CC BY
40
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
EXPERIMENTAL INVESTIGATIONS
© Голованов М. В., 2002 УДК 511.18:577.1
М.Б.Голованов
ФЕНОМЕН ОБРАЗОВАНИЯ ГИГАНТСКИХ ВАКУОЛЕЙ КАК ПОКАЗАТЕЛЬ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Среди всех мембран, имеющих важное значение в жизни клеток животных, можно выделить, в частности, плазматическую мембрану, которая выполняет ряд функций, например осуществление транспорта питательных веществ и неорганических ионов в клетку и из нее, поддержание поверхностного электрического заряда, ограждение клеток от проникновения вредных микроорганизмов, вирусов, молекул. Несмотря на их относительную однородность в структуре, мембраны участвуют в организации различных органелл, ядра, клетки [13, 14].
В цитологии известны вакуоли, расположенные внутри клетки, которые являются хранилищами воды и минеральных солей. Процесс формирования вакуолей в клетке характеризует метаболизм и приспособительную реакцию клетки на действие электролита при неблагоприятных условиях (например, при засухе). Вакуоли в клетке являются ее орга-неллами и достигают размеров от 0,1 до 1,0 мкм. Их размеры могут увеличиваться или уменьшаться при изменении степени осмотичности растворов внутри и вне клетки [4,5].
В стрессовых ситуациях, например при воздействии гипотонических или гипертонических растворов, клетка уменьшается или увеличивается в размерах за счет изменения эластичных свойств плазматической мембраны и элементов протоплазмы клетки [1—3, 8].
Известно также, что плазматическая мембрана клетки формирует цитоплазматические выросты (пузырьковидные псевдоподии) — пузырьки вскипания — bubbling, которые представляют собой мелкие пузырьки на короткой ножке или без нее. Они очень быстро образуются и так же быстро исчезают, создавая впечатление «вскипания» какого-либо участка клеточной поверхности. Это явление наблюдается обычно при митозе. Иногда пузырьки насаживаются друг на друга в виде четок. Однако это не мешает им очень быстро втягиваться обратно в цитоплазму.
М. VGolovanov
GIANT VACUOLATION AS AN INDICATOR OF PLASMATIC MEMBRANE ACTIVITY
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors
Plasmatic membrane is responsible for several important functions in animal cells such as transport of nutrients and inorganic ions into and from the cell, maintenance of surface electric charge, cell protection from harmful organisms, viruses, molecules. Notwithstanding their homogeneous structure the membranes contribute to organization of a variety of organelles, nuclei and cells [13,14].
There are intracellular vacuoles that perform the function of storing water and mineral salts. Intracellular vacuolation is characteristic of cell metabolism and adaptive reaction to electrolytic influence under unfavorable conditions (e.g. in drought). Cell vacuoles are organelles and reach 0.1 to 1.0 mcm in size. They may grow or shrink depending upon osmolarity of intra- and extracellular solutions [4,5].
Under stress, e.g. in hypertonic or hypotonic solutions, the cell grows or shrinks due to alteration of elasticity of the plasmatic membrane and cell protoplasmic elements [1-3,8].
Plasmatic membrane may generate cytoplasmatic processes or small bubbles with or without a short pedicle. Their generation and disappearance proceed very rapidly and look like boiling of a part of the cell surface. This process is often observed during mitosis. Sometimes the bubbles join as beads but can still easily be drawn into the cytoplasm. The bubbling of some parts of plasmatic membrane is also characteristics of cell physiological death (apoptosis) [6,7,9,12,14].
There are two types of the membrane boiling, i.e. blebbing (generation of short strings of bubbles) and budding (generation of individual rapidly disappearing bubbles).
We placed tumor cells into hypertonic electrolyte solution (0.34 to 3.4 M NaCl) to observe that the cells generated surface vacuoles that were several ten-folds greater than the cell itself. These giant vacuoles are spheroid biological membranes filled with electrolyte solution (we termed them balls, and the process of their formation — balling) [10,11].
«Вскипание» отдельных участков плазматической мембраны наблюдается также при физиологической смерти клетки (апоптозе) [6, 7, 9, 12, 14].
Различают две формы вскипания мембраны: «пузырько-вание» (blebbing) — образование коротких цепочек пузырьков, которые напоминают четки и могут втягиваться назад в цитоплазму и почкование (budding) — образование единичных, быстро исчезающих пузырьков.
Помещая опухолевые клетки в гипертонический раствор электролита от 0,34 до 3,4 М NaCl мы обнаружили, что клетки формируют около своей поверхности вакуоли размером, превосходящим саму клетку в несколько десятков раз.
Эти гигантские вакуоли представляют собой биологические мембраны шарообразной формы, заполненные раствором электролита (мы назвали их шарами — balls, а сам процесс — balling) [10, 11].
