены в большей степени, чем у молодых, и приводили к более глубоким нарушениям миокарда.
После введения ИП количество TUNEL- позитивных ядер КМЦ возрастало у животных обеих возрастных групп. Апоптотический индекс возрастал у молодых животных более, чем в 10 раз, а у старых - приблизительно в 4 раза, тогда как у старых контрольных животных он почти вдвое превышал этот показатель у молодых (рис. 2 ). Согласно нашим предыдущим исследованиям, при экспериментальном сахарном диабете наибольшим апоптотическим изменениям подвергались ЭК капилляров миокарда [1]. При моделировании КМП более уязвимыми оказались КМЦ. На электронномикроскопическом уровне отмечены выраженные деструктивно-дистрофические изменения стенки гемокапилляров миокарда при моделировании КМП, более демонстративные у старых животных. Наряду с характерными возрастными перестройками, у них отмечался более выраженный очаговый отек цитоплазмы ЭК и более частое закрытие капилляров, в основном, вследствие набухания ядер ЭК (рис. 3). Результаты исследований указывают на существенную роль нарушений микроциркуляторного русла (МЦР) в патогенезе экспериментальной КМП, а также свидетельствуют о его большей повреждаемости у старых животных. Введение стволовых клеток животным с ИП-индуцированной КМП оказывает определенное нормализующее воздействие на миокард, что в большей степени проявляется у молодых. Если у молодых мышей с экспериментальной КМП такой показатель, как МС/МТ, увеличивался на 33 %, по сравнению с контрольными, что свидетельствует о развитии выраженной гипертрофии, то при введении МККМ - лишь на 11 %. У старых же это соотношение оставалось практически неизменным: при введении ИП оно увеличилось на 11%, а при последующей трансплантации МККМ - на 9 %.
У молодых животных при введении СК в меньшей степени выражены дистрофические и некротические изменения в КМЦ и усилены проявления репаративных процессов. Кроме того, в миокарде отмечается уменьшение объема очагов повреждения, а также снижение уровня апоптоза, преимущественно у молодых животных (см. рис. 2). Апоптотический индекс у них снижается почти вдвое, а у старых - не изменяется.
lililí^
контроль
изопротеренол изопротеренол+ск
J м^олодыхе
Рис. 1. Площадь соединительной ткани в очагах повреждения Рис. 2. Апоптотический индекс КМЦ при
миокарда при моделировании кардиомиопатии и ее коррекции моделировании кардиомиопатии и ее коррекции стволовыми клетками: - старые по сравнению с молодими. стволовыми клетками.
# - для экспериментальной группы (ИП) по сравнению с контролем; о - для группы ИП + СК по сравнению с ИП; - для группы ИП + СК по сравнению с контролем.
Изопротеренол+ск
Рис.3 Процентное содержание закрытых капилляров в Рис. 4. Объемная доля малодифференцированных КМЦ
миокарде при моделировании кардиомиопатии и ее коррекции в миокарде левого желудочка мышей при моделировании стволовыми клетками (ЛЖ - левый желудочек, ПП - правое кардиомиопатии и ее коррекция стволовыми клетками предсердие)
При введении МККМ животным с КМП вблизи очагов повреждения, преимущественно у молодых животных, встречаются своеобразные, нетипичные КМЦ в виде крупных гипертрофированных клеток со светлой цитоплазмой, крупным сферическим слабо базофильным
№
15
о ◊
¿5
о ◊
1,5
0,5
ядром, содержащим эухроматин (рис. 4). Такие малодифференцированные клетки, в какой-то степени напоминающие эмбриональные, расположены среди обычных КМЦ и соединены с ними вставочными дисками. Реакция соединительнотканных клеток вокруг этих КМЦ не выражена. Поскольку ни в контроле, ни у животных с КМП, такие клетки практически не определялись, их можно рассматривать как проявление репаративных и пролиферативных процессов, вызванных воздействием МККМ, выделяющих большое количество цитокинов и других биологически активных веществ. Существует точка зрения, что трансплантация МККМ оказывает паракринное действие на поврежденный миокард [3].
На сегодняшний день имеется большое количество исследований, в которых доказано, что в даже во взрослом сердце имеются собственные СК и клетки-предшественники сердечных миоцитов. Их количество может возрастать при остром и, в меньшей степени, при хроническом повреждении сердца [3]. Результаты наших исследований показали, что СК, введенные животным с ИП-индуцированной КМП, оказывают определенной нормализующее влияние и на структуру капилляров у животных обеих возрастных групп. Нормализуется площадь ядер ЭК, процент закрытых капилляров снижается, перикапиллярный отек уменьшается. У старых животных, несмотря на снижение площади ядер ЭК и уменьшение процента закрытых капилляров, восстановление ультраструктурных характеристик МЦР оказалось менее демонстративным.
