Биофизическая структура внешнего слоя плазматической мембраны опухолевых клеток (гликокаликса) Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ

М. В. Голованов БИОФИЗИЧЕСКАЯ СТРУКТУРА ВНЕШНЕГО СЛОЯ ПЛАЗМАТИЧЕСКОЙ МЕМБРАНЫ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК (ГЛИКОКАЛИКСА)

НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ГУ РОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН, Москва

В статье рассматривается структура внешнего слоя плазматической мембраны клетки (гликока-ликса), состоящей из гликозаминогликанов. Экспериментально обнаружено, что в концентрированном растворе электролита — 15% (2,6 М) растворе хлорида натрия — в течение 2 с гликокаликс набухает или увеличивается в размере с 4 до 20 000 нм. Набухший гликокаликс имеет периодическую сетчатую структуру с периодом в 100 —150 нм. Первичной единицей набухшего гликокаликса является квант гликокаликса, или образование шарообразной формы размером примерно 100 нм. Вне концентрированного раствора электролита размер кванта гликокаликса не превышает 10 нм.

Ключевые слова: опухолевая клетка, плазматическая мембрана, гликокаликс, квант гликокаликса.

Внешний слой плазматической мембраны, или гликока-ликс, состоит в основном из гликозаминогликанов, в состав которых входит гиалуроновая кислота [1; 3—5]. Известно, что внешний примембранный слой принимает активное участие почти во всех внеклеточных реакциях (в том числе иммунологических) от контакта клетки с внешним агентом до формирования электрического заряда на поверхности плазматической мембраны (физико-химические реакции) [3].

При взаимодействии клетки с концентрированным раствором электролита, например 15% (2,6 М) раствором хлорида натрия, гликокаликс набухает до 20 000 нм. Исходный размер гликокаликса составляет около 4 нм [4].

В настоящее время структуре гликокаликса уделяется большое внимание, поскольку он активно участвует в патогенезе атеросклероза и иммунодефицитов, а также в метастазировании злокачественных опухолей [6]. Предполагается, что различные рецепторы опухолевых клеток, находящиеся в составе внешнего примембранного слоя клетки, состоят из квантов гликокаликса.

Целью данного исследования является описание биофизической структуры гликокаликса.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Внешний примембранный слой, или гликокаликс, опухолевых клеток выявляли следующим образом. Десять капель 15% раствора хлорида натрия с тушью добавляли к одной капле суспензии опухолевых клеток (саркома М-1 крыс). Суспензию опухолевых клеток

© Голованов М. В., 2006 УДК 616-006-09:612.014.4

получали с помощью пипетирования кусочка опухолевой ткани, полученного от животного. Затем одну каплю смеси опухолевых клеток и раствора электролита с тушью помещали на поверхность предметного стекла и готовили мазок, который фиксировали и окрашивали по методу Романовского. Через 30 мин после окрашивания краситель отмывали дистиллированной водой. Затем препарат высушивали при комнатной температуре. Структуру гликокаликса изучали с помощью светового микроскопа (х100—400) («Ье^», Германия).

Параллельно с этим на окрашенный по Романовскому мазок напыляли золото и исследовали препарат в сканирующем электронном микроскопе «Р8-501» («РЫШрв», Голландия) по методу Ю. А. Ровенского [2].

Сетчатую структуру внешнего примембранного слоя клетки (водный раствор лиофилизированного порошка гликокаликса) исследовали на стекле с помощью атомного силового микроскопа («ЛРК», Германия).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

После добавления в клеточную суспензию раствора электролита высокой концентрации (15% раствор хлорида натрия) и частиц туши в течение 2—10 с вокруг некоторых опухолевых клеток образуется ореол геля диаметром до 30 мкм. Это происходит в результате набухания гликозаминогликанов — полимеров, находящихся на поверхности внешнего примембранного слоя клеток, т. е. в гликокаликсе. При этом гликокаликс активируется и занимает максимальный объем, возможный для данной клетки (до 20 000 нм). Скорость набухания геля гликокаликса составляет около 2000 нм/с (рис. 1).

Набухание гликокаликса при добавлении концентрированного раствора электролита обратимо. После снижения концентрации электролита до изотонической (О,9% раствор хлорида натрия) набухший до 2О ООО нм гликокаликс принимает естественный размер, соответствующий примерно 1О нм. Приблизительно таков размер кванта гликокаликса в нормальных условиях.

Гель гликокаликса имеет шарообразную форму и выглядит как симметричный или асимметричный (в зависимости от строения опухолевой клетки) ореол. Гель гликокаликса представляет собой густую сеть полимеров, состоящую из шариков разного диаметра. Она мешает частицам туши, размер которых не превышает 1 мкм, приблизиться к поверхности плазматической мембраны клетки. Частицы туши постоянно находятся в броуновском движении и не имеют стабильной упорядоченной структуры.

