CC BY
75
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ EXPERIMENTAL ИССЛЕДОВАНИЯ INVESTIGATIONS
О М. В. Голованов, 1999 УДК 511.18:577.1
М. В. Голованов
АНАЛИЗ ЭЛЕКТРОСТАТИЧЕСКОГО ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК С ТОЧКИ ЗРЕНИЯ БИОФИЗИЧЕСКОЙ ТЕОРИИ ЭЛЕКТРОФОРЕЗА
НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей
Биофизическая теория электрофореза живых клеток объясняет формирование поверхностного электрического заряда плазматической мембраны клетки, в основном опираясь на активную направленную деятельность самой клетки и внешнего примембранного слоя — гликокаликса — наряду со спонтанной диссоциацией и адсорбцией ионов около поверхности клетки [10—13].
Принимая во внимание многочисленные данные по исследованию электрофоретической подвижности различных клеток, мы полагаем, что величина электрического заряда клеточной мембраны соответствующих клеток ткани, органа, организма является постоянной и ее можно соотнести с другими постоянными физиологическими параметрами организма: температурой тела, pH периферической крови, скоростью сокращения сердечной мышцы, дыханием легких, перистальтическим движением кишечника и др. [14].
В соответствии с законом постоянной скорости метаболизма клетки, обусловленного генетически, относительное постоянство величины электрического заряда мембраны клетки позволяет сохранять структуру и функцию соответствующей ткани, органа, соответствующего вида организма, то есть постоянный Z-пoтeнциaл является видовой, генетически обусловленной электрической характеристикой клетки.
Участвуя в сохранении постоянной величины электрического заряда на поверхности плазматической мембраны клетки, гликокаликс вследствие своих свойств и свойств молекул межклеточной среды (явления тиксотропии, поляризации и др.) определяет физиологическое (нормальное или патологическое) состояние ткани и организма в целом.
Изменение величины 2-потенциала при воздействии на клетку различными факторами (лекарства, метаболиты, иммунологические агенты, вирусы, микроорганизмы и др.)
M. V.Golovanov
ANALYSIS OF TUMOR CELL ELECTROSTATIC INTERACTION IN TERMS OF THE BIOPHYSICAL THEORY OF ELECTROPHORESIS
Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors
The biophysical theory of living cell electrophoresis treats generation of electric charge on cell plasmic membranes mainly in terms of purposeful activity of the cell itself and its premembrane layer, glycocalyx, together with spontaneous ion dissociation and adsorption near cell surface [10-13].
The vast information on electrophoretic mobility of various cells suggests that magnitude of the cell membrane charge in a tissue, organ or organism is a constant value which may be taken into account together with other physiological parameters of the body such as temperature, peripheral blood pH, myocardial contractility, lung respiration rate, intestinal motility etc. [14].
In accordance with the law of genetically determined constant rate of cell metabolism the relative stability of cell membrane electric charge values assures structural and functional stability of tissues, organs or organisms, i.e. the constant Z-potential is a species-specific, genetically determined electric characteristic of the cell.
The glycocalyx determines physiological (normal or pathogenic) status of a tissue or an organism as a whole through maintaining stability of the electric charge magnitude.
Changes in the Z-potential under the effect of various factors (drugs, metabolites, immunological agents, viruses, microorganisms etc.) result from cell response to this effect, in particular, variation in biochemical reactions of cell metabolites.
Distance between cells with like negative electric charges (Coulomb’s law) is regulated by the cells depending upon various characteristics of the glycocalyx and intercellular medium, first of all upon their dielectric properties, i.e. the cells regulate their relationship via the glycocalyx.
The purpose of this study was to analyze electrostatic interaction of tumor cells in terms of the biophysical theory of electrophoresis.
определяется реакцией самой клетки на эти факторы, в частности изменением характера биохимических реакций клеточных метаболитов.
Регулирование расстояния при электростатическом взаимодействии между одноименно отрицательно заряженными клетками ткани (закон Кулона) определяется клетками с помощью физических характеристик гликокаликса и составляющих молекул межклеточной среды, к которым в первую очередь относятся их диэлектрические свойства, то есть клетки с помощью гликокаликса регулируют свое взаимодействие друг с другом.
Целью данной работы является анализ электростатического взаимодействия опухолевых клеток с точки зрения биофизической теории электрофореза.