Таким образом, введение стволовых клеток животным с ИП-индуцированной кардиомиопатией оказывает определенное нормализующее влияние на структурные и ультраструктурные характеристики КМЦ и капилляров миокарда молодых животных, однако у старых - нормализующий эффект оказался существенно меньшим, чем у молодых.
1. Квитницкая-Рыжова Т.Ю. Оценка возрастных структурных изменений клеток и тканей с помощью математического аппарата, созданного на базе теории нечетких множеств / Т.Ю. Квитницкая-Рыжова, А.Г. Бутенко, С.А. Михальский // Проблемы старения и долголетия. - 2007. - Т. 16 (4). - С. 321-332.
2. Квитницкая-Рыжова Т.Ю. Возрастные особенности проявлений апоптоза в гисто-гематических барьерах различных органов при экспериментальном сахарном диабете / Т.Ю. Квитницкая-Рыжова, А.С. Ступина, Г.В.Хаблак [и др.] // Проблемы старения и долголетия. - 2010. - Т. 19 (4). - С. 329-338.
3. Чайковський Ю.Б. Стовбуровi кл™ни / Ю.Б. Чайковський, О.1. Дельцова, С.Б. Геращенко // 1вано-Франювськ: Мюто НВ, - 2014. - 500 с.
4. Balakumar P. Rodent models of heart failure / P. Balakumar, A.P. Singh, M. Singh // J.Pharmacol.Toxicol.Methods. - 2007. -Vol. 56 (1). - P. 1-10.
5. Brooks W. W. Isoproterenol-induced myocardial injury and diastolic dysfunction in mice: Structural and functional correlates / W.W. Brooks, C.N. Conrad // Comparative Medicine. - 2009. - Vol.59 (4). - P. 339-343.
6. Galindo C.L. Transcriptional profile of isoproterenol-induced cardiomyopathy and comparison to exercise-induced cardiac hypertrophy and human cardiac failure / C.L. Galindo, M.A. Skinner, M. Errami [et al.] // BioMed Central Physiology. - 2009. -Vol.9. - P. 1-23.
7. Nichols M. European cardiovascular disease statistics. 2012 edition / M. Nichols, N. Townsend, P. Scarborough [et al.] // University of Oxford, - 2012. - 125 p.
8. Tendera M. The epidemiology of heart failure / M. Tendera // J. Renin-Angiotensin-Aldosterone System. - 2004. - Vol.5 (S2). - P.S1-S5.
9. Peng D.-F. Pathophysiological model of chronic heart failure complicated with renal failure caused by three-quarter nephrectomy and subcutaneous injection of isoprenaline / D.-F. Peng, S.-Y. Tang, Y.-J. Hu [et al.] // Experimental and Therapeutic Medicine. - 2013. - Vol.5. - P. 835-839.
СТРУКТУРЫ ЗМ1НИ М1ОКАРДУ ПРИ МОДЕЛЮВАНН1 КАРДЮМЮПАТП ТА II КОРЕКЦП ЗА ДОПОМОГОЮ СТОВБУРОВИХ
КЛ1ТИН У ТВАРИН Р1ЗНОГО В1КУ Квггницька-Рижова Т.Ю., Клименко П.П., Хаблак Г. В., Парамонова Г.1., Юрж В.М. Метою дослщження було вивчення вкових структурных та ультраструктурних змш при моделюванш кардюмюпатп (введення iзопротеренолу (1П) в дозi 100 мг/кг, 5 дшв) та И корекцй за допомогою трансплантацп стовбурових кл™н - мононуклеарних кйтин юсткового мозку (МККМ) мишей (5 млн.). Введення 1П викликало гшертрофто мюкарду -стввщношення Маса серця/Маса тша (МС/МТ) значно збшьшилось порiвняно з контролем i у молодих (33 %), i
STRUCTURAL CHANGES OF MYOCARDIUM UNDER
MODELING OF CARDIOMYOPATHY AND ITS CORRECTION WITH STEM CELLS IN ANIMALS OF DIFFERENT AGE Kvitnitskaya-Ryzhova T.Yu., Klimenko P.P., Khablak G.V., Paramonova G.I., Kirik V.M.
