CC BY
57
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
© М. В. Голованов, В. Долтчинкова, 2002 УДК 511.18:577.1
М. В. Голованов, В. Долтчинкова
СТРУКТУРА И НЕКОТОРЫЕ СВОЙСТВА ГЛИКО-КАЛИКСА ЛЕЙКОЦИТОВ И ЛЕЙКЕМИЧЕСКИХ КЛЕТОК
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей, Софийский университет, Болгария
Гликокаликс определяется как внешний примембранный слой плазматической мембраны. Он состоит в основном из гликозоаминогликанов, в составе которых находятся молекулы гиалуроновой кислоты [1—3].
Известно, что гликокаликс принимает активное участие почти во всех внеклеточных функциях (иммунологических) от начала контакта клетки с внешними агентами и заканчивая формированием электрического заряда на поверхности плазматической мембраны (физические функции) [8].
Известно, что при взаимодействии клетки с концентрированным раствором электролита, например раствором 1,7 М №01, гликокаликс набухает максимально до 20 ООО нм, имея при этом в начальной стадии размер около 4 нм [5].
Целью данного исследования является описание структуры и некоторых свойств гликокаликса.
Материал и методы. Метод выявления внешнего примембранного слоя — гликокаликса лейкоцитов, лейкемических клеток состоит в следующем: 10 капель раствора 2,55 М №С1 с тушью добавляли к одной капле крови или суспензии лейкемических клеток (хронический лимфолейкоз человека), полученных путем центрифугирования цельной крови в режиме 350 g в течение 20 мин и взятия с поверхности осадка клеток суспензии лейкоцитов (лейкемических клеток).
Затем одну каплю смеси клеток и раствора электролита помещали на поверхность предметного стекла и накрывали покровным стеклом для приготовления препарата «капля между двумя стеклами». Через 2—10 с наблюдения за препаратом около клеток отмечали появление геля-гликокаликса. Это можно было наблюдать в оптическом световом микроскопе (хЮО— 400) фирмы «Ьейг» (Германия).
Метод выделения компонентов гликокаликса заключается в следующем: лейкоциты крови больного с диагнозом хронического лимфолейкоза отмывали в изотоническом растворе 0,154 М №01 в объемном соотношении 1:100 для того, чтобы удалить плазму (т. е. к 99 мл раствора N30 была добавлена одна капля крови). Затем выделяли клетки методом центрифугирования в режиме 350 g в течении 20 мин. Далее клеточную суспензию инкубировали в электролите №С1 с различной концентрацией (0,21—3,4 М) при комнатной температуре и дневном свете, в результате чего получали суспензию клеток с набухшим гликокаликсом.
В больших количествах гликокаликс с поверхности клеток получали следующим образом: 100 мл цельной крови центрифугировали в течение
M. V.Golovanov, V.Doltchinkova
STRUCTURE AND SOME PROPERTIES OF LEUKOCYTE AND LEUKEMIC CELL GLYCOCALYX
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, University of Sofia, Bulgaria
Glycocalyx is an outer coating of plasmatic membranes. It consists of glycosaminoglycans containing hyaluronic acid molecules [1-3].
Glycocalyx takes an active part in almost all extracellular functions (immunological functions) ranging from cell contacts with external agents to generation of electric charge on plasmatic membrane surface (physical functions) [8].
When a cell interacts with concentrated electrolyte solution, e.g. 1.7M NaCl, glycocalyx swells maximally up to 20,000 nm, its initial size being about 4 nm [5].
The purpose of this study was to describe structure and some properties of glycocalyx.
Materials and Methods. The following procedure was used to isolate outer perimembrane layer (glycocalyx) of leukocytes and leukemia cells. 10 drops of 2.55M NaCl solution with Indian ink were added to one drop of blood or leukemia cell suspension (human chronic leukemia) produced as a result of centrifugation of whole blood at 350 g for 20 min and harvesting of leukocyte suspension from the precipitate surface. Then one drop of the mixture of the cells and electrolyte solution was placed on a glass slide and covered with a cover glass to prepare a 'drop between two glasses’ specimen. At 2-10 s gel glycocalyx appeared near the cells that could be seen using a Leitz (Germany) light microscope (X100-400).