Материалы и методы. В работе была использована кровь больного с диагнозом хронического лимфолейкоза.
Периодические структуры лсйксмичсских клеток получали следующим образом: к одной капле крови добавляли 5 капель 15% раствора 1МаС1, все перемешивали и каплю смеси помещали под покровное стекло, края которого были смазаны вазелином для предохранения препарата от высыхания. Затем наблюдали в световой микроскоп фирмы «ЬсИг» (Германия) за характером образования периодических структур лсйксмичсских клеток.
Результаты и обсуждение. Электрические характеристики взаимодействующих клеток: двойной электрический, селективный и диффузный слои. Согласно биофизической теории электрофореза живых клеток, постоянный электрический заряд поверхности плазматической мембраны клетки определяется генетическими особенностями ее метаболизма.
Двойной электрический слой (ДЭС) определяется спонтанными процессами диссоциации, адсорбции ионов в межклеточной среде, направленным обменом веществ клетки, функциональными особенностями селективного слоя (гликокаликса) и свойствами диффузного слоя.
Величина ДЭС зависит от качественного и количественного состава адсорбционного слоя, слоя противоионов, определяемых метаболизмом клетки [2, 3, 5, 11].
Гликокаликс, выполняя роль катионообменника, образует селективный слой, который тоже участвует в формировании двойного электрического и диффузного слоев.
Гликокаликс представляет собой плотную сетку из полимеров, подобно гиалуроновой кислоте, и не пропускает к поверхности клетки не только мелкие клетки, такие, как лейкоциты, эритроциты (5—10 мкм), шарики полистирола (1—2 мкм), но и частицы туши размером от 1 мкм и меньше (рис. 1) [1, 4, 7].
Гликокаликс контактирует с межклеточной средой, которая является электрически активной и участвует во взаимодействии одноименно заряженных живых клеток при формировании периодических структур и колоний (рис. 2).
По физическим свойствам межклеточная среда, как и гликокаликс, может относиться к диэлектрикам, то есть веществам, основным электрическим свойством которых является способность к поляризации и в которых возможно существование электростатического поля. Такое поле может длительно сохраняться лишь в средах, плохо проводящих электрический ток.
Анализ электростатического взаимодействия лейкеми-ческих клеток в периодической структуре. Силу взаимодействия двух зарядов теоретически определяют по закону (уравнению) Кулона:
Рис. 1. Структура компонентов гликокаликса, полученная с помощью электронного сканирующиего микроскопа.
х 5000
Fig.1. Glycocalyx structure. Electron scanning microscope.
Magn.5000.
Materials and Methods. The study was performed in blood specimens from patients with chronic lymphatic leukemia.
Blood spccimcns to study leukemic ccll periodic structures were prepared as follows: 5 drops of 15% NaCI solution were added to a drop of blood, a drop of the resultant mixture was transferred under a cover glass with vaselincd edges to prevent specimen drying. The spccimcns were studied by light microscopy using a Lcitz (Germany) microscopc.
Results and Discussion. Electrostatic Characteristics of Interacting Cells: Double Electric, Selective and Diffuse Layers. According to the biophysical theory of living cells the constant electric charge on cell plasmic membranes is determined by genetic peculiarities of cell metabolism.
The double electric layer (DEL) is generated due to and depends upon spontaneous processes of ion dissociation and adsorption in intercellular medium, cell metabolism, functional peculiarities of the selective (glycocalyx) and diffuse layers.
The DEL size depends upon qualitative and quantitative composition of an adsorptive and an antiion layers which in turn depend upon cell metabolism [2,3,5,11].
The glycocalyx acts as a cation-exchanger to generate a selective layer which also contributes to the generation of the double electric and diffuse layers.
The glycocalyx is a dense net of polymers (e.g. hyaluronic acid) that prevents access to the cell surface of small cells such as leukocytes, erythrocytes (5 to 10 mcm), polystyrene beads (1 to 2 mcm) and even ink particles of 1 mcm or less in size (fig.l) [1,4,7].
The glycocalyx is in contact with electrically active intercellular medium and contributes to arrangement of periodic structures and colonies by like-charge living cells (fig.2).
Both the glycocalyx and the intercellular medium are dielectrics, i.e. substances able to undergo polarization and to generate electrostatic field. This field may be maintained for a long time only in poor electric conductors.
