CC BY
25
УДК 616.932
Е.В.Монахова, Ю.М.Ломов, Н.К.Михась, Р.В.Писанов СТРУКТУРА И ИЗМЕНЧИВОСТЬ НЕПОЛНОГО СТХ-ЭЛЕМЕНТА ХОЛЕРНЫХ ВИБРИОНОВ
Ростовский-на-Дону научно-исследовательский противочумный институт
С помощью ПЦР исследован генный состав неполных СТХ-элементов, интегрированных в геном 22 штаммов холерных вибрионов О1 и не О1/не О139 групп, выделенных от больных и из внешней среды на различных территориях бывшего СССР. Показано, что все они являются производными предшественника СТХф (pre-СТХф), содержащими полный набор генов, необходимых для фагопродукции (cep, orfU, ace, zot), и элемент RS2. Профаг RS^ присутствовал только у двух штаммов, один из которых стабильно образовал его репликативную форму наряду с таковой pre-СТХф. Изменчивость наблюдалась в основном в области RS-элементов. Полученные данные позволяют предполагать, что, по крайней мере, половина исследованных штаммов потенциально способна к образованию инфекционных вирионов и горизонтальной передаче генетических детерминант дополнительных факторов вирулентности «традиционным» (за счет инфекции pre-СТХф), либо «нетрадиционным» (посредством неспецифической трансдукции) способом.
Ключевые слова: холерный вибрион, pre-СТХф, ПЦР, генотип.
соответственно, остальные - сконструированы нами в рамках данного исследования с помощью программы Vector NTI Suit 9 (www.informax.com).
Выделение плазмид и перенос электрофорети-чески разделенной ДНК по Саузерну осуществляли, как описано в [2], блот-гибридизацию - с использованием DNA Labling and Detection Kit Nonradioactive (Boehringer) согласно рекомендациям изготовителя. В качестве контроля использовали ДНК плазмиды рСТ105 [1], содержащей гены orfU, ace, zot, ctxAB и RS1-элемент. Молекулярными зондами служили ПЦР-фрагменты: zot (внутренняя часть гена, 904 п.н.), rstA (1009 п.н.) и rstC (224 п.н.).
Результаты и обсуждение
Исследование на наличие всех генов неполного СТХ-элемента было необходимо для ответа на вопрос о том, содержат ли данные штаммы полные профаги - производные pre-СТХф или всего лишь «остатки» от делеции части генов СТХф. Поэтому при ПЦР-анализе мы использовали не только пары праймеров, позволяющие амплифицировать последовательности каждого отдельного гена, но и их сочетания, как представлено в табл.2.
У всех без исключения штаммов выявлен сайт интеграции СТХ-элемента attRS1, а также гены коровой области cep, orfU и ace. Что касается гена zot, то при использовании праймеров на внутреннюю часть этого гена (zotD-F+zotD-R) все штаммы дали положительные результаты. Однако, как известно из литературных данных, 3’-конец гена zot в составе pre-СТХф вариабелен и отличается от такового в составе полноценного СТХф. В связи с этим высказано предположение о том, что 3’-конец zot pre-СТХф изначально отличался от 3’-конца СТХф, который был приобретен на более поздних этапах эволюции вместе с генами ctxAB и активаторами их транскрипции [8]. Поэтому мы дополнительно исследовали эти штаммы в ПЦР с праймерами для детекции zot, позволяющими амплифицировать полный ген с прилегающими к нему последовательностями. При этом прямой праймер zot197F узнавал
Неполный СТХ-элемент впервые обнаружен Boyd et al. в 2000 г. [8] в составе генома трех ctxAB” orfU ace+zot-штаммов холерных вибрионов О1, О11 и О37 серогрупп. Установлено, что «усеченные» профаги способны к образованию репликативной формы (РФ) и инфекционных фаговых частиц и представляют собой производные предполагаемого предшественника СТХф (pre-СТХф). Впоследствии в GenBank был представлен неполный СТХ-элемент одного штамма V. cholerae О139 (AF302794).