Procedure of isolation of glycocalyx components was as follows. Blood leukocytes from a patient with chronic lymphatic leukemia were washed in 0.154M NaCl isotonic solution at 1:100 v/v to remove plasma (i.e. one drop of blood was added to 99 ml NaCl solution). Cell separation was made by centrifugation at 350 g for 20 min. The cell suspension was then incubated in electrolyte NaCl at different concentrations (0.21-3.4 M) at room temperature and in daylight to have a cell suspension with swelling glycocalyx.
Cell surface glycocalyx was obtained in a large amouiit by the following procedure. 100 ml whole blood was centrifuged at 350 g for 20 min, then the supernatant was removed with a pipette and 1 ml leukocytes were harvested from the precipitate surface. The leukocytes (after washing in
0.154M NaCl isotonic solution to remove plasma) were transferred into 2.6 M NaCl in a 1:100 ratio. The cell suspension was incubated in the electrolyte solution for 60 min, then the cell suspension was centrifuged at 1,100 to 45,000 g till full precipitation of the cells and separation of gel-glycocalyx. Dialysis of supernatant containing glycosaminoglycans was
20 мин при 350 g, затем пипеткой убирали надосадочную жидкость, далее с поверхности осадка набирали 1 мл лейкоцитной массы. Лейкоциты (предварительно отмытые в изотоническом растворе 0,154 М NaCl для удаления остатка плазмы) в соотношении 1:100 помещали в раствор 2,6 М NaCl. Инкубацию клеточной суспензии в растворе электролита проводили в течение 60 мин, далее проводили центрифугирование клеточной суспензии при скорости вращения ротора от 1100 до 45 000 g до полного осаждения клеток и отделения их от геля-гликокаликса. Диализ надосадочной жидкости, в которой находились гликозоаминогликаны, осуществляли в течение 2—5 сут через полупроницаемую мембрану до полного удаления электролита. Отдиапизованный гель-гликокаликс, находящийся в целлофановом полупроницаемом мешочке, лиофилизировали. Полученный порошок после напыления золота на препарат исследовали в сканирующем электронном микроскопе PS-501 фирмы «Филлипс», Голландия (по методу Ю. А. Ровенского [2]).
Концентрационный, временной и скоростной режимы выделения компонентов гликокаликса можно варьировать в зависимости от вида и устойчивости различных клеточных мембран.
Количество гликокаликса зависит от числа ореолобразующих клеток среди общего числа лейкоцитов и, как следствие, от состояния организма, из крови которого выделяют лейкоцитную массу.
Результаты и обсуждение. После контакта клеток с раствором электролита высокой концентрации (2,6 М NaCl) или добавления в клеточную суспензию электролита и частиц туши в течение 2—10 с вокруг некоторых лейкоцитов образуется гель диаметром до 30 мкм. Это происходит в результате набухания полимеров, находящихся на поверхности клеток. В этом случае гликокаликс активизируется и занимает максимальный объем, характерный для данной клетки (см. рисунок).
Скорость набухания геля-гликокаликса около 2000 нм/с. Если вместо фоновых частиц туши использовать фоновые клетки — эритроциты, то вокруг лейкоцитов могут формироваться ореолы в течение 10—15 мин и достигать размера до 300 мкм в диаметре. Процесс появления и пропадания ореолов (набухшего гликокаликса) после добавления или уменьшения высокой концентрации электролита является обратимым.
Гель-гликокаликс около поверхности клеток имеет шарообразную форму и представлен ореолом: симметричным в случае нормальных клеток (лейкоцитов) и асимметричным для лей-кемических клеток.
Гель-гликокаликс представляет собой густую сеть полимеров (в частности, гиалуроновой кислоты) и это мешает приблизиться к поверхности плазматической мембраны клетки-лейкоцита таким большим клеткам, как эритроциты (размером от 5 до 10 мкм), полистериновым шарикам (размером от 1 до 2 мкм) и даже частицам туши размером от 1 мкм и меньше.
Размер ореолов (фоновые клетки — эритроциты крови) зависит от типа действующего галогена, такого как йод, бром, хлор, фтор в уменьшающемся порядке (J>Br>Cl>F), зависит от плотности клеточной суспензия (при низкой плотности диаметр ореолов большой) и функциональной активности самих ореолобразующих клеток, которые находятся в центре ореола.