Analysis of Electrostatic Interaction of Leukemic Cells in Periodic Structures. Interaction of two charges is calculated by the Coulomb equation:
Experimental Investigations
Рис. 2. Периодические структуры лейкемических клеток. Темный фон — частицы туши, х 100 (а) и 300 (Ь). Fig.2. Periodical structures in leukemic cells. Dark background is ink particles. Magn. 100 (a) and 300 (b).
Р = ЧI ' <72 / Ео ' 8 '
где /"— сила взаимодействия двух заряженных клеток, с[\, д2 — величина электростатического заряда на поверхности клетки, г — расстояние между заряженными клетками, е — диэлектрическая проницаемость межклеточной среды, е0 — электрическая постоянная.
При этом представленные в уравнении параметры оцениваются следующим образом:
Ч\ = 41 = 16,8 мВ (см. таблицу), гтах = 30 000 нм, г)Ш), = 10 нм, £0 = 8,85 ■ 10 ~12 Ф/м, е — неизвестна.
Электропроводность межклеточной среды, то есть способность проводить электрический ток, обусловлена наличием в среде свободных носителей заряда — электрически заряженных частиц, которые под действием внешнего электрического поля, создаваемого клеткой или электродом, направленно перемещаются сквозь толщу межклеточной среды (или среды инкубации), создавая ток проводимости.
Носителями заряда в биологических диэлектриках могут быть ионы, электроны, молионы (заряженные коллоидные частицы) и полиионы (полипептиды, полисахариды, нуклеиновые кислоты и др.).
Идеальный диэлектрик не содержит свободных носителей и потому не способен проводить электрический ток: у него сопротивление бесконечно велико. У реальных диэлектриков удельное объемное электрическое сопротивление р равно от 10 7 до 10 18 Ом/м [6, 7].
По физическому смыслу диэлектрическая проницаемость — это количественная мера интенсивности процесса поляризации диэлектриков. Поляризуемость частицы зависит от мехнизма поляризации, определяемого природой диэлектрика. Основным видом поляризации в биологической системе является дипольная.
Сущность дипольной поляризации состоит в повороте (ориентации) жестких диполей (молекул воды, биополимеров гликокаликса и межклеточной среды) в направлении электрического поля. Дипольная поляризация относится
Таблица Table
Величина Z-потенциала эритроцитов различных видов млекопитающих [9]
Erythrocyte Z-potential in different mammalians [9].
Вид млекопитающих Z-потенциал, mB
Кролик/Rabbit 7,0
Свинья/Pig 12,5
Морская свинкэ/Guinea pig 14,2
Человек/Man 16,8
Обезьяна резус/Rhesus monkey 17,0
Кошкэ/Cat 17,8
Крысэ/Rat 18,6
Собака/Dog 21,1
Mammalian species Z-potential, mV
F = qx ■ q2 / £0 ■ e ■ r\
where F is the force of interaction of two charged particles, q 1 and q2 are the magnitudes of electric charges on cell surface, r is the distance between the charged particles, (is the dielectric permeability of the intercellular medium, (c is the electric constant.
The equation parameters have the following values: ch= ch = 16.8 mV (see the table), rmax = 30,000 nm, rmin = 10 nm, Eq = 8.85 ■ 10 ~12 F/m, e value is unknown.
The intercellular medium demonstrates electric conductivity, i.e. ability to conduct electric current, due to the presence of free charge carriers which move through the medium in a certain direction under the effect of external electric field thus producing electric current.
Ions, electrons, molions (charged colloid particles) and polyions (polypeptides, polysaccharides, nucleic acids etc.) may act as charge carriers in biological dielectrics.
к замедленным (релаксационным) видам поляризации. Для ее завершения требуется время от 10 2 до 10 с [8].
Экспериментальные исследования по определению скорости появления гликокаликса при воздействии на клетку электролитом высокой концентрации показали, что гель-гликокаликс набухает за 4 с размером до 15 мкм, то есть за
3 • 10 ~2 с набухает 170 нм компонентов гликокаликса (гиа-луроновой кислоты и др.). Величина гликокаликса в покое определяется толщиной 80 нм [4].
Основным вопросом в определении принадлежности элементов межклеточной среды к диэлектрикам является поляризация компонентов гликокаликса и межклеточной среды (рис. 3).