Ранее нами также выявлена группа аналогичных штаммов, выделенных в Узбекистане, России и Крыму от больных и из объектов внешней среды [4], и исследован их геномный полиморфизм с помощью блот-гибридизации рестриктов ДНК с зондами Us (гены orfU, zot, асе и первые 87 п.н. СхА) и RS (гены rstR, rstA, rstB) [5]. Полученные данные позволили предположить наличие у большинства штаммов двух копий pre-СТХф, расположенных либо в виде тандема, либо в разных участках генома. Однако использованные зонды включали сразу по нескольку генов, в связи с чем более подробная характеристика не представлялась возможной.
Целью настоящей работы явилось сравнительное изучение генного состава неполного СТХ-эле-мента и фланкирующих его последовательностей RS1 в составе генома 22 нехолерогенных штаммов V. cholerae O1 и не Ol/не О139 с помощью полимеразной цепной реакции.
Материалы и методы
Объектами исследования служили 14 штаммов холерных вибрионов О1 группы и 8 штаммов не О1/не О139, выделенные на территориях бывшего СССР (табл. 1).
Амплификацию последовательностей генов СТХ- и RS1 -элементов проводили с использованием специфических праймеров, синтезированных ООО «СибЭнзим» (Новосибирск) на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технология», Москва). Праймеры для детекции attRS, асе, zot, rstA, rstC имели последовательности, приведенные в работах [6, 7, 9, 12]
Таблица 1
с1хАБ-и8+К8+-штаммы холерных вибрионов, использованные в настоящем исследовании
Штамм |Серогруппа| Место выделения | Время выделения | Источник выделения
Р-9961 О1 Москва 08.1977 Речная вода
Р-12115 Ростов-на-Дону 07.1982 Вода р. Дон
Р-13169 Ростов-на-Дону 07.1987 Вода р. Дон
15500 Крым, ПГТ Красноперекопск 08.1991 Сточные воды (после очистки)
13767 Узбекистан, Купырский р-н Хорезмской обл. 08.1988 Больной, 28 лет, с диагнозом «острый гастроэнтерит»
14959 " Узбекистан, г. Катта-Курган Самаркандской обл 07.1990 Носительница, 19 лет
14960 Больная, 23 г., с диагнозом «острый гастроэнтерит»
14961 Больной, 2 г., с диагнозом «ОКИ»
14962 Больная, 6 мес., с диагнозом «ОКИ»
14963 "
14964 Больная, 1 г. 3 мес., с диагнозом «ОКИ»
14965 Больная, 18 лет, с диагнозом «острый энтероколит»
14966 Больная, 11 мес., с диагнозом «ОКИ»
14967 Больная, 4 мес., с диагнозом «ОКИ»
17449 О13 1987 Человек
18359 О13 1988
18360 О13 "
18361 О13 "
18362 нт 1987
18363 нт "
Р-17751 О8 Ростов-на-Дону 05.1981 Больной ОКИ
965 нт Гудермес 1995 Вода
последовательность на 20 п.н. «выше» старт-кодона гена 201;, 2о1РЯМ-Р - последовательность внутри гена асе, включающую промотор 201, а обратный праймер 2оИ97Я - последовательность «ниже» искомого гена, в операторной области с1хА. Прямой праймер 2011 начинался со старт-кодона 201, а обратный ео12 заканчивался его стоп-кодоном. Действительно, ни у одного из штаммов не были ампли-фицированы последовательности ДНК ео1197Р-ео1197К 2о1Б-Р-2о1197К 2о1РКМ-Р-ео1197-Я, ео11-
Результаты ПЦР-анализа
Таблица 2
Праймеры Длина Генотипы
прямой обрат- ный амплифи-ката, п.н. 1 2 3 4 5 6