Целью данного исследования является описание нового феномена образования внеклеточных гигантских вакуолей из плазматических мембран клеток в ответ на воздействие концентрированных растворов электролитов — balling и описание их некоторых свойств. Мы полагаем, что феномен образования гигантских вакуолей является одним из процессов апоптоза.
Материал и методы. Исследование проведено на штамме опухолевых клеток человека (карцинома яичника) в присутствии 0,34—3,4 М раствора NaCl и других электролитов и частиц туши размером до 0,45 мкм, полученных с помощью миллипоровских фильтров (см. рисунок). Коллоидные частицы туши нужны для обнаружения и контрастирования оптически едва заметных мембран шаров-вакуолей.
Сущность метода выявления внеклеточных гигантских вакуолей заключается в следующем: к одной капле (объемом 0,03 мл) клеточной суспензии на смесительном стекле добавляли 10 капель (объемом по
0,03 мл, т. е. в сумме 0,3 мл) 2,6 М раствора NaCl с тушью. Все перемешивали и одну каплю смеси (0,03 мл) помещали на предметное стекло, накрывали покровным стеклом, препарат изолировали от воздуха вазелином. Наблюдали в световом микроскопе за процессом формирования вакуолей. Наблюдение проводили непрерывно в световом микроскопе (фирма «Leitz», Германия) при увеличении в 100, 400, 900 раз и поэтапно на электронном микроскопе Р-501 (фирма «Филлипс», Голландия).
Выделение внеклеточных гигантских вакуолей проводили следующим образом: клеточную суспензию карциномы яичника соединяли с 1,7 М раствором NaCl, смесь инкубировали в течение 4 дней (для получения максимального количества гигантских вакуолей), затем смесь центрифугировали при 3000 об/мин в течение 10 мин. В результате получали осадок клеток и визуально прозрачную надосадочную жидкость, в которой находились гигантские вакуоли различных размеров.
Результаты и обсуждение. В результате воздействия на клетки электролитом 2,6 М NaCl высокой концентрации на поверхности плазматической мембраны опухолевых клеток, или в самой мембране, начинают формироваться внеклеточные гигантские вакуоли, т. е. крупные шарообразные «мешки, шары, полости», ограниченные плазматической мембраной и наполненные раствором электролита.
Динамика реакции исследованных клеток на действие электролита высокой концентрации определяется следующим образом.
В течение 1 мин на поверхности клетки в различных местах начинают появляться округлые образования размером до 1 мкм, которые со временем увеличиваются в размере и в конечном счете превосходят размеры клетки в несколько десятков раз.
This paper describes a new phenomenon, generation of extracellular giant vacuoles from cell plasmatic membranes in response to the effect of concentrated electrolyte solution, i.e. balling, and some of the ball properties. We believe the balling to be a part of apoptosis.
Materials and Methods. The study was performed on a human ovarian carcinoma strain placed into 0.34-3.4 M solutions of NaCl and other electrolytes with Indian ink particles 0.45 mem or less obtained using Millipore filters (see the figure). The colloid ink particles are needed to visualize ball membranes that are poorly visible.
Procedure of study of extracellular giant balls is as follows. 10 drops (0.03 ml each, a total 0.3 ml) of 2.6 M NaCl solution with Indian ink were added to a drop (0.03 ml) of cell suspension and mixed, a drop (0.03 ml) of this mixture was transferred onto a slide, covered with a cover glass and insulated with vaseline. Giant ball formation was studied by continuous light microscopy using a Leitz (Germany) light microscope xlOO, x400 and x900, and in a stage-by-stage manner using a P-501 (Philips, Holland) electron microscope.
Procedure of ball isolation was as follows. Ovarian carcinoma cell suspension was mixed with 1.7 M NaCl solution, incubated 4 days (to have maximum number of the balls), centrifuged at 3,000 rpm lOmin. Asaresult we had a cell precipitate and transparent supernatant containing giant vacuoles of different size.
Рисунок. Внеклеточные гигантские вакуоли клеток карциномы яичника.
а — вакуоли на светлом фоне раствора электролита, отмечены стрелками. Световой микроскоп. Ваг =10 д; й — вакуоли на темном фоне коллоидных частиц туши, отмечены стрелками. Световой микроскоп. Ваг= 10 ц;
Figure. Extracellular giant vacuoles of ovarian carcinoma cells, a, arrows show balls against the light background of electrolyte solution. Light microscope. Bar = 10 ц; b, arrows show balls against the dark background of colloid ink particles. Light microscope. Bar = 10 ц
Experimental Investigations
В течение 5 мин отдельные вакуоли различных диаметров отшнуровываются от поверхности плазматической мембраны в самостоятельную единицу размером от 1 до 10 мкм в диаметре и удаляются от поверхности мембраны.