При сканировании в электронном микроскопе лиофильно высушенного порошка геля-гликокаликса проявляются структуры в виде пластин, шариков, нитей, цилиндрических прутьев (as cylindrical rods of the glycocalyx [6]) различных форм и размеров. После воздействия на сформированные ореолы (гель-гликокаликс и фоновые частицы туши) трипсином, нейраминидазой (активность 0,5-1,5 ед.), гиалуронидазой
performed for 2-5 days using a semipermeable membrane till complete electrolyte removal. The dialyzed gel-glycocalyx contained in a semiper-meable bag was freeze-dried. The resulting powder after gold deposition was studied using a PS-501 (Philips, Netherlands) electron microscope (according to Yu.A.Rovensky [2]).
Conditions of concentration, time and rate of glycocalyx component isolation may be varied depending upon type and stability of cell membranes.
Amount of glycocalyx depends upon the portion of halo-generating cells in the total leukocyte number and, therefore, upon condition of the body from which the leukocytes were taken.
Results and Discussion. Appearance of gel up to 30 mcm in diameter around some leukocytes is observed at 2-10 s after cell contact with high-concentration (2.6M NaCl) electrolyte solution or addition of electrolyte and Indian ink particles to the cell suspension. This is a result of cell surface polymer swelling. The glycocalyx is activated and expands to a maximal volume characteristic of the cell in question (see the figure).
Rate of gel glycocalyx swelling is 2,000 nm/s. If red blood cells are substituted for the background ink particles, then haloes around leukocytes are generated for 10-15 min and reach 300 mcm in diameter. The process of halo (swelling glycocalyx) appearance and disappearance after increasing or decreasing high electrolyte concentration is reversible.
The gel-glycocalyx around the cells has a spherical shape and looks as a halo which is symmetric around normal cells (leukocytes) and asymmetric around Leukemic cells.
The gel-glycocalyx is a dense network of polymers (in particular, hyaluronic acid) and prevents large cells such red blood cells (5-10 mcm), polystyrene balls (1-2 mcm) and even Indian ink particles (1 mcm or smaller) from approaching the leukocyte plasmatic membrane surface.
The halo size (red blood cells being used as background) depends upon the halogen type (e.g. iodine, bromine, fluorine in
Рисунок. Гликокаликс (белый цвет на фотографии) вокруг лейкоцитов периферической крови.
Темный фон — частицы туши. х500.
Figure. Glycocalyx (white) around peripheral blood leukocytes. Dark background is Indian ink particles. x500.
Experimental Investigations
(активность 2000 ед.), тритоном Х-100 разрушение ореолов (геля) происходило только в препарате с гиалуронидазой в течение 5—10 дней.
Лейкемические клетки крови больного с диагнозом хронического лимфолейкоза в растворе 2,6 М №01 и частиц туши формируют периодические структуры ореолобразующих клеток (ПС ООК), а также колонии или группы, содержащие лейкемические клетки.
Периодические структуры формируются в течение одного месяца после того, как все эритроциты разрушатся. Максимальное расстояние между ореолобразующими клетками достигает 60—120 мкм. В наших исследованиях периодические структуры сохраняют свою стабильность в течение 101 нед. В процессе динамического формирования ПС ООК в структуре возникают деформации, которые изменяют форму всей суспензии. Простым видом деформации является нарушение различных степеней периодичности регулярной гексагональной структуры — это изменение расстояния между клетками, изменение угла расположения между ореолобразующими клетками и формирование нитей или связей между гелями-гликокаликсами клеток. Связи или нити на темном фоне частиц туши становятся светлее около одних клеток и менее светлыми около других. Длина некоторых нитей или связей достигает до 400 мкм.
В обсуждении отметим основное свойство гликокаликса — сильно набухать (увеличиваться в размере) при контакте с высококонцентрированными растворами электролитов (максимальная стрессовая реакция клеток). Из этого следует, что молекулы гликокаликса имеют большое количество ионогенных групп, способных взаимодействовать с большим количеством ионов (катионов и анионов — порядка 106—107 ионов), входящих и выходящих из клетки в результате ее метаболизма.