а1Ж5-Р а1ЖЗ-К 206 + + + + + +
геЖ-Р геЖ-Я 311 + - + - - -
ША-Р ^1А-Я 1009 + + + + + -
ШВ-Р ге1В-Я 231 + + + + + -
^1С-Р ^Ю-Я 224 + + - - - -
а1Ж5-Р геЖ- Я 900 + - + - + -
геЖ-Р ге1А-Я 1546 + + + + - -
ША-Р ге1В-Я 1364 + + + + + -
ШВ-Р ^Ю-Я 585 + + - - - -
сер-Р сер-Я 211 + + + + + +
огЮ-Р oгfU-R 469 + + + + + +
асе-Р асе-Я 299 + + + + + +
2оШ-Р 20Ш-Я 904 + + + + + +
2о1197 РЯМ 2оШ-Р 2о1197Я 1327 1420 1304
2о1197 РЯМ 2011 20Ш-Я 927 1020 907 + + + + + +
2011 2о12 1200 - - - - - -
а1Ж5-Р сер-Я 2908 + + + + + +
Вероятность фагопродукции + ± - + - ±
Штаммы, имеющие этот генотип Р-9961 965 Р-13169 15500 13767 Р-17751 14959- 14967 17449 Р-12115 18359 18360 18361 18362 18363
2012, ео1Б-Р- ео12, но у всех образовались фрагменты 2о1197Р-2о1Б-Я и 2о1РКМ-Р-ео1Б-Я. Эти данные свидетельствуют о консервативности 5’-конца гена и об отсутствии в конце профага последовательностей, гомологичных таковым полноценного СТХ-элемента, что характерно для рге-СТХф [8].
Таким образом, исследуемые штаммы имели полный набор интактных генов коровой области СТХ-элемента, необходимых для образования фаговых частиц, что свидетельствовало в пользу действительного присутствия в их геноме рге-СТХф. У большинства из них (20 из 22) также выявлены гены ге1А и ге1В, характерные как для входящего в состав профага элемента Я52, так и для фага Я81ф. Что касается специфичного для обоих профагов гена геЖ, то далеко не для всех штаммов получены ам-плификаты этого гена при использовании прямых праймеров геШ.-Р и а1ЖБ-Р в сочетании с обратным ге1Я-Я. Однако с праймерами Г81Я-Р+Г81А-Я у 17 из 22 штаммов образовался фрагмент с рассчитанным размером 1,5 т.п.н., что свидетельствует об изменчивости 3’-конца гена геЖ, который у многих штаммов не узнается обратным праймером. Следует отметить, что эта особенность обнаружена нами и у ряда полноценных профагов, представленных в ОепВапк, что существенно затруднило конструирование обратного праймера и не позволило создать универсальный Г81Я-Я для детекции этого гена. У трех штаммов не О1/не О139 групп, напротив, изменчивости подвергся 5’-конец гена геЖ, поскольку он узнавался обратным, но не узнавался прямым праймером. Однако полученные данные позволяют думать, что исследуемые штаммы, помимо коровой области рге-СТХф, содержат и Я82-элемент, и что профаг, возможно, интегрирован в специфический сайт а1Ж5. Исключение составляли два штамма не О1/не О139 групп (19362 и 18363), у которых с помощью ПЦР не выявлено ни одного гена Я8-элементов. Тем не менее оба гибридизовались с зондом [5]. По-видимому, эти штаммы все-таки
содержат Я82-элемент, гены которого подверглись настолько глубокой изменчивости, что перестали узнаваться всеми использованными нами праймерами. Кроме того, в специально подобранных условиях для этих и всех остальных штаммов получен ПЦР-амплификат размером 2,9 т.п.н. с праймерами аНЯБ-Р+серЯ. Этот размер соответствовал фрагменту, включающему все гены Я82-элемента и проксимальную часть гена сер.