Через 20 ч — вакуоли на поверхности плазматической мембраны увеличиваются в размере до 20—80 мкм.
Затем в течение 136 ч вакуоли увеличиваются до 100 мкм в диаметре и более, одновременно с этим появляются новые вакуоли, идет отделение некоторых вакуолей от поверхности клетки. Однако все указанные процессы замедляются в результате длительного воздействия гипертонического раствора электролита. Физиологическая смерть клетки наступает после завершения процесса образования вакуолей, и все дальнейшие процессы умирания клетки проходят внутри клетки на уровне органелл и далее — молекул. В одном из примеров общая длина (по периметру, с использованием измерительного прибора — курвиметра) для клетки составляет 12 мкм, а длина всех вакуолей (по периметру), произведенных этой клеткой, составляет 458 мкм, т. е. общая поверхность вакуолей превосходит общую поверхность клетки, образующей вакуоли, в 38 раз.
Наряду с образованием новых вакуолей происходит частичное разрушение некоторых, свободных от клетки вакуолей, их содержимое вытекает и остаются тени плазматических мембран.
Количество внешних вакуолей может быть различно у отдельных клеток и колебаться от 1 до 25 вакуолей и более. Вакуоли имеют различные диаметры от 2 до 140 мкм.
При достижении определенного объема все шарообразные вакуоли различного размера удаляются от поверхности клетки на расстояние до 10—100 мкм и более.
Внеклеточные гигантские вакуоли представляют собой свободное от частиц туши округлое полое образование, ограниченное тонкой оболочкой, чистой плазматической мембраной. Содержимое вакуоли оптически прозрачно. Поскольку вакуоли наполнены раствором электролита, то они легче остальных клеток и их можно выделять простым центрифугированием.
Мембрана вакуоли окрашивается метиленовым синим так же, как и мембрана, и содержимое клетки.
При исследовании в электронном сканирующем микроскопе на поверхности мембраны гигантских вакуолей каких-либо структурных образований не отмечено.
Процесс физиологического умирания клеток можно остановить. Клетка сохраняет свою жизнеспособность, если через некоторое время (минуты, часы) снять действие на нее электролита высокой концентрации. В этом случае процесс образования вакуолей останавливается, т. е. процессом образования вакуолей можно управлять, добавляя или убирая из среды инкубации электролит высокой концентрации.
На фоне известных процессов вскипания (blebbing, budding, bubbling) процесс образования внеклеточных гигантских вакуолей (balling) выделяется простотой наблюдения, четкой повторяемостью, управляемостью, а также мощным и быстрым образованием большого количества «шаров», т. е. чистой и нативной плазматической мембраны.
Results and Discussion. Cell treatment with 2.6 M NaCl resulted in generation of extracellular giant vacuoles or balls on the surface of or inside tumor cell plasmatic membrane that were enclosed into plasmatic membrane and filled with electrolyte solution.
Cell response to high-concentration electrolyte treatment was as follows.
During the first minute round processes up to 1 mcm in size are formed in different sites of the cell surface. They grow to become several ten-folds greater than the cell itself.
At 5 min individual balls are separated from plasmatic membrane to make independent units 1-10 mcm in diameter and move from the membrane surface.-
At 20 h the plasmatic surface vacuoles reach 20-80 mcm in diameter.
At 136 h the vacuoles grow to 100 mcm or more in diameter in parallel with generation of new balls and separation of some balls from the membrane surface. However, these processes proceed slower after chronic treatment with electrolyte hypertonic solution. Physiological cell death occurs after the giant vacuolation ends and all further processes involved in cell death proceed inside the cell at the level of organelles and molecules. In one of our experiments the total length (as measured with a curvimeter) of the cell surface was 12 mcm while the total length of all vacuoles generated by this cell was 458 mcm, i.e. the total vacuole surface was 38-fold greater than the cell surface.
In parallel with generation of new balls we observed partial destruction of some separated vacuoles with their contents flowing out and plasmatic membrane shadows remaining.
The number of extracellular balls may vary from 1 to 25 or more. Vacuole diameter varies from 2 to 140 mcm.
After reaching a certain size all balls move from the cell surface at a distance 10-100 mcm or greater.
The extracellular vacuoles look like ink-free balls surrounded by a thin shell of pure plasmatic membrane. The ball content is optically transparent. Since the balls are filled with electrolyte solution they are lighter than the parent cell and may be isolated by simple centrifugation.
The vacuole membranes can be stained with methylene blue like cell membranes and contents.
There were no structures on giant vacuole membranes when studied by electron microscopy.
The process of cell physiological death can be arrested. The cell remains vital if high-concentration electrolyte treatment is discontinued at a certain time (several minutes or hours). In this case the vacuolation stops, i.e. the balling process is controllable by high-concentration electrolyte adding to or removing from incubation environment.