Очевидно, молекулы гликозоаминогликанов могут максимально развертываться из клубка (сжатого состояния) в сетчатую структуру при взаимодействии с электролитом. И такое их свойство не может не отразиться на рецепторных свойствах слоя гликозоаминогликанов плазматической мембраны и на электрических свойствах молекул гликокаликса, охраняющих постоянный поверхностный электрический заряд плазматической мембраны клетки.
Следует отметить, что молекулы гликокаликса играют важную роль в формировании процесса взаимодействия клеток в ткани, охраняя постоянный, генетически обусловленный электрический заряд на поверхности клетки.
Математически это можно представить следующим образом.
Сила взаимодействия заряженных физических частиц, которые не имеют на своей поверхности гликокаликса, определяется как:
Р^ад/471 80£г2’
где 2 — сила взаимодействия частиц, Ч\, ^2 ~ электрические
заряды, в0 — электрическая постоянная, равная 8,85 • 1012 Ф/м, 8 — диэлектрическая проницаемость среды, г — расстояние между частицами.
Сила взаимодействия живых клеток, имеющих на своей поверхности электрический заряд, охраняемый гликокаликсом, определяется как:
р1,2=Ч1(12/Ра1>
descending order [J>Br>Cl>F]), density of the cell suspension (the lower density the greater the halo diameter) and functional activity of the halo-producing cells in the halo center.
Electron microscopy scanning of freeze-dried gel-glycocalyx powder discovers plates, balls, filaments and cylindrical rods [6] of different shape and size. Treatment of the halos (gel-glycocalyx and background Indian ink particles) with trypsin, neu-roaminidase (activity 0.5-1.5 U), hyaluronidase (activity 2,000 U), trytone X-100 resulted in halo (gel) destruction only in the specimen with hyaluronidase that took 5-10 days.
Leukemic cells from a patient with chronic lymphatic leukemia in 2.6M NaCl solution and Indian ink particles generate periodical structures of halo-producing cells (PS HPC) as well as colonies or groups containing leukemic cells.
Generation of the periodical structures is observed for a month after all red blood cells are destroyed. Maximal distance between the halo-producing cells is 60-20 mcm. In our study the periodical structures remained stable for 101 weeks. During PS HPC generation the structure undergoes deformation resulting in alteration of shape of the suspension. A simple deformation type is disturbance of periodicity of the regular hexagonal structure, i.e. alteration of intercellular distance, alteration in the angle between the halo-producing cells and generation of filaments or bonds between cell gel-glycocalyxes. The bonds or filaments are lighter around some cells and less lighter around others against the dark background of Indian ink. Some filaments or bonds are up to 400 mcm in length.
In discussion we should like to specify the glycocalyx property to swell significantly after contact with high-concentration electrolyte solutions (maximal cell reaction to stress). It follows that glycocalyx molecules have a large number of ion generating groups able to interact with a large number of ions (cations and anions, about 106-107 ions) coming in and out of the cell as a result of its metabolism.
It seems that glycosaminoglycan molecules can maximally roll out from a condensed state into a net structure on contacting electrolyte. This property cannot help but affect receptor properties of the plasmatic membrane glycosaminoglycan layer and electric properties of glycocalyx molecules responsible for protection of constant electric charge on the surface of cell plasmatic membranes.
It should be noted that glycocalyx molecules play an important role in cell interaction by protecting the constant genetically conditioned electric charge on cell surface.
This may be presented in mathematical terms as follows.
Force of interaction of charged physical particles free from surface glycocalyx is
f1,2 = ^lV471 soer2> where Fj 2 is the particle interaction force; qj and q2 are electric charges; eO is the electric constant equal to 8.85* 1012 F/m, e is the medium electric permeability, r is the inteiparticle distance.