Специфичный для 1 ген МС выявлен только у двух штаммов V. скоієтв 01 Р-9961 и
не О1/не О139 965. Все остальные, очевидно, не содержали профага Я81ф, поскольку отрицательные результаты были получены как с парой праймеров геїС-Р+геїС-Я, так и с гйВ-Р+гйС-Я. Эти штаммы различались по последовательности 3’-конца гена геїЯ, который поддавался выявлению с помощью праймеров геїЯ-Р+Я и айЯЗ+МЯ только у первого.
В процессе выделения и электрофоретического анализа тотальной ДНК штамма Р-9961 замечено, что в полученных препаратах, наряду с хромосомной, присутствовала плазмидная ДНК, количество которой варьировало в разных пробах и было особенно заметным в препаратах из культур, выращенных при комнатной температуре. Это навело нас на мысль о том, что плазмида могла оказаться РФ рге-СТХф, либо Я81ф. Для проверки этого предположения мы выделили плазмидную ДНК и провели блот-гибридизацию. Результаты ее показаны на рисунке, из которого видно, что плазмидная ДНК штамма Р-9961 действительно содержала РФ не только рге-СТХф, но и Я81ф, поскольку одна из форм гибриди-зовалась с зондами еоі и геїА, а другая - с МА и геїС. Способность штамма к образованию РФ можно рассматривать как подтверждение наличия в геноме тандема либо из двух копий профага рге-
3 о н д ы:
г<М геїС
12 3 12 3 12 3
Щ0 ** ЩШ
СТХф, либо из одной копии рге-СТХф и прилегающего к ней Я81-элемента. Несмотря на то, что эта особенность была показана для полноценного СТХф [11], мы полагаем, что она справедлива и для неполных профагов, поскольку у них есть все гены, необходимые для вирогении, тогда как приобретенные на более поздних этапах эволюции гены с1хАВ не имеют отношения к фаговому морфогенезу.
Полученные результаты позволили выделить у исследуемых штаммов 6 генотипов (табл. 2), различающихся по составу и структуре Я8-элементов. Ранее с помощью блот-гибридизации среди 20 из них были выявлены несколько различных молекулярных типов [5], однако они не всегда соответствовали генотипам, установленным в настоящем исследовании.
1. Штамм О1 группы Р-9961, содержащий оба профага и образующий их РФ, относился к генотипу, в котором наиболее полно представлены все гены. Ранее было показано, что он характеризовался уникальным профилем гибридизации, отличным от таковых всех остальных штаммов данной группы и указывающим на возможность тандемной дупликации профага и вероятное присутствие в геноме дополнительных копий RS-элемента [5]. Все это свидетельствует в пользу его способности к активной фагопродукции, поскольку, как известно [11], каждый отдельный профаг, обеспечивающий образование вирионов, на самом деле является гибридом, состоящим из двух тандемных профагов либо из одного интактного профага и прилегающего к нему Я8-элемента второго (дистального) профага. В случае отсутствия такого тандема фагопродукция становится невозможной.
2. Штамм не О1/не О139 групп 965, не исследованный с помощью блот-гибридизации, отличался от Р-9961 только по последовательности 3’-конца гена геШ..
3. Штаммы р-13169, 15500, 13767, Р-17751, имеющие один и тот же генотип, относились к совершенно различным молекулярным типам. При этом первый из них, очевидно, содержал только одну копию рге-СТХф, а три остальных, по всей вероятности, по две копии, расположенные в разных участках генома. Это обстоятельство вместе с отсутствием у них профага Я81ф позволяет думать, что они вряд ли способны к образованию инфекционных фаговых частиц. С другой стороны, результаты блот-гибридизации штамма 13767 с зондами Ш и были неоднозначны и предполагали альтернативный вариант - присутствие тандема из двух копий профага. Поэтому вопрос о его способности к образованию фага требует дальнейших исследований.