In comparison with the well-known processes such as blebbing, budding or bubbling the balling is simple to observe, easy to reproduce and control, and makes available a large amount of balls, i.e. pure native plasmatic membrane.
Cell physiological death occurs after 5-day treatment with high-concentration electrolyte. This observation confirms the idea that the live cell resists to the electrolyte damaging effect all this time, and the synthesis of plasmatic membrane
Процесс физиологического умирания клеток наступает после 5-суточного воздействия электролитом высокой концентрации на клетки. Этот факт подтверждает мысль о том, что живая клетка все это время сопротивляется гибельному воздействию электролита, а механизмом сопротивления является активный синтез плазматических мембран для создания вакуолей, в которых находятся вода и избыточный для клетки NaCl.
В процессе формирования гигантских вакуолей можно отметить несколько характерных эффектов при действии на клетку электролитов высокой концентрации:
1) клетки уменьшаются в размере до 50% за счет выхода из них свободной воды и сжатия мембраны (клеточная поверхность сморщивается);
2) активный синтез мембран идет практически в условиях отсутствия свободной воды в клетке и при большей концентрации электролита;
3) ферменты активно функционируют в этих условиях, участвуя в создании гигантских вакуолей.
Создание вакуолей, превосходящих клетку размерами, может быть связано либо с активным синтезом новых мембран для вакуолей, либо с использованием резерва мембранного материала, либо с растяжением и отторжением уже имеющегося мембранного материала из плазматической мембраны самой клетки или из мембран внутриклеточных вакуолей, несмотря на постепенное умирание самой клетки.
Факт увеличения мембранной поверхности вакуолей в 10—40 раз по сравнению с поверхностью исходной клетки свидетельствует о высокой ее активности. Длительная инкубация клетки в гипертоническом растворе способствует накоплению большого количества вакуолей для дальнейших исследований и для установления предела возможностей синтеза или сборки биологических мембран отдельной клеткой в процессе физиологического умирания клетки.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Комиссарчик Я. Ю., Левин С. В. //Цитология. — 1974. — № 16. —
С. 528.
2. Лясс Л. А., Васильев Ю. М. //Бюл. экспер. биол. — 1981. — № 8. — С. 93.
3. Маленков А. Г. Ионный гомеостаз и автономное поведение опухоли. -М., 1976.
4. Насонов Д. И. Некоторые вопросы морфологии и функции клетки. -М.-Л., 1963.
to provide for the balls that contain water and excessive NaCl is a mechanism of the cell resistance.
There are several characteristic effects of cell treatment with high-concentration electrolyte.
1) Cells reduce by up to 50% due to free water release and membrane shrinkage.
2) Active membrane synthesis proceeds practically without free cell water and at a high electrolyte concentration.
3) Enzymes take an active part in the balling.
The generation of balls that are much greater than the cell itself may be related to active synthesis of new membranes for the balls or utilization of the membrane material reserve or extension and release of the existing membrane material from plasmatic membrane of the cell or intracellular vacuoles in spite of the cell gradual dying.
The 10-40-fold increase in membrane surface of the balls as compared to the cell size reflects high activity of the membrane. Long-lasting cell incubation in hypertonic solution helps to accumulate a large number of vacuoles to be used in further studies and to determine limits of synthesis or assembly of biological membranes by individual cells in the process of their physiological death.
5. Насонов Д. H., Александров В. Я. Реакция живого вещества на внешние воздействия. — М.— JL, 1940.
6. Филъченков А. А., Стойка Р. С. Апоптоз и рак. — Киев, 1999.
7. Albrecht-Buehler G. //Biology. — 1982. — N 1. — P. 45.
8. Bos 11, van der Mei H. C., Busscher H J. //Biophys. Chem. — 1998.-Vol. 74.-P. 251.
9. Cunningham С. C. //J. Cell Biol. - 1995. - Уо1Л29, N 6. - P.
1589.
10. Golovanov M. //Electrophoresis of Cells at a Physiological Ionic Strength. In: Cell Electrophoresis /Bauer J. (ed.). Boca Raton, 1994.
11. Golovanov М. V., Derjaguin В. V. //Bull. Exper. Biol. (Russian). — 1992. - N 8. - P. 210.
12. Ito Т., Zaner K. S., Stossel T. R. //Biophys. J. - 1987. - Vol. 51. - P. 745.
13. Kushner L. J. Microbial life in extreme environments /University of Ottawa, Akademic Press. — London — New York — San Francisco, 1978.
14. Policard A. //Ijh Surface cellulaire et son mikroenvironment Masson et C. /Editeurs. — Paris, 1972.
Поступила 10.09.01 / Submitted 10.09.01