This study aimed to investigate the age-related structural and ultrastructural changes and the level of apoptosis (TUNEL -assay) in mice myocardium (5 and 25 mo.) after administration of Isoproterenol (IP) (100 mg/ kg body weight, 5 days) and further transplantation of stem cells - mice bone marrow-derived mononuclear cells (BM-MNCs) (5 mil.). IP administration created cardiac hypertrophy in experimental animals. Heart weight/ body weight ratios (HW/BW) increased significantly, compared to sedentary animals for both young (33 %) and old (11 %) mice. Cell
у старих (11 %) тварин; вiдмiчалось потовщення кардюмюци'пв (КМЦ) i мiоцитiв стшки артерiол. Крiм того, розвивались фiброз та вогнищевi ушкодження мiокарду з дiстрофiчними та деструктивними змiнами КМЦ i капiлярiв, що було в бшьшш мiрi виражено у старих тварин. Трансплантащя МККМ тваринам iз 1П-iндукованою кардiомiопатieю справила нормалiзуючий вплив на структуру КМЦ i капiлярiв, що було в бшьшш мiрi виражено у молодих. У них вiдмiчалось зниження iндексу МС/МТ майже до контрольного рiвня, менша вираженнiсть дiстрофiчних та некротичних змш в КМЦ, а також зменшення об'ему вогнищ ушкодження. Крiм того, вiдмiчено зниження рiвня апоптозу, переважно у молодих тварин. Апоптотичний шдекс знижувався у них майже вдвiчi, а у старих - його змши були незначними.
Ключовi слова: кардюмюпаия, старiння, терапiя стовбуровими кйтинами, морфометрiя.
Стаття надiйшла 11.10.2014 р.
cross-sectional area in H&E stained sections was also significantly increased in mice treated with IP; cardiomyocytes (CMC), as well as myocytes in arteriole wall appeared to be thicker. Besides there developed fibrosis and numerous focal injuries (with dystrophic and destructive changes in CMC and capillaries) predominantly in the left ventricle and septum wall that appeared to be more severe in old animals. Transplantation of BM-MNCs to the animals with IP-induced cardiomyopathy has produced definite normalizing effect on CMC and capillaries structure, being more pronounced in the young mice. The latter displayed HW/BW decrease and less marked dystrophic and necrotic changes in CMC as well as the lower amount of the injury foci. Besides, it is shown the apoptotic level decrease predominantly in the young animals. The apoptotic index in these animals was almost two-fold lower while it remained almost unchanged in the old ones.
Key words: cardiomyopathy, aging, stem cell therapy, morphometry.
Рецензент Шеттько B.I.
УДК 616-006.327-091:616.1/.8:57.017.3:77.026.34
АДАПТИВНЫЕ ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ФИБРОЗНЫХ ОБОЛОЧЕК НЕКОТОРЫХ ОРГАНОВ ПО ДАННЫМ СКАНИРУЮЩЕЙ ЭЛЕКТРОННОЙ МИКРОСКОПИИ
Методом сканирующей электронной микроскопии исследована поверхность фиброзных оболочек почек, селезенки, печени, поджелудочной и щитовидной желез, яичка, мочеточника, пищевода, кавернозных тел полового члена. Выявленный характер их складчатости зависит от интенсивности кровотока и концентрации напряжений в органе.
Ключевые слова: фиброзная оболочка, электронная микроскопия.
Работа является фрагментом НИР «Морфофункцюналъш особливостi судинного русла та регенераторы можливостi сечостатевих оргатв тсля органозберiгаючих оперативных втручанъ, кореляци кровотоку та шуностимуляци», государственная регистрация № 0114и000763.
Фиброзная оболочка органов является частью их соединительнотканного каркаса, находится в тесной взаимосвязи с их морфофункциональным состоянием и играет формообразующую роль [5].
Целью работы было изучение строения поверхности фиброзной оболочки ряда паренхиматозных органов (почек, селезенки, печени, поджелудочной и щитовидной желез, яичка), трубчатых органов (мочеточника и пищевода), а также кавернозных тел полового члена методом сканирующей электронной микроскопии.
Материал и методы исследования. Материалом послужили участки органов вместе с фиброзной оболочкой площадью 5^10 мм, взятые от 4 трупов людей, погибших от травм в результате несчастного случая. Образцы органов фиксировали в 1% забуференном растворе глутарового альдегида, 2% 0804, обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации, высушивали путем перехода через критическую точку эфира, напыляли золотом и исследовали с помощью сканирующего электронного микроскопа 18М-35 (Япония). На сканограммах определяли расстояние между вершинами складок на поверхности капсул органов (50 измерений на одной сканограмме).
Результаты исследования и их обсуждение. Было установлено, что фиброзные капсулы органов имели складчатую поверхность. Наличие складок определялось извитым ходом коллагеновых волокон, образующих капсулу и имеющих преимущественно упорядоченную архитектонику. Образцы фиброзной капсулы почки в области полюсов и вдоль латерального края содержали хорошо выраженные, расположенные рядами складки полукруглой формы с расстоянием между вершинами 11,89±0,57 мкм. На передней и задней поверхности почки на уровне ворот складчатость была менее выражена. Складки также были представлены рядами, но были уплощены, а расстояние между вершинами было меньшим - 4,38±0,23 мкм. Почка заметно изменяет свой объем в зависимости от уровня физиологического кровенаполнении. Учитывая, что спонтанные разрывы почки наиболее часто встречаются в области полюсов и по латеральному