4. Восемь штаммов (14959-14967) - представители одного этиологически опасного клона, вызвавшего локальную вспышку ОКЗ в Узбекистане (1999 г.), имели один тот же генотип по результатам ПЦР. Скорее всего, они содержат тандем из двух копий рге-СТХф, что указывает на вероятность фа-гопродукции. У этих штаммов ген геШ. узнавался прямым, но не обратным праймером. Таким же генотипом обладал штамм не О1/не О139 групп 17449, также выделенный в Узбекистане в 1987 г. от человека, но относящийся к другому молекулярно-
Результаты блот-гибридизации плазмидной ДНК штамма V. ско1егае, выделенной из 5-суточной агаровой культуры (1) и 18-часовой бульонной культуры (2). Контроль - плазмида рСТ105 (3)
му типу и содержащий скорее одну, чем две копии профага, хотя нельзя полностью исключить и наличия второй копии генов коровой области, но не RS2. В любом случае этот штамм вряд ли может служить источником инфекционных фаговых частиц. В эту группу вошел также водный штамм Р-12115, который еще не был исследован с помощью блот-гибридизации.
5. Штаммы не О1/не О139 групп 18359, 18360 и
18361 относятся к одному генотипу и одному молекулярному типу, содержащему единственную копию профага. Интересно, что ген rstR у них узнавался обратным, но не прямым праймером.
6. Наконец, штаммы не О1/не О139 групп
18362 и 18363 были близки по гибридизационным профилям и имели один генотип. По всей вероятности, оба штамма содержат «лишнюю» копию коро-вых генов. Результаты блот-гибридизации были такими же неоднозначными, как и результаты ПЦР-анализа, что, вероятно, связано с перестройками в области RS2-элемента.
Таким образом, потенциальной способностью к образованию РФ и вирионов pre-СТХф обладала примерно половина изученных штаммов, но эта способность нуждается в экспериментальном подтверждении. Вместе с тем следует иметь в виду, что специфическая трансдукция является основным, но не единственным способом передачи профага. Например, для полноценного СТХф была показана возможность неспецифической трансдукции его генов и даже прилегающих к ним генов RTX-кластера фагом СР-Т1, рецептором которому служит, по-видимому, О1 -антиген, с последующей интеграцией в неспецифические сайты [9], а филамен-тозный фаг VGJф, использующий для адсорбции маннозочувствительные пили (MSHA), переносит СТХф и RS^ с еще большей частотой, чем при их собственной ТСР-зависимой трансдукции, и интегрирует в тот же сайт attRS [10]. Геном фага RS^ может также упаковываться в капсид другого фила-ментозного фага, KSF-^, использующего альтернативный рецептор и способного инфицировать ТСР--штаммы [13].
В работе Boyd E.F. et al. [8] имеется указание на вероятное присутствие в геноме содержащих pre-СТХф штаммов специфического сайта интеграции attRS1. Последний обнаружен также отечественными авторами с помощью ПЦР в геноме четырех ctxAace zot -штаммов вибрионов эльтор, выделенных в Туркменистане [3] и нами в рамках данного исследования. Очевидно, pre-СТХф может интегрировать в тот же сайт, что и полноценный профаг. Вместе с тем для СТХф выявлено, по меньшей мере, три альтернативных сайта recA-зависимой интеграции [9], а недавно высказано предположение о встраивании его в сайт, подобный dif, который расположен в области терминации репликации бактериальной хромосомы [14].