Следует отметить основное свойство гликокалик-са — сильно набухать (увеличиваться в размере) при контакте с концентрированными растворами электролитов. При этом размер гликокаликса может достигать 2О ООО нм (максимальная стрессовая реакция клеток при добавлении концентрированного раствора электролита). Следовательно, молекулы гликокаликса имеют большое количество ионогенных групп, способных взаимодействовать с большим числом (примерно 1О6—1О7) катионов и анионов. Трансмембранные ионные токи обусловлены метаболизмом клеток, возникают также при обработке клеток растворами электролитов. Очевидно, что при взаимодействии с электролитами молекулы гликозаминогликанов из сжатого состояния развертываются в сетчатую структуру.

Гликокаликс большинства опухолевых клеток располагается на поверхности плазматической мембраны нерегулярно. При максимальном увеличении светового микро-

Рис. 1. Гликокаликс опухолевых клеток (световая микроскопия, х200). На фотографиях гликокаликс выглядит белым, темный фон — это частицы туши.

скопа можно отметить, что гликокаликс состоит из мелких шарообразных гранул, так называемых «единиц» или «квантов», размером 5О—1ОО нм (рис. 2). Набухший в растворе электролита гликокаликс имеет сетчатую структуру с периодом 1ОО—15О нм и высотой 1О—15 нм. Диаметр узлов решетки составляет приблизительно 1О нм (рис. 3).

Предполагается, что разнообразные рецепторы опухолевых клеток, находящиеся в составе гликокаликса, состоят из его квантов и входят в его состав в качестве структурных элементов.

Рис. 2. Кванты гликокаликса (сканирующая электронная микроскопия, х1500). Отдельные кванты показаны стрелками. Их размер до 100 нм.

Рисунок 3. Сетчатая периодическая структура гликокаликса опухолевой клетки (атомная силовая микроскопия, х5000).

В заключение следует отметить важность исследований структуры гликокаликса. Именно он играет ключевую роль в метастазировании, формировании атеросклеротических бляшек и развитии иммунодефицитов.

Выражаю искреннюю благодарность сотрудникам нашего центра Д. Ю. Блохину, А. И. Севастьянову и Е. Ю. Филиновой за практическую и теоретическую помощь в проведении данного исследования.

ЛИТЕРАТУРА

1. Голованов M. В., Бауэр Дж. К проблеме биофизической теории электрофореза живых клеток //Вестн. ОНЦ им. Н. Н. Блохина РАМН. — 1997. — №3. — С. 19—24.

2. Ровенский Ю. А. Растровая электронная микроскопия нормальных и опухолевых клеток. — М.: Медицина, 1979. — 151 с.

3. Bauer J. The negative surface charge density of cells and their actual state of differeftiation or activation // Bauer J. (ed.). Cell Electrophoresis. — Boca Raton: CRC-Press, 1994. — P. 267—282.

4. BauerJ., GolovanovM. V. Some Aspects of the Biophysical Theory of Electrophoresis of the Living Cells // Biophysics. — 1996. — Vol. 41, N3.—P. 788—794.

5. GolovanovM. V. Electrophoresis of cells at a high phisiologic ionic strength // Bauer J. (ed.). Cell Electrophoresis. — Boca Raton: CRC-Press, 1994. — P. 181 — 198.

6. Squire J. M., Chew M., Michel C. et al. Quasi-Periodic Substructure in the Microvessel Endothelial Glycocalyx: A Possible Explanation for Molecular Filtering// J. Struct. Biol. — 2001. — Vol. 136. — P. 239—255.

Поступила 10.11.2004

M. V. Golovanov BIOPHYSICAL STRUCTURE OF UPPER LAYER OF TUMOR CELL PLASMATIC MEMBRANE (GLYCOCALYX)

Institute of Experimental Diagnosis and Therapy of Tumors, N. N. Blokhin RCRC, RAMS, Moscow

The paper describes structure of tumor cell plasmatic membrane upper layer (glycocalix) consisting of glycosaminoglycans. As discovered experimentally, glycocalyx swells or expands from 4 to 20,000 nm at 2 s in concentrated electrolyte (15% [2.6 M] sodium chloride) solution. The swollen glycocalyx has a periodical net structure with a period of 100—150 nm. A quant of glycocalyx or a spheroid of about 100 nm in size is the primary unit of the swollen glycocalyx. Outside the concentrated electrolyte solution a quant of glycocalyx is not more than 10 nm.

Key words: tumor cell, plasmatic membrane, glycocalyx, glycocalyx quant.