Живой организм постоянно находится в движении (даже в случае полного покоя работают такие автономные системы, как сердце, имеют место перистальтика кишечника, гибель, разрушение старых клеток и деление новых клеток в тканях и другие процессы движения), и это создает условия для изменения размеров диполей и характера их взаимодействия (структурообразование). Следствием этого исследования будет информация о диэлектрических свойствах гликокаликса и межклеточной среды, участвующих во взаимодействии клеток друг с другом в ткани.
Работа выполнена при активном участии проф. J. Bauer, Institut Max-Planck f. biochemia, Martinsried, Germany.
ЛИТЕРАТУРА /REFERENCES
1. Голованов М. В., Дерягин Б. В. //Докл. АН СССР. — 1983. —
Т. 272, № 2. — С. 479—480.
2. Голованов М. В. //Биофизика. — 1991. — Т. 36, № 3. — С.
463—466.
3. Голованов М. В. //Коллоид, жури. -- 1991. — Т. 53, № 3. —
С. 449—452.
4. Голованов М. В., Дерягин Б. В. //Бгол. экспер. биол. —
1992. —№ 8. — С. 210—211.
5. Голованов М. В. //Биофизика. — 1995. — Т. 40, вып. 2. — С. 372—376.
6. Пасынский А. Г. Биофизическая химия. — М., 1963.
7. Тару сов В. Н. Основы биофизики и биофизической химии. -М., 1960.
8. Физические величины: Справочник /Под ред. И. С. Григорьева, Е. 3. Мейлихова. — М., 1991.
9. Abramson Н. А. /Я. exp. Med. — 1928. — N 47. — Р. 677.
10. Bauer J. The negative surface charge density of cells and their actual state of differentiation or activation, in Cell Electrophoresis /Ed. J. Bauer. — Boca Raton, 1994. — P. 267—280.
11. Bauer J., Golovanov М. V. //Biophysics.— 1996. — Vol. 41, N 3. — P. 788.
12. Golovanov М. V. Electrophoresis of cells at a physiologic high ionic strenght, in Cell Electrophoresis /Ed. J. Bauer. — Boca Raton, 1994.— P. 181—198.
13. Golovanov М. V., Bauer .J. //Herald of the Cancer Research Center of AMS of Russia. — 1997. — N 3. — P. 19—24.
14. Slivinsky G. G., Hymer W. C., Bauer J., Morrison L. R. //Electrophoresis. — 1997. — Vol. 18. — P. 1109—1119.
Поступила 16.01.98 / Submitted 16.01.98
Мембрана Межкле- Мембрана
клетки Гликокаликс точная среда Гликокаликс клетки
membrane 15 тст medium 15тст membrane
0.1 тст 2 тст 0.1 тст
Рис. 3. Схема изменения структуры гликокаликса и межклеточной среды (поляризация) в среде с высокой ионной силой.
Fig.3. Changes in the glycocalyx and intercellular medium structure (polarization) in a medium with high ionic intensity.
The ideal dielectric has no free carriers and cannot therefore conduct electric current, its resistance is infinitely high. Real dielectrics have specific electric resistance p = 107 to 101S Ohm/m [6,7].
The dielectric conductivity is in physical terms a quantitative measure of dielectric polarization intensity. Polarizability of a particle depends upon polarization mechanism which in turn depends upon nature of the dielectric in question. Dipole polarization is the main polarization type in biological systems.
The dipole polarization is orientation of dipoles (water molecules, glycocalyx and intercellular medium biopolymers) in the electric field direction . The dipole polarization belongs to the relaxation polarization type and takes about 10 2 to 10 1,1 s [8].
As found experimentally high-concentration electrolytic effect on cells results in glycocalyx swelling up to 15 mcm for
4 s, i.e. a 170 nm glycocalyx (hyaluronic acid etc.) increment is produced for 3 ■ 10 2 s. Rest glycocalyx thickness is 80 nm [4].
The question whether an element of intercellular medium is a dielectric or not is answered depending upon polarization of the glycocalyx and intercellular medium elements (fig.3).
The live body is characterized by continuous movement (activities and processes such as heart beating, intestinal motility, destruction of old and generation of new cells proceed even at rest) therefore changes in the dipole size and interactions (formation of structures) may be analyzed to have information about dielectric properties of the glycocalyx and intercellular medium participating in cell interactions. Acknowledgment. The author gratefully acknowledges the contribution of Professor J.Bauer, Institut Max-Plank, F.Biochemia, Martinsried, Germany, to this study.