Вопрос о реальной способности штаммов к горизонтальной передаче неполного СТХ-элемента требует дальнейших исследований и представляет особый интерес, поскольку продукты входящих в состав pre-СТХф генов cep (core-encoded pilin), ace (accessory cholera enterotoxin) и zot (zonula occludens toxin), помимо участия в фаговом морфогенезе, вно-
сят определенный вклад в патогенез неэпидемической холеры. Так, Cep участвует в колонизации кишечника [15]; Zot, используя рецептор своего эукариотического аналога зонулина, вызывает ослабление межклеточных плотных контактов, что обеспечивает более свободный доступ других токсинов к клеткам кишечного эпителия; Асе, благодаря своей гидрофобности, способен агрегироваться в димер, формируя структуру, сходную с ион-проницаемой порой, и вызывать секрецию жидкости клетками кишечника [7]. Поэтому штаммы холерных вибрионов, содержащие pre-СТХф, являются источником генетических детерминант дополнительных факторов вирулентности, которые могут быть переданы авирулентным штаммам «традиционным», либо «нетрадиционным» способом.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Гинцбург А.Л., Янишевский Н.В., Мотин В.Л. и др. // Мол. генет. - 1984. - № 9. - С. 12-19. - 2. Дэвис Р., Ботстайн Д., Рот Дж. Генетика бактерий. - М.: Мир, 1984. - 3. Костромитина Е.А. Молекулярно-генетические свойства штаммов холерного вибриона эльтор с различной эпидемической значимостью: Автореф. дис. ... канд. мед. наук. -Саратов, 2004. - 22 с. - 4. Монахова Е.В., Михась Н.К., Смоликова Л.М., Мишанькин Б.Н. // ЖМЭИ. - 2001. -№ 1. - С. 25-29. - 5. Монахова Е.В., Писанов Р.В., Михась Н.К. // ЖМЭИ. - 2004. - № 1. - С. 23-29. - 6. Осин А.В., Ерошенко Г.А., Лазовский Ю.В., Смирнова Н.И. // Пробл. особо опасных инф. - 2003. - Вып. 85. - С. 97-ЮЗ. - 7. Писанов Р.В. Конструирование штамма Es^richia coli, экспрессирующего ген zonula occludens toxin Vibrio chole-rae: Автореф. дис. . канд. биол. наук. - Ростов н/Д, 2004. -24 с. - 8. Boyd E.F., Heilpern A.J., Waldor M.K. // J. Bacteriol. - 2000. - Vol. 182, N 19. - P. 5530-5538. - 9. Boyd E.F., Waldor M.K. // Infect. Immun. - 1999. - Vol. 67, N 11. -P. 5898-5905. - 10. Campos J., Martínez E., Ma rrero K. et al. // J. Bacteriol. - 2003. - Vol. 185, N 24. - P. 7231-7240. -11. Davis B.M., Waldor M.K. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -2000. - Vol. 97, N 15. - P. 8572-8577. - 12. Faruque S.M., Asadulghani, Kamruzzaman M. et al. // Infect. Immun. -2002. - Vol. 70, N 1. - P. 163-170. - 13. Faruque S.M., Kamruzzaman M., Asadulghani et al. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. - 2003. - Vol. 100, N 3. - P. 1280-1285. - 14. Iida T., Makino K., Nasu H. et al. // J. Bacteriol. - 2002. - Vol. 184, N 17. - P. 4933-4935. - 15. Pearson G.D.N., Woods A., Chiang S. L., Mekalanos J.J. // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. -1993. - Vol. 90, N 8. - P. 3750-3754.
E.V.Monakhova, Yu.M.Lomov, N.K.Mikhas’, R.V.Pisanov
Structure and Variability of the Deficient CTX Element of the Cholera Vibrios
Rostov-on-Don Anti-Plague Research Institute
PCR testing was used to study the genetic composition of deficient CTX elements integrated into the genome of 22 cholera vibrio O1 and non O1/non O139 strains isolated from patients and the environments in several regions of the former USSR. All of them were shown to be derivatives of their predecessor strain, CTX9 (pre-CTX^), and to contain a complete set of genes, necessary for phage production (cep, orfU, ace, zot), as well as an RS2 element. RSI9 prophage was present in only two strains, one of these being capable of stable formation of its replicative form beside the pre-CTX9 one. Variability was observed primarily in the vicinity of RS elements. The data obtained may suggest that at least half of the strains were potentially capable of forming infective virions and could effect horizontal transfer of additional virulence factors’ genetic determinants by either the “traditional” way (at the expense of pre-CTX^ infection), or non- traditional one (through non-specific transduction).
Key words: cholera vibrio, pre-CTX^, PCR, genotype.
nocTynu^a 30.03.06.