Force of interaction of living cells bearing electric charge on their surfaces that is protected by glycocalyx is
Fl,2 = WpG1’
where F12 is the force of living cell interaction; qj, q2 are electric charges (qj=q2=const (genetic) for a particular tissue type),
здесь F| 2 — сила взаимодействия живых клеток, q1; q2 — электрические заряды (при этом qi=q2=Const (genetic) для одного типа ткани, PQj — плотность гликокаликса, зависящая от ионной силы или концентрации электролита около поверхности клетки (функциональный показатель жизнедеятельности клетки - PGj = f(C,L,V,S,Gldk/dt ...) [1]), т. е. F12~l/pGl, в этом случае мы наблюдаем динамику перехода математического выражения силы взаимодействия заряженных поверхностей от физических частиц через модели мягких частиц до поверхности живых клеток. Иначе: 1/eqs —» 1Д —> l/pQ\, здесь 1/Х — параметр мягкости поверхности частиц («softness» parameter Н. Ohshima [7]), для частиц, покрытых полиэлектролитным слоем (N-isopropylamide gel layers).
Исходя из сказанного следует, что набухающий в электролите гликокаликс играет важную роль в основных принципах биофизической теории электрофореза живых клеток.
Выводы. 1. Z-потенциал определен генотипом клетки и является такой же постоянной физиологической величиной для соответствующей клетки, как температура тела, pH периферической крови.
2. Формирование двойного электрического слоя на поверхности клетки определяется пассивными и активными процессами: а) пассивными — физическими процессами диссоциации и адсорбции ионов на ионогенных группах плазматической мембраны, б) активными — биологическими процессами, определяемыми метаболизмом самой клетки, который в свою очередь зависит от генотипа.
3. Активность адсорбционного и диффузного слоев корректируется деятельностью селективного слоя — гликокаликса, объем которого в электролите изменяется от 4 до 20 ООО нм.
4. Гликокаликс патологических (опухолевых) клеток располагается нерегулярно на поверхности плазматической мембраны.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Голованов М. В., Bauer J. // Вестник Онкологического научного
центра им. Н. Н. Блохина РАМН. — 1997. — № 3. — Р. 19-24.
2. Ровенский Ю. А. // Растровая электронная микроскопия нормаль-
ных и опухолевых клеток. — М., 1979. — С. 151.
Pqj is the glycocalyx density depending upon ionic strength or electrolyte concentration near the cell surface (functional characteristic of cell vitality: Pqj = f(C,L,V,S,Gldk/dt...) [1]), i.e. F]j2~1/PG]> we observe here transfer of mathematical expression for the force of interaction of charged surfaces from physical particles through soft particle models to living cell surfaces, or 1/sqs 1/1 -> 1/pgj, where 1/X is the parameter of particle surface softness (H. Ohshima's parameter [7]) for particles coated with a polyelectrolyte (N-isopropylamide) layer.
It follows from the above-said that the glycocalyx swelling in electrolyte plays an important role in the principles of the biophysical theory of electrophoresis of living cells.
Conclusions. 1. Z-potential is determined by cell genotype and is a constant physiological value for the corresponding cell, like body temperature or peripheral blood pH. 2. Generation of a double electric charge on cell surface is determined by passive and active processes: (a) passive processes are physical processes of ion dissociation and association on ion-producing groups of plasmatic membranes, (b) active processes are biological processes depending upon metabolism of the cell itself which in turn depends upon genotype. 3. Activity of the adsorption and diffuse layers is corrected by action of a selective layer or glycocalyx that swells from 4 to 20,000 nm in electrolyte environment. 4. Glycocalyx of pathological (tumor) cells is located irregularly on plasmatic membrane surface.
3. Bauer J. The negatives surface charge density of cells and their acrual
state of differentiation or activation // Cell Electrophoresis. J. Bauer (ed). CRC-Press. — Boca Raton, — 1994. — P. 267—280.
4. Bauer J., Golovanov М. V. // Биофизика. — 1996. — Vol. 41,
N 3. - P. 788.
5. Golovanov М. V Electrophoresis of cells at a high phisiologic ionic
strength. // Cell Electrophoresis. J. Bauer (ed). CRC-Press. — Boca Raton. - 1994. - P. 181-198.
6. MestelA. J., Mokady A. J., Parker К. K, Winlove C. P. //
Biorheology. 1998. - Vol. 35, N 6. - P. 365-381.
7. Ohshima H., Kondo T. // Biophys. Chem. — 1991. — Vol. 39. —
P. 191-198.
8. Slivinsky G. G., Hymer W. C., Bauer J., Morrison L. R. //
Electrophoresis. — 1997. — \bl. 18. — P. 109—119.
Поступила 10.09.01 / Submitted 10.09.01
